利用農桿菌滲入法與農桿菌注射法建立監測植體含磷狀態之系統

國立臺灣大學生物資源暨農學院園藝暨景觀學系 碩士論文

Department of Horticulture and Landscape Architecture College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

利用農桿菌滲入法與農桿菌注射法 建立監測植體含磷狀態之系統

Development of an in Planta System to Monitor Phosphorus Status by Agroinfiltration and Agroinjection

林佳螢 Jia-Ying Lin

指導教授：林淑怡 博士、羅筱鳳博士

Advisor: Shu-I Lin, Ph.D. and Hsiao-Feng Lo, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

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誌謝

此篇論文得以完成，最要感謝我的指導教授 林淑怡博士。在我碩一時，我的 專業基礎程度與其他同屆的同學相比是有落差的，上台也很沒有自信心，還記得 當時老師說：「不要和別人比，和自己比，只要今天和昨天相比有成長就是一種 進步。」之後老師總是願意花費比別人多一倍的時間教導我，非常有耐心與我討 論許多實驗相關問題，並循序漸進地引導我尋找答案，使我在碩士班求學期間收 益良多且也增加了不少自信心。然而對於我來說老師也像是家人，在季節交替之 時，老師總是不斷囑咐要多加件外套不要感冒了；在討論實驗之餘老師也總是不 吝於分享她的點心。此外碩班期間也特別感謝共同指導教授 羅筱鳳博士，羅老師 在我沒有信心之時，總是能伸出援手給予我無限的鼓勵，在進度考核時也給予我 許多寶貴的建議。感謝兩位老師這段時間的教導與包容才能成就今日的我，而在 這段求學期間無論是專業知識或是心理層面上我皆成長許多，在此我要獻上無限 的感謝與祝福。

論文初成時，感謝中央研究院農業生物科技研究中心 邱子珍博士對論文的審 閱校正，並提供我許多實驗上的寶貴建議，方能使這份論文更加嚴謹的完整，在 此致上最深的謝意。求學期間特別感謝植物科學研究所 鄭秋萍博士與研究生林露 學姊、林玉梅學姊、劉安琪學長，總是能在我實驗求助無門之時，提供我實驗操 作上的建議與幫助。感謝園藝系 許輔博士與研究生，提供我實驗上的幫助使我的 實驗能順利完成。此外也感謝園藝系 王自存博士、張育森博士與吳俊達博士與其 研究生，總是能義不容辭地供給我測量所需的儀器，使我在試驗設計之時能無後 顧之憂。

在這說長不長說短不短的研究生活，感謝我的學姊同時也是實驗室助理 蘇瑞 媛學姊，在我心情不好時或是有飢荒之時能提供我最好的幫助。感謝我的同窗好 同學 李佳穎學姊、郭美琳、張凱傑、張富翔，在課業上或是實驗上都能一同討論 並且一同分享生活的點滴，使得研究生活不孤單。感謝實驗室貼心的好學妹 陳羿

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臻與李宜庭學妹，總是能多方面地幫忙我，使我的實驗得以順利進行的同時也能 挺住數個飢餓的吃飯時間。此外也感謝 羅筱鳳博士的助理謝易甍與研究生洪志良 學長、孫偉翔學長、李香誼、姚靜樺、古壁甄、劉彥彤、魏良州、陳薇學妹、張 至緣學弟、王展麒學弟、洪瑄斐學妹，不僅在實驗上幫助我許多，在許多方面也 因為有他們的陪伴使得我碩士生涯更加精采。

特別感謝陪伴我走過數個實驗低潮的夥伴蘇志陞，在我實驗遇到瓶頸之時，

即使夜深了身體倦了，他也總是能第一時間的出現並給予我最大的鼓勵，使我能 盡快的振作精神並步入軌道。因為有他的陪伴使我的碩士生涯充滿歡笑與不平凡 的感動。

最後，我將今日的成就歸屬於我的家人，沒有他們一路的扶持，將沒有今日 的我。將此成果獻給我的母親 陳秀菊女士、阿姨 陳秀雲女士、乾媽 李秀鳳女士、

姨丈 洪福來先生、乾爸 陳國雄先生、姊姊 林姵汝，謝謝你們能讓我在沒有後顧 之憂的情況下完成碩士學業。人生是奇妙的，我從來沒想過自己會踏上這明星學 校，在臺大的日子使我產生許多新的想法、新的價值觀，我非常珍惜在這兒的每 一天、每一次的學習機會，謝謝上蒼 謝謝臺大使我的生命旅程充滿許多驚喜，也 為我的人生藍圖增添許多色彩。

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摘要

磷 (Phosphorous, P) 是植物生長發育所需必要營養元素之一，參與調控植物體 內多項生理、生化反應。本研究於菸草與番茄之營養生長期進行缺磷處理，地上 部與根部之無機磷濃度快速降低，葉綠素螢光 Fv/Fm 讀值、葉綠素相對含量與地 上部鮮重的減少較緩慢，而根部對地上部鮮重之比值則逐漸增加。再者，番茄植 株於生殖生長期遭遇缺磷逆境時，果實之無機磷濃度快速降低，進而降低果實產 量與可溶性固形物含量。以上結果說明菸草與番茄植株的營養生長以及番茄果實 最終之產量與品質皆仰賴於磷肥的充足供應。本研究進一步發現，短暫缺磷雖然 會迅速降低地上部或果實的無機磷濃度，但是若在尚未對植株地上部鮮重或果實 產量與品質造成不利影響前，迅速補充磷肥，可迅速提升地上部或果實中的無機 磷濃度，因而不會對植株地上部鮮重或果實的產量與品質造成不利影響。這說明 透過監測作物營養狀態，而適當的供給肥料將可確保作物的產量與品質。本研究 透過農桿菌滲入法和農桿菌注射法的方式，證實 GUS 報導基因在番茄 TPSI1 啟動 子的驅動下，可快速、忠實反應菸草葉片與番茄果實面臨缺磷逆境的情形，故知 農桿菌滲入法和農桿菌注射法短暫表現的系統可用以監測植體缺磷狀態。而 GUS 報導基因的表現並不受磷以外的其他營養元素缺乏所影響，說明此套農桿菌滲入 法短暫表現的系統具專一性。由於此套系統可方便、快速、準確反應植體缺磷狀 態，未來將可進一步應用於其他作物；若透過以其他適合的啟動子取代 TPSI1，此 套系統也可應用於監測其他營養元素之狀態。

關鍵詞：磷、菸草、番茄、農桿菌滲入法、農桿菌注射法

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Abstract

Phosphorous (P), one of the essential mineral nutrients for plant growth and development, is involved in the regulation of several physiological and biochemical processes in plants. In our study, it was found that, in the tobacco and tomato plants at vegetative growth stage under phosphorus deficiency treatment, the phosphate (Pi) concentration in shoot and root decreased rapidly, the chlorophyll fluorescence (Fv/Fm), chlorophyll content and shoot fresh weight decreased relatively slowly, while the root/shoot fresh weight ratio increased gradually. Furthermore, in tomato plants at reproductive growth stage under Pi starvation, the Pi concentration in fruit decreased rapidly, and then the fruit yield and total soluble solids decreased. Accordingly, it is shown that the vegetative growth of tobacco and tomato plants as well as the final yield and quality of tomato depend on whether phosphorus fertilizer is supplied sufficiently. It was further found that, while temporary phosphorus deficiency may immediately lead to the decrease of the Pi concentration in shoot or fruit, the shoot fresh weight or the fruit yield and quality may not be adversely impacted thereby so long as phosphorus fertilizer is timely supplemented to rapidly increase the Pi concentration in shoot or fruit.

This indicates that the yield and quality of crops can be ensured by monitoring the nutritional status of the crops and supplying fertilizer as appropriate. By Agroinfiltration and Agroinjection, this study demonstrated that the expression of GUS reporter gene driven by tomato TPSI1 promoter can rapidly and truly reflect the phosphorus deficiency stress in tobacco leaf and tomato fruit. This indicates that the employed Agroinfiltration/Agroinjection transient expression system is useful in monitoring the Pi status in plants. Further, the aforesaid expression of GUS reporter gene is independent of the deficiency of the mineral nutrients other than phosphorus, indicating the specificity of the employed Agroinfiltration transient expression system. Because the

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application of the aforesaid system is convenient and leads to rapid and accurate reflection of phosphorus status in plants, the aforesaid system should be applicable to other crops or to monitor other mineral nutrient status if the tomato TPSI1 promoter is replaced by other appropriate promoters.

Key words：phosphorus、tobacco、tomato、agroinfiltration、agroinjection

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內容目錄

口試委員會審定書 ... i

誌謝 ... ii

摘要 ... iii

Abstract ... vi

內容目錄 ... vii

表目錄 ... ix

圖目錄 ... x

第一章、前言 ... 1

第二章、前人研究 ... 3

一、 磷的重要性與有效性 ... 3

二、 植物缺磷逆境下的適應機制 ... 4

三、 番茄的重要性與缺磷逆境對番茄生長發育之影響 ... 6

四、 磷礦石的有限性 ... 8

五、 合理化施肥及營養診斷方式 ... 9

六、 磷吸收與轉運的分子調控機制 ... 11

七、 智慧型植物的發展 ... 14

八、 農桿菌滲入法與農桿菌注射法之應用 ... 15

第三章、試驗動機與目的 ... 17

第四章、材料與方法 ... 18

一、 試驗材料與栽培管理 ... 18

(一) 植物材料 ... 18

(二) 栽培方式與栽培地點 ... 18

(三) 營養元素缺乏之處理方式與處理時間 ... 19

二、 農桿菌滲入法與農桿菌注射法 ... 21

(一) 載體構築與農桿菌轉殖 ... 21

(二) 農桿菌滲入法方式 ... 22

(三) 農桿菌注射法方式 ... 23

三、 調查項目與分析方法 ... 23

(一) 植物組織鮮重 ... 23

(二) 葉綠素螢光計 ... 23

(三) 葉綠素含量測定 ... 24

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(四) 植體無機磷濃度測定 ... 24

(五) GUS 定性分析 ... 25

(六) GUS 定量分析 ... 25

(七) Luciferase 定量表現分析 ... 26

(八) 花青素相對含量測定 ... 26

(九) 可溶性固形物測定 ... 27

第五章、結果 ... 35

一、 缺磷對菸草營養生長之影響 ... 35

二、 農桿菌滲入法應用於菸草葉片磷含量充足與否之診斷 ... 36

三、 TPSI1 於不同營養元素缺乏之專一性測試 ... 37

四、 缺磷逆境對番茄營養生長之影響 ... 38

五、 農桿菌滲入法應用於番茄葉片磷含量充足與否之診斷 ... 39

六、 缺磷逆境對番茄生殖生長之影響 ... 40

七、 農桿菌注射法應用於番茄果實磷含量充足與否之診斷 ... 41

八、 農桿菌滲入法應用於其他茄科蔬菜作物 ... 41

第六章、討論 ... 68

一、 缺磷逆境對菸草與番茄營養與生殖生長之影響 ... 68

二、 其他生理指標用於診斷植體磷含量充足與否之可能性 ... 69

三、 農桿菌滲入法與農桿菌注射法用於診斷植體磷含量充足與否之可行性 ... 70

四、 農桿菌滲入法與農桿菌注射法之應用性 ... 72

第七章、結論 ... 75

第八章、參考文獻 ... 76

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表目錄

表 1. 本試驗所用之水耕養液配方 ... 28 表 2. 不同營養元素缺乏處理之水耕養液配方 ... 29

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圖目錄

圖 1. 水耕番茄栽培期間之溫室氣象資料 ... 30

圖 2. 番茄、青椒、辣椒與茄子栽培期間之溫室氣象資料 ... 30

圖 3. (a) TPSI1 promoter: GUS (b) 35S promoter: GUS (c) 35S promoter: Luc 之載體構 築 ... 31

圖 4. 菸草缺磷處理與農桿菌滲入法時間 ... 32

圖 5. 菸草不同營養元素缺乏處理與農桿菌滲入法時間 ... 33

圖 6. 番茄缺磷處理與農桿菌注射法時間 ... 34

圖 7. 缺磷與磷肥恢復處理不同天數對菸草外觀之影響 ... 42

圖 8. 磷肥處理不同天數對菸草(a)地上部與(b)根部鮮重之影響 ... 43

圖 9. 磷肥處理不同天數對菸草根部/地上部鮮重比值之影響 ... 44

圖 10. 磷肥處理不同天數對菸草(a)葉片與(b)根部無機磷濃度之影響 ... 45

圖 11. 磷肥處理不同天數對菸草(a)葉綠素螢光與(b)葉綠素含量之影響 ... 46

圖 12. 磷肥處理不同天數對進行農桿菌滲入法之菸草植體無機磷濃度之影響 .... 47

圖 13. 磷肥處理不同天數對菸草葉片 GUS 染色結果之影響 ... 48

圖 14. 磷肥處理不同天數對菸草葉片 GUS 活性之影響 ... 49

圖 15. 不同營養元素缺乏處理對菸草外觀之影響 ... 50

圖 16. 不同營養元素缺乏處理對菸草無機磷濃度之影響 ... 51

圖 17. 不同營養元素缺乏處理對菸草葉片 GUS 染色結果之影響 ... 52

圖 18. 不同營養元素缺乏處理對菸草葉片 GUS 活性之影響 ... 53

圖 19. 缺磷與磷肥恢復處理不同天數對番茄外觀之影響 ... 54

圖 20. 磷肥處理不同天數對番茄(a)地上部與(b)根部鮮重之影響 ... 55

圖 21. 磷肥處理不同天數對番茄根部/地上部鮮重比值之影響 ... 56

圖 22. 磷肥處理不同天數對番茄(a)葉片與(b)根部無機磷濃度之影響 ... 57

圖 23. 磷肥處理不同天數對番茄(a)葉綠素螢光與(b)葉綠素含量之影響 ... 58

圖 24. 磷肥處理不同天數對番茄花青素累積量之影響 ... 59

圖 25. 磷肥處理不同天數對番茄葉片 GUS 染色結果之影響 ... 60

圖 26. 不同番茄品種與農桿菌菌液濃度對番茄葉片(a)GUS 染色結果與(b)葉片壞疽 情形之影響 ... 61

圖 27. 番茄生殖生長期進行磷肥處理不同天數對(a)地上部與(b)根部鮮重之影響 62 圖 28. 磷肥處理不同天數對番茄(a)綠熟期與(b)紅熟期果實無機磷濃度之影響 ... 63

圖 29. 磷肥處理不同天數對番茄果實(a)產量與(b)可溶性固形物含量之影響 ... 64

圖 30. 磷肥處理不同天數對番茄果實 GUS 染色之影響 ... 65

圖 31. 磷肥處理不同天數對番茄果實 GUS 活性之影響 ... 66

圖 32. 青椒、辣椒與茄子利用農桿菌滲入法表達 GUS 情形 ... 67

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第一章、 前言

磷 (Phosphorous, P) 是植物生長發育所需之一必要營養元素。由於一般土壤中 的磷含量低且有效性低，因此大多數農作物需要藉由施用磷肥來維持作物的產量 與品質，但一般農民常會過度施用磷肥，不僅提高生產成本，而過多的磷肥流入 河川及湖泊，進一步造成水質的優氧化 (eutrophication)，導致生態環境的破壞 (Hammond and White, 2008; Holford, 1997; Raghothama, 1999; Withers et al., 2001)。

再者，萃取磷肥之磷礦石為非再生性的資源 (Cordell et al., 2009)，其所具備的有限 性與衍生出的價格不穩定性將逐漸影響到農作物的生產與農民的收益。

因此在環境保育與經濟效益的考量下，近幾年來行政院農業委員會 (農委會) 結合植體與土壤樣品之營養元素分析診斷結果推動合理化施肥策略 (林等, 2008;

陳, 1998; 陳等, 2008)。但傳統植體與土壤樣品營素元素含量多寡的檢測需依賴特 定儀器設備與專業人員的操作，往往耗時、耗工與耗費，且分析之樣本易因採樣 的誤差而導致誤判之情形發生。近年來雖然也有一些非破壞性的檢驗設備被研發 出來，但仍侷限於特定營養元素 (主要以氮為主)，且其結果易受其他環境逆境所 影響 (李等,2003; 李等,2005; Samborski, 2009)。隨著分子生物學的進展，利用基因 轉殖方式獲得智慧型植物 (smart plant) 或是以微陣列 (microarray) 方式分析基因 變化情形的方式 (Hammond et al., 2003; Hammond et al., 2011 ) 被提出，但有轉殖 技術受限於特定植物種類、技術門檻高、消費者對基因改造作物 (Genetically Modified crops, GM-crops) 存在疑慮、成本高等缺點，因此尚未見到實際應用在農 作物生產上。

本 試 驗 利 用 水 耕 方 式 人 為 調 控 磷 肥 的 供 應 ， 藉 此 調 查 缺 磷 逆 境 對 菸 草 (Nicotiana benthamiana) 與番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) 植株生長 情形與植體磷酸鹽濃度之影響，從中探討是否存在其他缺磷之生理指標可應用於

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植體磷含量之診斷，另一方面透過農桿菌滲入法 (agroinfiltration) 和/或農桿菌注 射法 (agroinjection) 的技術建立一套方便、快速可正確檢測植體磷酸鹽含量充足 與否的方法，以達最終適時適量施肥、減少支出及維護生態之目標。

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第二章、 前人研究

一、

磷的重要性與有效性

除了陽光、空氣與水外，營養元素是植物維持其生長發育所不可或缺的物質，

營養元素的缺乏或不足將嚴重影響作物的產量與品質。植物生長發育所需之營養 元素中，磷為一必要、巨量元素 (macro elements)，不僅是構成細胞結構及能量上 的重要組成，例如核酸 (nucleic acid)、細胞膜 (plasma membrane)、三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 等，同時磷也參與許多酵素反應與訊號傳遞，例如蛋 白 質 的 磷 酸 化 作 用 (Marschner, 1995; Raghothama and Karthikeyan, 2005;

Raghothama, 1999)。

磷 以 多種 化學 組合 方式 存 在於 土壤 中， 但大 體 可分 為無 機磷 (inorganic phosphate, Pi) 和有機磷 (organic phosphate, Po) 兩類。植體吸收磷的型式以無機磷 為主，根據統計，無機磷通常在土壤中約佔總磷含量 35~70% (Shen et al., 2011)。

有 機 磷 存 在 於 土 壤 中 ， 主 要 以 肌 醇 磷 酸 (inositol phosphates) 、 膦 酸 酯 (phosphonates)、正磷酸二酯 (orthophosphate diesters) 方式穩定存在，其次，正磷 酸單酯 (orthophosphate monoesters)、有機多磷酸鹽 (organic polyphosphates) 也是 廣泛存在土壤中之有機磷形式 (Condron et al., 2005; Shen et al., 2011; Turner and Leytem, 2004)。

影響磷有效性的因子，包含土壤酸鹼值 (pH)、土壤中其他陽離子的分佈情形、

微生物作用與雨水淋洗。當土壤 pH 值小於 6.8 時，土壤中的磷型式為單價正磷酸 根離子 H₂PO₄^-，此型式為植物根部容易吸收之型式；土壤 pH 值介於 6.8~7.2 之間，

土壤中磷的型式是二價正磷酸根離子 HPO42-

，此型式為植物根部較難吸收的型式；

當土壤 pH 值大於 7.2，土壤中磷的型式是三價的 PO₄^3-，此型式無法被植體吸收利

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用 (Hopkins and Hüner, 2006)。土壤中無機磷容易與其他陽離子鍵結形成複合物，

其中又以鈣、鐵、鋁等的鍵結最為常見，而鍵結後的磷無法被植物體所吸收利用。

此外，無機磷也可能被土壤中的微生物轉換成有機磷，亦或受雨水淋洗而流失，

因而導致土壤中植物可吸收的磷是有限的，也因此大部分無人工施用磷肥的土地 其作物產量常偏低 (Raghothama and Karthikeyan, 2005; Vance et al., 2003)。

二、

植物缺磷逆境下的適應機制

植物為了克服土壤中常見的低磷逆境而演化出不同的應變措施，大體可分為 兩大方向，(1) 對外提高磷的吸收，包含根形態的改變、根部與菌根菌 (mycorrhizal fungi) 發展共生關係 (symbiotic association)、根圈分泌有機酸 (organic acids)、合 成 磷 酸 酶 (phosphatase) 與 核 酸 酶 (nuclease) 、 誘 導 高 親 和 性 磷 轉 運 蛋 白 (high-affinity phosphate transporter) 的表現等； (2) 對內則設法調整磷的分配與利 用，例如糖解作用 (glycolysis) 以替代路徑進行或將老葉的磷運移至幼葉或生長點 供其生長使用 (Bieleski and Ferguson, 1983; Mimura, 1995)。

植物遭遇缺磷逆境時可透過改變根部的形態來提高磷的吸收，例如先前研究 指出植株缺磷逆境下有 90%的磷是藉由根毛吸收的 (Gahoonia and Nielsen, 1998)。

植物對應低磷逆境所衍生出根部形態的改變依植物種類而具有多樣性，以模式植 物- 阿拉伯芥 (Arabidopsis thaliana) 為例，在缺磷逆境下主根細胞長度與主根根長 變 短 、 根 部 分 生 組 織 處 的 表 皮 細 胞 數 減 少 (Sanchez-Calderon et al., 2005;

Williamson et al., 2001) 、 側 根 與 根 毛 的 生 長 增 加 、 地 下 部 / 地 上 部 比 值 提 高 (Williamson et al., 2001)。而山龍眼科 (Proteaceae) 植物在缺磷環境下會誘導形成 由密集枝根所組成稱 proteoid roots 之特殊根結構 (Watt and Evans, 1999)。

許多植物可與菌根菌發展出共生關係，菌根菌藉由菌絲 (hyphae) 提高磷的吸 收面積，再將磷運輸至根部的皮層供植物使用，目前也已知菌根菌可誘導植物產

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生 特 定 的 磷 轉 運 蛋 白 用 以 提 高 磷 肥 吸 收 (Karandashov and Bucher, 2005;

Raghothama and Karthikeyan, 2005; Smith et al., 2003)，例如水稻 (Oryza sativa) 的 OsPT1 磷轉運蛋白、馬鈴薯 (Solanum tuberosum) 的 StPT3 磷轉運蛋白都與菌根菌 有關 (Rausch et al., 2001)。

相較於單子葉植物，雙子葉植物特別是豆類植物，吸收磷的效率較高，因為 大多數豆類作物在缺磷逆境下於根尖 1~2 公分處會分泌有機酸，其中又以蘋果酸 (malic acid) 與檸檬酸 (citric acid) 最為常見。根分泌有機酸可利用螯合作用 (chelation) 幫助磷從與陽離子結合的複合物中釋放出來 (Hoffland et al., 1992;

Johnson et al., 1996)。例如苜蓿 (Medicago sativa) 在磷缺乏環境下，會增加檸檬酸 排出的量 (Lipton et al., 1987)，白色羽扇豆 (Lupinus albus) 在磷缺乏環境下，大量 分泌蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸 (succinate) (Johnson et al., 1996)。

高等植物在缺磷逆境下生長普遍會合成磷酸酶與核酸酶 (Duff et al., 1994;

Poirier and Bucher, 2002)。磷酸酶根據螯合的 pH 值分為鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 與酸性磷酸酶 (acid phosphatase) (Duff et al., 1994)。植體內的鹼性磷 酸酶是高專一性的受質，在代謝中扮演重要角色，相對的酸性磷酸酶較不具專一 性。此外核酸酶與酸性磷酸酶的功能相同，在缺磷逆境期間，細胞外或細胞內皆 會產生核酸酶與酸性磷酸酶，可幫助植體從外部或是內部獲得更多的磷供其使用。

酸性磷酸酶的分泌現象可透過 BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) 染色方 式觀察到，例如在阿拉伯芥、羽扇豆、水稻 (Oryza sativa)、小麥 (Triticum aestivum)、

番茄皆有觀察到在缺磷環境下其根部表現高的酸性磷酸酶 (Ciereszko et al., 2011;

Lloyd et al., 2001; Sanchez-Calderon et al., 2005; Tadano and Sakai, 1991; Trull and Deikman, 1998; Trull et al., 1997)。當植物暴露在土壤有機磷含量高達 80%以上時，

細胞外的酸性磷酸酶與核酸酶會分解有機質如植酸 (phytate) 進而釋放出磷供給 植體使用，而細胞內的磷酸酶與核酸酶可能用來參與調節磷的重新分配 (Duff et al.,

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1991; Poirier and Bucher, 2002)。

植物缺磷時會誘導高親和性磷轉運蛋白的表現，其中像是 PHT1 家族常被提及 在缺磷逆境時會增加表現量，其表現在根部，負責磷的吸收(Lee, 1993; Mitsukawa et al., 1997; Raghothama, 1999)，有關這類磷轉運蛋白將於下面章節做更詳細的介紹。

植體在缺磷時細胞內 ATP 與核苷酸含量會顯著下降，此時植體會改變糖解作 用 路 徑 ， 並 藉 由 許 多 酵 素 如 UDP-glucose pyrophosphorylase 、

pyrophosphate-dependent phosphofructokinase 等 的 參 與 ，

以 替 代 的 路 徑 pyrophosphate (PPi)-dependent pathway 進行，此替代路徑不僅可減少糖解作用 ATP 能量的消耗，也利於進行花青素 (anthocyanin) 生合成路徑，使得植物體在缺磷逆 境下花青素大量累積，而花青素的累積又可以保護核酸避免 UV 光的傷害與保護 葉綠體在光合成中不受光抑制 (photoinhibition) 的傷害 (Hoch et al., 2001; Plaxton and Carswell, 1999; Poirier and Bucher, 2002)。

為了在缺磷逆境下使磷達到最佳化利用，磷會由老葉運移到幼葉或重新分配 磷從非必要性的組織到必要組織 (Bieleski and Ferguson, 1983; Raghothama and Karthikeyan, 2005; Raghothama, 1999)。在細胞層級上，當磷充足時，植體會將磷運 移到液胞貯存，此為維持植體內磷平衡的一個重要過程，因此在短期缺磷逆境下，

磷會由液胞運移出以維持細胞質的磷濃度在一個平衡的狀態 (Bieleski, 1973; Lee and Ratcliffe, 1993; Mimura et al., 1996; Sakano et al., 1992; Tu et al., 1990)。

三、

番茄的重要性與缺磷逆境對番茄生長發育之影響

番茄 (Solanum lycopersicum L.) 為世界重要蔬菜，原生地為南美安地斯山區、

祕魯、厄瓜多、玻利維亞等地，其營養價值高，如富含維生素 C、維生素 A、鉀等 營養，又因逐漸瞭解番茄果實中所含的茄紅素 (lycopene) 及其他有效成分與降低 前列腺癌、肺癌、胃癌等癌症的發生有關 (Giovannucci, 1999; Story et al., 2010)，

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在消費市場中廣受消費者喜愛。番茄依照食用方式的不同可分為加工用或是鮮食 用，目前國內加工用番茄栽培較少，但鮮食用番茄因近年來國內陸續培育出新品 種，品質、風味佳，糖度高達 6~12∘Brix，因此深受國人喜愛，依據行政院農業 委員會農糧署 2012 年農業統計年報顯示，番茄總栽培面積已超過 4,501 公頃，總

產 量 高 達 111,361 公 噸 ( 農 業 統 計 年 報 ;

http://agrstat.coa.gov.tw/sdweb/public/book/Book.aspx)，其中大多都是鮮食用，主要 產地集中在中南部 (郭和何, 2010)。

缺磷逆境普遍來說會導致植株高度降低、抑制分蘗、延長休眠、提早老化、

減少花及花苞的數量及大小、造成花青素的累積等，最終影響作物的產量及品質 (Hammond and White, 2008; Marschner, 1995)。同樣的，缺磷逆境將影響番茄生長 與發育，例如 20 天苗齡的番茄植株培養在缺磷環境下，將會降低其地上部及根部 的乾物重，此外也降低磷在地上部的比例 (Biddinger et al., 1998)；若是在結果時期 進行缺磷處理，則降低果實、葉片、莖及根的磷含量、減少果實與地上部的乾重，

也降低光合作用效率、氣孔導度 (stomatal conductance) 與蒸散速率 (transpiration rate) 及造成莖徑、果徑的下降，因而影響最終的品質與產量 (Fujita et al., 2003)。

植物依照對於磷的吸收效率可分為高效率 (high efficient) 與低效率 (low efficient) 兩種， 高效 率植物像是菠菜 (Spinacia oleracea L.)、 油菜 (Brassica campestris L.)、小麥 (Triticum aestivum L.)、黑麥 (Secale cereal L.) 等，低效率植

物像是洋蔥 (Allium cepa. L.)、番茄、豆類等，影響吸收效率的高低與根部本身對 磷的吸收速率高低及植株地下部/地上部比值大小有關 (Raghothama, 1999)。由於 番茄屬於低效率的植物，充足的磷肥供給對番茄生產扮演重要性，再者，番茄以 採收果實為主，磷肥需求高。目前建議的施肥量，在基肥時每公頃需要施用高達 833～1,111 公斤的過磷酸鈣 (戴等, 2010)。

上述提及植物面臨缺磷逆境時有各式各樣的適應方式，但每種植物所採取的

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策略不一，效果也不同。雖然也有學者嘗試利用這些特性來提高植體磷含量，例 如利用接種不同的叢狀菌根菌 (Arbuscular mycorrhizal, AM)，如 G. rosea、G.

caledonium、G. intraradices. 等來提高亞麻 (Linum usitatissimum L. cv Linetta)、番

茄 (Solanum lycopersicum cv Rio-Grande 76R)、苜蓿 (Medicago truncatula L. cv Jemalong) 植體的磷含量 (Smith et al., 2003)，或是透過菌根菌接種使洋蔥 (Allium cepa) 具有較高的磷濃度與較高的乾物重 (Tawaraya et al., 2006)。但現代農業為追

求高效率與獲得高產、高品質的農產品，大多還是採用施肥方式補足作物所需之 磷肥。

四、

磷礦石的有限性

典 型 地 面 上 的 磷 循 環 主 要 受 到 農 業 與 人 類 活 動 所 控 制 (Oelkers and Valsami-Jones, 2008)。多數植物組織磷的濃度為 5~20 mM (Raghothama, 1999)，但 一般土壤可供植物體所利用的無機磷濃度很少超過 10 μM (Bieleski, 1973)。在全球 熱帶、亞熱帶地區的潮濕土壤及半乾旱地區的砂質土壤，常見作物的產量因為磷 的缺乏而嚴重降低 (Raghothama, 1999)。

為使土壤保有充足的磷供作物生長，農民藉由施用磷肥以維持甚或提高作物 產量與品質。磷肥主要是由磷礦石開採提煉而來，磷礦石開採主要集中在世界上 的幾個國家，像是中國、美國與摩洛哥三個國家開採的量即大約佔世界產量的三 分之二 (Potashcorp; http://www.potashcorp.com/industry_overview/2011/nutrients/23 /)。再者，磷礦石為非再生性的資源，隨著需求量的增加，磷礦石被過度地開採，

根據學者推估磷礦石若依照目前的趨勢持續開採，預計全世界磷礦石的貯存量可 能在 50-100 年內用盡 (Cordell et al., 2009; Runge-Metzger, 1995; Steen, 1998)。磷礦 石的開採也帶來嚴重的生態破壞，以南太平洋小島諾魯 (Nauru) 為例，諾魯曾是 世界三大磷礦石的生產地，磷礦分佈於全島 70%土地上，隨著島上礦產的開發耗 盡，使得約 80%土地受到破壞，也使得 40%鄰近海洋生物因泥沙和磷礦的徑流而

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死亡 (Republic of Nauru, 1999)。

五、

合理化施肥及營養診斷方式

由於土壤中的磷具有有效性，加上露天栽培時磷肥易受雨水淋洗而流失，磷 肥的充足給予對作物生產扮演重要角色。但隨著氣候變遷問題加劇，設施栽培 (protected cultivation) 已成為各類作物穩定生產之一趨勢，同時具有提高產量與品 質之優點 (郭, 1985; 黃等, 2009; 詹和陳, 2003; 劉等, 2009)。以番茄來說，臺灣夏 季高溫高濕，加上常有颱風、豪雨侵襲，造成番茄栽培困難；秋冬時節氣候雖適 宜番茄生長，但露地栽培病蟲害危害嚴重，因此為提高番茄之產量與品質，近年 來已多採用設施栽培 (劉等, 2009)。雖然設施栽培不會有雨水淋洗問題，但也因為 缺乏雨水淋洗，加上農民過度施用肥料，不僅提高生產成本，也造成土壤鹽類的 累積，緊接著伴隨而來的是影響水分的吸收、過多的鹽分造成根部傷害、養分間 不平衡引起養分拮抗作用、破壞土壤微生物活力，甚至因為微生物相的不平衡易 使作物發生病害 (王等, 2011; 黃等, 2007; 羅, 2002)。

現今農民為了確保農作物的產量與品質，不論露天或設施栽培，過度施肥已 成為常見現象。過度施肥除了具有上述缺點外，以磷來說，過度施用磷肥還造成 過多的磷隨著地下水徑流流到排水溝，進入河川與湖泊，導致水質優養化，造成 環境生態的破壞。另一方面，隨著磷礦石漸漸地使用耗盡，也將造成磷肥價格的 波動，以摩洛哥出產的磷礦石為例，根據 IndexMundi 統計指出 2008 年每公噸的 磷 礦 石 價 格 升 高 至 約 430 美 元 ， 較 2007 年 增 加 超 過 70% (IndexMundi;

http://www.indexmundi.com/commodities/?commodity=rock-phos phate&months=240)。

由於國內製造肥料的原物料大多只能仰賴進口，因此常受國際價格波動所影響，

使得國內肥料價格浮動高，為此農委會於民國 97 年的重要措施之一就是成立「肥 料價格審議小組」進行價格趨勢分析，並進一步透過補助方式穩定國內肥料價格。

但補助畢竟不是長久之計，且對政府來說是一財政負擔，也因此農委會也同時成

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立「肥料配銷督導小組」及由各區農業改良場組成「合理化施肥輔導小組」用以 穩定肥料供應及輔導農民合理化施肥，即最終希望透過合理化施肥的政策，降低 農 民肥 料 使用量 ，以 達減 少 肥料支 出 成本 及增 加收益之目 標 ( 農業委員會;

http://www.coa.gov.tw/view.php?catid=17615)。

所謂的「合理化施肥」，乃是依照作物的種類、特性及生長情形，配合不同 的田間土壤條件及肥料特性來制訂出最經濟、最合理的施肥策略，而且同時要能 兼顧作物產量及品質，如此不僅可以減少肥料支出，也可以避免過度施肥造成土 壤鹽化、酸化及環境污染等問題。因此合理化施肥不僅可以維持作物生產、降低 肥料成本，更可以增加肥料的永續性以及降低環境污染 (林, 2005; 林等, 2008; 陳 等, 2008; 陳, 1998; 蕭和賴, 2010)。

為制訂合理化施肥策略，需要先知道作物的營養是否充足，作物營養的不足 雖說可借肉眼判斷，但僅有經驗的專家才可判斷，且當肉眼可見時往往都已為時 過晚，因此，目前多是採取植體或土壤樣品進行各種營素元素含量多寡的檢驗 (林 等, 2008; 陳等, 2008; Campbell, 1994; Hammond and White, 2008)。植體中各種營養 元素濃度的高低是各類因子之綜合反應結果，其濃度可做為營養缺乏或過多的診 斷指標，而土壤肥力狀態能反應土壤對作物生長之養分供給能力 (張和李, 1989)。

然而，利用植體診斷作物營養狀態，容易因植體本身遭遇病蟲害、環境因素與作 物本身品種的差異而導致誤判的情形發生，此外採樣組織的部位與年齡的不同也 可能造成分析的誤差；利用土壤進行分析則因分析過程土壤需經陰乾、過篩方能 測定土壤 pH 值、電導度值 (Electrical Conductivity, EC) 及有機質，且需經進一步 萃取方能分析土壤養分含量，往往需要耗費許多時間，而在等待的過程中植體可 能已經發生嚴重養分缺乏情形 (林, 2007; 張和李, 1989; 彭, 2005)。目前臺灣 是由各大改良場免費替農民進行檢驗，但這樣的檢驗方式往往需要使用到原子吸 收光譜儀 (Atomic Absorption Spectrometer, AA)、感應偶合電漿質譜儀 (Inductively

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Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS) 等昂貴儀器，加上樣品製備過程複雜 且耗時，往往需要仰賴專業人員的操作 (張和李, 1989)，因此勢必會增加政府農政 單位的財政負擔。

除了上述傳統的檢驗方式，隨著科技的發展，也有不少非破壞性的探測器被 研發出來，例如可透過偵測葉綠素、polyphenolics 等含量的變化來判讀植物是否缺 乏氮肥，但其結果易受人為操作方式、季節變化、不同營養元素缺乏或不同環境 逆境等因素所影響 (李等,2003; 李等,2005; Samborski, 2009)。再者，目前這類的儀 器主要都是用於測定氮肥供應的充足與否，尚未有商業化的磷肥診斷儀器被推 出。

六、

磷吸收與轉運的分子調控機制

植體吸收磷需要先消耗 ATP 以產生質子梯度 (proton gradient)，再利用磷轉運 蛋白 (phosphate transporter) 輸送磷至植體內部。依照酵素動力學的特性，磷轉運 蛋白可區分為高親和性 (high affinity) 與低親和性 (low affinity) 兩種 (Furihata et al., 1992; Raghothama, 1999)。而依照序列相似性則可分為 Pht1、Pht2、 Pht3 與 Pht4 四大家族 (Karandashov and Bucher, 2005; Poirier and Bucher, 2002)。Pht1 家族的多 數成員被認為是高親和性磷轉運蛋白，由 Pht1:1~Pht1:9 等成員組成，主要位於根 系細胞膜上，但在花、子葉出水孔 (hyadothode)、花粉、葉片維管束組織 (vascular tissue)、芽等部位也都有所表現 (Karthikeyan et al., 2002; Mudge et al., 2002)。Pht1 家族中的 Pht1:1、Pht1:2、Pht1:3 與 Pht1:4 等成員在缺磷時誘導表現，主要在根部 負 責 吸 收 無 機 磷 ， 也 是 目 前 研 究 最 多 的 磷 轉 運 蛋 白 (Mudge et al., 2002;

Raghothama and Karthikeyan, 2005)。Pht2:1 是目前唯一已知的 Pht2 家族成員，屬 於低親和性磷轉蛋白，主要位於葉綠體膜上 (Versaw and Harrison, 2002)。Pht3 家 族的成員包含 Pht3:1、Pht3:2、Pht3:3，主要位於粒線體膜上。Pht4 家族的成員有 6

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個，Pht4:1~ Pht4:6，主要位於根部與葉片，Pht4:1~Pht4:5 在質粒體 (plastid) 也有 所表現，Pht4:6 則在高爾基體 (Golgi apparatus) 表現，說明 Pht4 可能參與細胞質 與質粒體或與高爾基體間磷的運輸 (Guo et al., 2008)。

如上所述，根部磷的吸收主要由 Pht1 家族所負責，透過 iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 定量膜蛋白質體的技術，目前得知 Pht1 家族中不 少成員受 UBC24/PHO2 蛋白質所調控。PHO2 位於細胞內膜 (endomembrane) 上，

為一泛素接合酵素 (ubiquitin-conjugating E2 enzyme)，具有調控 PHT1 蛋白質降解 的功能 (Huang et al., 2013)。另一方面，透過突變株篩選的方式， PHO2 被證實也 可調控 PHO1 (PHOSPHATE 1) 蛋白質的表現 (Liu et al., 2012)。PHO1 為一膜蛋白 (membrane protein)，主要表現在根部的維管束細胞，參與無機磷木質部的裝載 (xylem loading)，因此阿拉伯芥 pho1 突變株造成磷運載到地上部的功能受損，導致 其根部磷含量雖正常但地上部磷含量低，因而其外表形態較一般野生型阿拉伯芥 矮小 (Poirier et al., 1991)。而阿拉伯芥 pho2 (phosphate 2) 突變株地上部出現磷毒 害的現象乃是因為降低 PHT1 與 PHO1 蛋白質的降解，進而提高磷的吸收與磷由根 部運載到地上部的功能所致 (Aung et al., 2006; Huang et al., 2013; Liu et al., 2012)。

微型核醣核酸 (microRNAs, miRNAs) 是小分子核醣核酸 (small RNAs) 的一 員，長度只有 20-21 個鹼基，具有副調控基因表現的功能，在調控動植物各項生理 反應上扮演重要角色 (Bonnet et al., 2006; Jones-Rhoades et al., 2006; Lin et al., 2008;

Mallory and Vaucheret, 2006; Sunkar et al., 2007)。上述 PHO2 的表現受微型核醣核 酸 399 (miR399s) 所調控，缺磷時會誘導 miR399s 的表現，進而抑制 PHO2 的表達，

因此大量表現 miR399s 的阿拉伯芥轉殖株相較於野生型阿拉伯芥會有較高的磷吸 收與轉運能力，致使植株出現磷毒害現象 (Aung et al., 2006; Chiou et al., 2006)。再 者，透過嫁接實驗，miR399s 被證實可長距離的由地上部運移到根部，進而調控植

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物無機磷的體內平衡 (Homeostasis) (Lin et al., 2008; Pant et al., 2008)。

缺磷逆境下的磷訊號調節伴隨著許多基因的參與，但大抵可分為早期基因 (early gene) 與晚期基因 (late gene)，早期基因為缺磷時快速誘導表現的基因，多 與訊息傳遞有關，晚期基因多與形態、生理與代謝改變有關 (Hammond et al., 2004;

Vance et al., 2003)。這些基因在阿拉伯芥中已被廣泛描述 (Chiou and Lin, 2011;

Vance et al., 2003)。番茄中較早被描述到缺磷誘導表現的基因為 TPSI1 (tomato phosphate starvation-induced gene)，此基因在缺磷時會快速的在根部及葉片表達，

因而被歸類為早期基因 (Biddinger et al., 1997; Liu et al., 1997)。與 TPSI1 相似的基 因包含有阿拉伯芥中發現的 IPS1、At4、At4.1、At4.2 (Burleigh and Harrison, 1997;

Martín et al., 2000; Shin et al., 2006)，苜蓿 (Medicago truncatula) 中發現的 Mt4 (Burleigh and Harrison, 1997; Burleigh and Harrison, 1998)，水稻中發現的 OsIPS1、

OsIPS2 (Hou et al., 2005; Wasaki et al., 2003)，他們都被歸類為非編碼的 RNA

(non-coding RNAs)， 也都受缺磷逆境誘導表現，但除了存在 22-24 個核苷酸 (nucleotide, nt) 的相似序列外，其他地方序列則不相似 (Burleigh and Harrison, 1998;

Martín et al., 2000)。AT4 與 IPS1 近來被認為可模仿 miR399 目標基因-PHO2 的序列 (target mimicry) ， 因 為 其 所 存 在 的 22-24 個核 苷 酸相 似 序 列 部 分 互 補 (complementarity) 於 miR399 的序列，但於中間重要區域序列則不具互補性，因而 可減緩 miR399 對 PHO2 的抑制作用 (Franco-Zorrilla et al., 2007)。

除了上述提及利用菌根菌接種的方式提高植物磷肥吸收效率外，隨著分子生 物學的進展，陸續有學者嘗試利用基因工程方式提升根部磷的吸收效率，以減少 磷肥的施用量。例如，菸草透過基因轉殖檸檬酸合成之編碼序列 (Pseudomonas aeruginosa CS gene) 而獲得大量生合成檸檬酸之轉殖株，於營養期、開花期與著 果期進行缺磷處理，結果顯示轉植株在缺磷下仍可與對照組野生型植株置於磷充 足環境下達到一樣生長狀況 (Lopez-Bucio et al., 2000)。此外，菸草透過基因轉殖

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酸性磷酸酶- LASAP2，於含植酸的環境下，轉植株因能有效水解植酸，使得轉植 株相較野生型植株有較高的磷含量與較高的乾物重 (Wasaki et al., 2009)。而基因轉 殖菸草大量表現阿拉伯芥高親和性磷轉運蛋白基因 PHT1；1，在缺磷逆境能提升 菸草對磷的吸收能力 (Mitsukawa et al., 1997)。亦或大量表現 miR399 的阿拉伯芥 或菸草轉殖株相較於野生型植株也可以有較高的磷吸收與轉運能力 (Aung et al., 2006; Chiou et al., 2006)，可惜的是可能因為啟動子 (promoter) 表現太強，致使植 株出現磷毒害現象，未來若可透過啟動子的篩選將有機會提高磷的吸收效率但又 不致於使植株出現磷毒害現象，或是也可考慮在極端缺磷的土壤環境栽培此類轉 殖株。以上例子雖說明透過基因轉殖的確可提高磷的吸收效率，但因為是基因轉 殖植物，若要實際運用到農作物上即成為基因改造作物 (Genetically Modified crops, GM-crops)，而目前認為基因改造作物可能存在一定的潛在危機，如影響生態系的 平衡、抗藥性、抗生素抗性等等的考量 (Chiter et al., 2000; Schuler et al., 1999; 黃 和曾, 2001)，因此目前一般消費者對基因改造作物仍具有一定的顧慮，也減緩此方 式實際應用在作物上的時間。

七、

智慧型植物的發展

除了利用基因工程方式提升根部磷的吸收效率外，伴隨著分子生物學的發展，

發展智慧型植物的概念在 2003 年被提出，當時乃利用在阿拉伯芥轉殖帶有缺磷專 一誘導表現基因-SQD1 (sulfoquinovosyl diacylglycerol 1) 的啟動子與報導基因 (reporter gene) 的構築，預期該轉殖株遭受缺磷逆境時，將誘導 SQD1 表現，並進 一步導致報導基因的表達，試驗結果也的確證實該阿拉伯芥轉殖株可透過報導基 因的表現情形，成功表達自身是否遭遇缺磷逆境 (Hammond et al., 2003)。這樣的 轉殖株將可幫助我們更精密控制磷肥的施用、降低花費、保護自然資源與減少環 境汙染，以達合理化施肥之目標。但是這樣的智慧型植物一直還沒有實際應用到 農作物上，主要的限制就是基因轉殖在一般作物所需時間長、技術層面高不易達

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成，且目前不是每樣作物都可以成功再生得到基因轉殖植物，以及消費者對基因 改造作物的疑慮。

除了發展智慧型植物，近來也有學者提出使用微陣列的方式來診斷植株缺磷 與否，主要是將植體抽取核醣核酸後進行微陣列分析，再依照基因的表現情形來 整體衡量作物是否缺磷 (Hammond et al., 2011)。其好處是同一時間可看很多基因 的表現，用以當作衡量缺磷與否的標準會更客觀，但相對來說，如果每隔一段時 間，就要針對各種作物做微陣列分析，所需經費還是相當高昂且其分析方式相對 較為複雜，目前仍不適合實際應用。

八、

農桿菌滲入法與農桿菌注射法之應用

為了研究基因的功能，以往普遍利用農桿菌 (Agrobacterium) 進行基因轉殖，

之後再生形成基因轉殖植物，但是這樣的過程，往往耗時、耗錢，且技術難易度 依植物種類而異。農桿菌滲入法於 1997 年被提出，此技術可短暫表現 (transient expression) 目標基因，透過 CaMV35S (Cauliflower mosaic virus) 啟動子接上 GUS (ß-glucuronidase) 報 導 基 因 或 目 標 基 因 ß-1,3-glucanase (GLUase) 、 chitinase (CHNase)，於農桿菌滲入後不同天數檢測活性，發現在滲入後第 4 天便有高的活 性，且到第 10 天仍維持高活性，說明可透過此種短暫表現方式了解基因的功能 (Schöb et al., 1997) 。 該 方 法 目 前 在 轉 基 因 補 償 作 用 (transgenic complementation)(Bendahmane et al., 2000; Johansen and Carrington, 2001; Shao et al., 2003; Van der Hoorn et al., 2000)、啟動子功能分析 (Yang et al., 2000) 及蛋白質生產 (Vaquero et al., 1999; Vaquero et al., 2002) 上已有相關應用例子。另一方面，也有學 者利用農桿菌滲入法結合啟動子與報導基因的構築成功偵測菸草葉片是否遭遇病 原菌攻擊或遭受熱逆境 (Yang et al., 2000)。

早期農桿菌滲入法大多侷限於菸草使用，隨著技術不斷的改進，目前在阿拉 伯 芥 、 番 茄 及 萵 苣 (Lactuca serriola)(Lactuca sativa) 等 作 物 都 可 成 功 表 達

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(Wroblewski et al., 2005)，大幅提高這項技術應用的空間。然而農桿菌滲入法在非 模式植物容易出現葉片壞疽情形，需透過使用不同的農桿菌品系來加以克服，例 如一般試驗常用農桿菌品系-GV3101、C58C1 等會造成番茄葉片在農桿菌滲入後出 現壞疽情形，進而干擾報導基因的表現。透過改成滲入大理花 (

Dahli

) 中發現的野 生型農桿菌-1D1249 品系，可減緩番茄葉片出現壞疽情形。因此農桿菌品系的選擇 於農桿菌滲入法中是一關鍵影響因子。

農桿菌注射法與農桿菌滲入法類似，都是短暫基因表現的系統，相對於農桿 菌滲入法是在葉片表現，農桿菌注射法則可表現於果實上，操作上則是利用帶有 針頭的針筒將農桿菌菌液注射到果實組織即可 (Orzaez et al., 2006b)。番茄利用農 桿菌注射法於注射後 3~4 天在果實胎座附近呈現高表現量的報導基因 (Orzaez et al., 2006)，除了番茄外，農桿菌注射法也可應用在蘋果、梨子、桃子、草莓與橙等 果實上 (Spolaore et al., 2001)。此方法已被應用於啟動子方面的研究，例如利用阿 拉伯芥熱休克蛋白 (heat shock protein 70, HSP70) 啟動子配合 GUS 報導基因，可 在熱休克處理下偵測到果實大量表現 GUS 報導基因。另外結合農桿菌注射法與病 毒誘導基因靜默 (virus induced gene silencing, VIGS) 系統，Orzaez 等人透過注射 帶有 PDS (phytoene desaturase) 相關病毒靜默載體的農桿菌於番茄果實可成功地 默化番茄 PDS 基因，因該基因參與胡蘿蔔素生合成功能，因此使果實呈現白化徵 狀 (Orzaez et al., 2006)。

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第三章、 試驗動機與目的

由於磷在土壤中具有有效性與磷肥本身具有有限性，為兼顧經濟發展與環境 生態考量，除了可透過提高磷肥的吸收效率使磷能夠更有效率地被作物吸收利用 外，另一方面則需透過合理化施肥策略達成同時兼顧作物產量與減少磷肥施用量 之目的。要進行合理化施肥，最重要的就是需要準確的進行營養診斷，但傳統營 養診斷方式耗時、耗錢，且需專業人士進行操作。近年來發展出的非破壞性儀器、

智慧型植物與微陣列等檢測方式，則有特定元素侷限、易受其他逆境影響、轉殖 技術受限於特定植物種類、技術門檻高、消費者對基因改造作物的疑慮、成本高 等缺點，因此並不容易實際應用於農作物生產。

本研究首先希望透過缺磷逆境的處理，探討缺磷對菸草與番茄植株生長的影 響，透過一系列生理反應的檢測，希望尋得潛在可應用於植體磷含量診斷之生理 指標。另一方面，TPSI1 於短時間缺磷處理即在葉片大量表達，因此本研究希望利 用番茄 TPSI1 啟動子接上報導基因的構築，結合農桿菌滲入法和/或農桿菌注射法 方式將其表現在菸草與番茄的葉片與果實，藉此建立一套快速、準確的植體磷含 量充足與否的檢測方式，透過報導基因的表現量來告知栽培者作物目前的營養狀 態。該作物並不食用，而是作為指標作物，透過該指標作物報導基因的表現量即 時呈現植體營養狀態供作施肥之參考，以達最終適時適量施肥、減少支出及維護 生態之目標。

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第四章、材料與方法

一、 試驗材料與栽培管理

(一) 植物材料

本 研 究 植 物 材 料 以 菸 草 (Nicotiana benthamiana) 與 番 茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) 為主，兩植物的種子皆取自中央研究院 (Academia

Sinica) 農業生物科技研究中心 (Agricultural Biotechnology Research Center, ABRC) 邱子珍老師實驗室。其他植物材料包括番茄‘金剛二號’、辣椒‘滿天紅’、青椒 ‘翠 綠星’、茄子‘一口茄’等品種的種子則購自農友種苗股份有限公司 (KNOWN-YOU SEED CO., LTD.)。

(二) 栽培方式與栽培地點

菸草與‘Micro-Tom’番茄皆以水耕方式栽培，以逆滲透水 (Reverse osmosis water, RO water) 做為水源配製養液，養液配方參考 Half-strength modified Hoagland nutrient solution (Millner and Kitt, 1992; Hoagland and Arnon, 1950)，再略作調整 (表 1)。水耕液配方由養液 I、II、III、IV、V、VI 所組成，養液 I 含有 2.5 mM 的 Ca(NO₃)₂∙4H₂O 與 KNO₃，養液 II 為 1 mM 的 MgSO₄∙7H₂O，養液 III 為 50 μM 的 NaFe EDTA (EDTA ferric sodium salt, Sigma)，養液 IV 為 KH2PO4，依試驗目的所需 而調整濃度，+Pi 時為 0.5 mM，進行缺磷處理時，則以 KCl 補充因缺 KH₂PO₄導 致同時缺少的鉀，養液 V 包含 10 μM H3BO3、0.2 μM Na2MoO4∙2H2O、1 μM ZnSO₄∙7H₂O、2 μM MnCl₂∙4H₂O、0.5 μM CuSO₄∙5H₂O、0.2 μM CoCl₂∙6H₂O 與 25 μM HCl，養液 VI 為 0.5 mM MES (2-N-Morpholino ethanesulfonic acid)。配製後用 HCl 或 NaOH 調整 pH 至 5.7。

水耕栽培方式是先將菸草與‘Micro-Tom’番茄種子置於含 1 % 次氯酸鈉

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(Sodium hypochlorite, NaOCl ) 與微量 Tween20 的消毒液中震盪 15 分鐘，進行種子 消毒。於無菌水清洗後菸草種子播種於 2.5 cm³ 的十字海綿，並給予含 250 μM KH2PO4的 Hoagland 水耕液 7 天，之後移至含充足磷肥 (+Pi, 500 μM KH2PO4) 的 Hoagland 水耕液中定植，期間每隔 5 天更換一次水耕液，栽培地點為國立臺灣大 學生物資源暨農學院附設人工氣候室，環境條件為光/暗期=16/8 小時、日/夜溫

=25/20 ℃、光強度＝120 uM m^-2s^-1。‘Micro-Tom’番茄種子經消毒後，播種於附有 濕濾紙的培養皿中，置於黑暗下 5 天待胚根突破種皮後，移至 2.5 cm³的十字海綿 上，並培養於含充足磷肥 (+Pi, 500 μM KH2PO4) 的 Hoagland 水耕液中，栽培期間 同樣每隔 5 天更換一次水耕液，栽培地點為國立臺灣大學生物資源暨農學院附設 農業試驗場園藝分場之溫室，利用資料收集器 (WatchDog 1000 Series Data Loggers, Spectrum Technologies)結合光量子感應器 (Quantum Light Sensor) 紀錄溫度與光 度，栽培期間溫室環境氣象資料如圖 1 所示。

除了菸草與‘Micro-Tom’番茄利用水耕進行栽培外，其餘試驗作物皆以 1:1 比 例混和 Sunshine #5 Natural & Organic 介質 (Sun Gro Horticulture, Canada) 與珍珠 石進行土耕栽培，栽培地點為國立臺灣大學園藝暨景觀學系溫室，並於每週噴施 稀釋 1000 倍之花寶二號速效肥 (20-20-20)，栽培期間溫室環境氣象資料如圖 2 所 示。

(三) 營養元素缺乏之處理方式與處理時間

菸草水耕定植後 20 天，收集部分植物材料 (+Pi0D) 供後續分析使用，另一部 分植物材料進行不同天數的磷肥處理，包括磷肥充足 (+Pi, 500 μM KH₂PO₄) 與缺 乏 (-Pi, 0 μM KH2PO4) 處理 1 天 (+Pi1D 及-Pi1D)、3 天 (+Pi3D 及-Pi3D)、5 天 (+Pi5D 及-Pi5D)、7 天 (+Pi7D 及-Pi7D)，處理後同樣收集材料供後續實驗使用。

另外將缺磷逆境處理 3 天之植物置放回 500 μM KH2PO4養液進行磷肥恢復處理 1 天 (Re1D)、3 天 (Re3D) 及 5 天 (Re5D)，一樣收取植物材料供後續分析使用。試

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驗設計採完全隨機設計 (Complete Randomized Design, CRD) ，每處理 3 重複，每 重複 1 株植株。

另一方面，菸草於水耕定植後 20 天，進行不同營養元素缺乏之逆境處理，分 別為缺氮 (-N)、缺磷 (-P)、缺鉀 (-K)、缺鈣 (-Ca)、缺鎂 (-Mg)、缺硫 (-S)、缺 鐵 (-Fe)，對照組則培養於原本的 Half-strength modified Hoagland nutrient solution 養液 (Full) 中，處理後 7 天收取植物組織供後續試驗使用。詳細營養元素缺乏之 養液配法如下：缺氮：以 CaCl₂與 KCl 取代養液 I 的 Ca(NO₃)2與 KNO₃，以補充缺 氮處理時同時缺少的鈣與鉀；缺磷：以 KCl 取代養液 IV 的 KH₂PO₄，以補充缺磷 處理時同時缺少的鉀；缺鉀：以 Ca(NO3)2與 NaH2PO4取代養液 I 的 KNO3與養液 IV 的 KH₂PO₄，以補充缺鉀處理時同時缺少的氮與磷；缺鈣：以 NH₄NO₃取代養液 I 的 Ca(NO3)2，以補充缺鈣處理時同時缺少的氮；缺鎂：以 CaSO4取代養液 II 的 MgSO₄，以補充缺鎂處理時同時缺少的硫；缺硫：以 MgCl₂取代養液 II 的 MgSO₄， 以補充缺硫處理時同時缺少的鎂；缺鐵：不添加養液 III。各處理詳細元素含量如 (表 2) 所示。本試驗採完全隨機設計，每處理 3 重複，每重複 1 株植株。

水耕定植 22 天的‘Micro-Tom’番茄植株進行不同天數的磷肥處理，包括磷肥充 足 (+Pi, 500 μM KH2PO4) 與缺乏 (-Pi, 0 μM KH2PO4) 處理 1 天 (+Pi1D 及-Pi1D)、

5 天 (+Pi5D 及-Pi5D)、10 天 (+Pi10 及-Pi10D) 後收取植物材料。缺磷逆境處理 10 天後進一步進行磷肥恢復處理 1 天 (Re1D) 及 5 天 (Re5D)，同樣收取植物材料進 行後續分析。試驗採完全隨機設計，每處理 3 重複，每重複 1 株植株。

另外，將持續培養在磷肥充足環境 (+Pi, 500 μM KH₂PO₄) 145 天達開花結果階 段的‘Micro-Tom’番茄進行不同天數的磷肥處理，包括磷肥充足 (+Pi, 500 μM KH₂PO₄) 與缺乏 (-Pi, 0 μM KH₂PO₄) 處理 5 天 (+Pi5D 及-Pi5D)、10 天 (+Pi10D 及-Pi10D)、15 天 (+Pi15D 及-Pi15D)、20 天 (+Pi20 及-Pi20D) 後收取植物材料。

缺磷逆境 10 天後進行磷肥恢復處理 5 天 (Re5D) 及 10 天 (Re10D) ，同樣收取植

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物材料進行後續分析。試驗採完全隨機設計，每處理 3 重複，每重複 1 株植株。

二、 農桿菌滲入法與農桿菌注射法

(一) 載體構築與農桿菌轉殖

TPSI1 promoter:GUS (圖 3a)、35S promoter:GUS (圖 3b)、與 35S promoter:LUC (圖 3c) 之構築皆由中央研究院邱子珍老師提供。35S promoter:GUS 並不需要構築，

直 接 利 用 pCambia 1301 當 載 體 。 TPSI1 promoter:GUS 的 構 築 是 先 以 5‘-gaacaacacttggcgaataca-3’與 5’-ccctaaaagttggtggcaaa-3’兩引子進行 PCR 獲得 1,561 bp 產物，將該 PCR 產物送入 pGEM-T easy vector (Promega) 並定序後，利用 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaagctatgcatccaacgcg-3’ 與 5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccgacgtcgcatgctcccggc-3’兩引子進行 PCR 得到 attB1 與 attB2 site，再利用 Gateway® Technology (Invitrogen) 進行 BP 與 LR recombination，

其 中 BP recombination 所 用 之 pDONR^TM vector 是 使 用 pDONR221 ， LR recombination 所用之 destination vector 是 pMDC164。而 35S promoter:LUC 的構築 則是利用限制酶 (restriction enzyme) NcoI 和 SacI 將 Luciferase 基因由 pJD301 載體 切下， 另外將 pCambia 1302 利用 NcoI 和 Pml 限制酶進行切割，最後利用連接酶 (Ligase) 將兩者接合 (ligation) 在一起。

上述載體同時都轉殖至農桿菌 C58C1 與 1D1249 品系。農桿菌 C58C1 品系由 中央研究院邱子珍老師實驗室提供，農桿菌 1D1249 品系由 Michelmore 實驗室 (University of California, Davis) 提供。轉殖方式主要分為勝任細胞 (competent cell) 製作與轉殖 (transformation)，勝任細胞製作過程為培養農桿菌 C58C1 與 1D1249 品系在 5 mL YEP 培養液 (Bacto-peptone 10 g L^-1; Yeast extract 10 g L^-1; NaCl 5 g L^-1) 於 28 ℃恆溫震盪器 (LM-570RD, YIH-DER) 震盪 (轉速 200 rpm) 培養 16 hr 後，

將菌液加入 100 mL YEP 培養液中至 O.D.₅₅₀=0.5~0.8，於 5,000 rpm, 4 ℃下離心 10

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分鐘沈澱農桿菌，去除上清液後利用 TE buffer (10 mM Tris; 1 mM EDTA) 清洗農 桿菌殘留之鹽類，加入 10 mL YEP 培養液並混合均勻，每管凍菌管分裝 500 μL，

利用液態氮瞬間冷凍後保存於-80 ℃冰箱 (Forma 900 Series, Thermo Scientific)。在 進行農桿菌轉殖前，需先抽取質體 DNA (plasmid DNA)，抽取方式為將帶有不同載 體 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli, E. coli)(35S promoter:GUS in DH5α 、 TPSI1 promoter:GUS in Top10、35S promoter:LUC in Top10)培養在 LB 培養液，於 37 ℃ 恆溫震盪器震盪 (轉速 200 rpm) 培養 16 hr 後，利用 Plasmid DNA Extraction System (Cat.#GF2001, Viogene) 進行質體 DNA 抽取，抽取步驟參考 Viogene 公司所附流程。

轉殖過程將農桿菌 C58C1 與 1D1249 勝任細胞置於冰上退冰，加入 10 μL 目標質 體 DNA，於冰上 5 分鐘後丟入液態氮 5 分鐘，再於 37 ℃水浴 5 分鐘後加入 1 mL YEP 培養液，於 28℃恆溫震盪器震盪 (轉速 200 rpm) 培養 2~4 hr 後，取 100 μL 菌液加 100 μL YEP 培養液混合均勻，塗盤至 YEP 培養基 (Bacto-peptone 10g L^-1; Yeast extract 10 g L^-1; NaCl 5 g L^-1; Bato-agar 1.5 %;含抗生素 Kanamycin 50 mg L^-1、 Rifampicin 50 mg L^-1)，於 28 ℃恆溫震盪器培養 2 天。

(二) 農桿菌滲入法方式

試驗步驟參考前人研究 (Liu et al., 2010; Liu et al., 2012; Orzaez et al., 2006a;

Wroblewski et al., 2005)。大抵流程是將已完成轉殖之 1D1249 及 C58C1 農桿菌以 YEP 培養液配合恆溫震盪器在 28 ℃震盪 (轉速 200 rpm) 培養 16 hr 後，再移至含 10 mM MES, 20 uM AS (Acetosyringone) 之 YEP 液態培養基中，再震盪培養 5～7 hr。

利用全波長光度計 (U-5100, Hitachi) 測量 O.D.600 之讀值 (一般約略會等於 1)，

再以離心機 (Hermle) 於 5,000 rpm, 4 ℃下離心 10 分鐘沈澱農桿菌，並利用注射 液

[

10 mM MgCl₂, 10 mM MES (pH5.6), 100 μM AS

]

將其濃度稀釋至 O.D.600=1、

0.5、0.25、0.125、0.0625 (圖表中沒特別註明時則為 O.D.600=1)，稀釋後菌液放置 於黑暗下 3 小時後利用沒有針頭的針筒 (Terumo) 以手指施壓的方式將農桿菌滲

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入番茄、菸草、青椒、茄子、辣椒葉片的下表皮中。為了試驗磷元素缺乏與 TPSI1 promoter 表現量之關係，詳細植株進行缺磷處理時間與農桿菌滲入菸草的時間如圖 4 所示。在專一性測定上，植株進行不同營養元素缺乏處理時間與農桿菌滲入菸草 葉片的時間如圖 5 所示。農桿菌滲入後 3 天，收集注射過農桿菌的植物組織，部 分材料直接進行 GUS 染色，其餘材料經液態氮處理後保存於-80 ℃冰箱供後續分 析使用。

(三) 農桿菌注射法方式

農桿菌培養方法與農桿菌滲入法相同，注射方式參照前人研究 (Orzaez et al., 2006)。詳細方式為事先標記番茄花朵自然授粉時間，之後挑選授粉後約 15 天大之 綠熟果進行試驗，以帶有針頭之針筒 (Terumo) 將農桿菌由番茄果梗以注射的方式 滲入整顆果實中。詳細植株進行缺磷處理時間與農桿菌注射入番茄果實時間如圖 6 所示。農桿菌注射後 3 天，同樣收取注射的植物組織，部分材料直接進行 GUS 染 色，其餘材料經液態氮處理後貯存於-80 ℃冰箱供後續分析使用。

三、 調查項目與分析方法

(一) 植物組織鮮重

不同時間點採收之試驗植物將之分為根與地上部，地上部直接以天平 (XS204, Mettler Toledo) 秤量各組織鮮重，根部則需先以紙巾吸乾多餘水分後再秤重。

(二) 葉綠素螢光計

待測植物葉片利用鋁箔紙包覆，黑暗馴化 30 分鐘後利用葉綠素螢光計 (Pocket PEA, Hansatch) 測量成熟展開葉之葉綠素螢光讀值。

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(三) 葉綠素含量測定

植物組織先以均質機 (SH-100, KURABO) 與液態氮在低溫下將樣品研磨成 粉，秤取約 100 mg 研磨後粉末加入 6 mL 95% 乙醇 (Ethanol)，以水浴槽 (BU-410D, YIH-DER) 於 68 ℃下加熱 2 小時，於室溫下以 5,000 rpm 離心 10 分鐘後分別測 定 O.D.665、O.D.649、O.D.470 之吸光值。再以下列公式換算求得葉綠素 a、葉綠 素 b 濃度：

Ca (葉綠素 a) =13.95A665-6.88A649

Cb (葉綠素 b) =24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅

求得色素濃度後，再按下式計算單位鮮重組織中各色素的含量：

葉綠體色素的含量 (mg/g)＝[色素的濃度 (mg/L)×萃取液體積 (L)] / 樣品鮮重 (g) 最後將葉綠體色素 a 的含量與葉綠體色素 b 的含量加總即是總葉綠素含量。

(四) 植體無機磷濃度測定

秤取上述研磨後粉末 (葉片及根秤取約 30 mg 粉末，果實以混合 3 顆果實粉末 後秤取約 100 mg 粉末)，參考前人研究方式 (Ames, 1966; Chiou et al., 2006) 進行 無機磷濃度測定。方法為每 1 mg 鮮重的組織溶解在 10 μL 的 1%冰醋酸 (Glacial acetic acid) 溶液中，震盪均勻後於 13,000 rpm 轉速下離心 10 分鐘，取 10 μL 的上 清液置於 96 孔盤 (Basic Life) 並加入 50 μL 1%冰醋酸，混合均勻在 42 ℃下培養 30 分鐘，之後加入 140 μL 磷分析液 (0.35 % NH₄MoO₄、0.86 N H₂SO₄、1.4 % ascorbic acid)，充分混合後於 42 ℃下培養 30 分鐘。同時以 KH2PO4作為標準品繪 製 標 準 曲 線 。 最 後 以 全 波 長 微 量 光 度 計 (EnSpire Multimode Plate Readers, PerkinElmer) 測定 820 nm 波長下的吸光值。

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(五) GUS 定性分析

GUS 定性實驗步驟參考 Jefferson 等人的方法 (Jefferson RA, 1987) 再略作修 正 。 GUS 定 性 分 析 緩 衝 劑 配 方 略 作 修 正 如 下 ： 0.15 % X‐gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic Acid) 以 1.25 % DMSO (Dimethyl sulfoxide)溶解 X‐gluc 粉劑，加入目標體積一半的水後依序加入 100 mM Phosphate buffer、10 mM Na2EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate)、

0.5 mM K3Fe(CN)6 (Potassium Hexacyanoferrate III)、0.5 mM K4Fe(CN)6 (Potassium Hexacyanoferrate II)、0.1 % Triton X-1000 (Octyl Phenol Ethoxylate)、10 % Methanol，

最後利用去離子水 (Deionized water) 定量至目標體積。將植物葉片組織以刀片切 下約 10 mm*10 mm 的葉片組織浸泡於上述緩衝液中，利用真空幫浦 (Rocker 610) 於 90 kpa 下抽真空 1 分鐘，置至 37 ℃染色 2 hr，最後以 75 %酒精褪染後觀察 GUS 染色情形。果實組織以刀片切下約 3mm 厚的果實組織浸泡於上述緩衝液中，利用 真空幫浦於 90 kpa 下抽真空 3 分鐘，置至 37 ℃染色 13 hr，最後以 75 %酒精褪染 後觀察 GUS 染色情形。

(六) GUS 定量分析

GUS 定量實驗步驟參考前人方法 (Jefferson RA, 1987; Spolaore et al., 2001)。

GUS 定量分析分為組織螢光值測定與蛋白質含量測定。利用天平秤取約 200 mg 上 述研磨後粉末，加入預冷過之 GUS extraction buffer 包含 0.1 M Potassium phosphate buffer、1 mM Na2EDTA、10 % Glycerol、7 mM ß-mercaptoethanol、0.1 % Triton X-100、

2 % Polyvinylpyrrolidone (cross linked)。樣本粉末與 GUS extraction buffer 混合均勻 後於 4 ℃下離心 (10,000 rpm) 15 分鐘，取上清液再次於 4 ℃下離心 (10,000 rpm) 15 分 鐘 ， 將 上 清 液 置 於 96 孔 黑 盤 (NUNC) ， 加 入 受 質 10mM MUG (4-methlyumbelliferyl-ß-D-glucuronide trihydrate)於 37 ℃下作用 0、10 及 20 分鐘後

26

加入 0.2 M Na2CO3終止反應。以 4-MU (7-hydroxy-4-methylcoumarin) 作為標準品 繪製標準曲線。待測樣品以微量分光光度計 (i-control, Tecan) 於 excitation=355 nm、

emission=460 nm 條件下測定螢光值。

蛋白質含量測定方法則是將上述離心後樣本取4μl 之上清液置於 96 孔盤，再 加入 156 μL 之去離子水與 40 μL Protein assay dye reagent (Bio-Rad) 後，於 37 ℃ 下作用 30 分鐘，以微量光度計 (i-control, Tecan) 測定波長 595 nm 下之吸光值。

以 BSA (Bovine serum albumin) 當標準品繪製標準曲線。GUS 的濃度以(反應時間 內組織螢光差值/反應時間)/蛋白質含量公式計算。

(七) Luciferase 定量表現分析

螢 火 蟲 冷 光 蛋 白 (Luciferase) 定 量 分 析 以 Luciferase Assay System kit (Promega) 進行分析。實驗步驟參考 Promega 公司所附流程略做修改，方法為取 5 μL 上述溶於 GUS extraction buffer 且經離心後之樣本置入 96 孔白盤 (Microlon)，

加入 90 μL GUS extraction buffer，再加入 25 μL Luciferase Reagent，利用微量光度 計 (i-control, Tecan) 測定冷光下之吸光值。

(八) 花青素相對含量測定

花青素含量測定參考前人方法 (Lange et al., 1971)，步驟為秤取上述研磨後粉 末約 200 mg，加入 1 mL 萃取液 (Propanol:HCl:H2O = 18:1:81)，放入 95 ℃水浴槽 加熱 1.5 分鐘後迅速地插在冰上至少 3 分鐘，以 13,000 rpm 轉速離心 5 分鐘，取上 清液 200 μL 置入 96 孔盤，利用全波長微量光度計 (EnSpire Multimode Plate Readers, PerkinElmer) 測定 535 nm、650 nm 波長下的吸光值。兩種吸光值之數值帶入下列 公式

[

A535-(2 A650)

]

/鮮重，即可計算出花青素相對含量。

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(九) 可溶性固形物測定

‘Micro-Tom’番茄依照不同處理的時間點採收，每株採 6 顆果實，根據重量加 入一倍體積的去離子水，利用研缽研磨成泥，使用糖度計 (Pocket Refractometer PAL-1, Atago) 測得果實糖度，單位為 ^∘Brix。

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表 1. 本試驗所用之水耕養液配方

Table 1. Hydroponic nutrient recipes in this research.

Stock no. Macronutrients Molecular weight Stock concentration (M) Final concentration (mM)

Ⅰ Ca(NO₃)₂．4H₂O 236.15 1.00 2.50

KNO₃ 101.11 1.00 2.50

Ⅱ MgSO₄．7H₂O 246.48 1.00 1.00

Ⅲ NaFe EDTA 367.10 0.10 0.05

Ⅳ KH₂PO₄ 136.09 1.00 0.50

Stock no. Micronutrients Molecular weight Stock concentration (mM) Final concentration (μM)

Ⅴ

H3BO3 61.83 10.00 10.00

Na2MoO4．2H₂O 241.95 0.20 0.20

ZnSO₄．7H₂O 287.50 1.00 1.00

MnCl₂．4H₂O 197.90 2.00 2.00

CuSO4．5H2O 249.70 0.50 0.50

CoCl2．6H2O 237.90 0.20 0.20

HCl 36.46 25.00 25.00

Ⅵ MES 213.24 500.00 500.00

Modified from Millner and Kitt, 1992 and Hoagland and Arnon, 1950.

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表 2. 不同營養元素缺乏處理之水耕養液配方

Table 2. Hydroponic nutrient recipes for treatments of different nutrient deficiency.

Element Concentrations of individual elements in various treatments (mg/L)

Macronutrients Full -N -P -K -Ca -Mg -S -Fe

N 105.00

0.00

105.00 105.00 105.00 105.00 105.00 105.00

P 15.50 15.50

0.00

15.50 15.50 15.50 15.50 15.50

K 117.00 117.00 117.00

0.00

117.00 117.00 117.00 117.00 Ca 100.00 100.00 100.00

150.00 0.00 150.40

100.00 100.00 Mg 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00

0.00

24.00 24.00

S 32.05 32.05 32.05 32.05 32.05

72.37 0.00

32.05

Micronutrients Full -N -P -K -Ca -Mg -S -Fe

Fe 2.80 2.80 2.80 2.80 2.80 2.80 0.10

0.00

Cl 1.04

267.29 18.79

1.04 1.04 1.04

72.04

1.04

Mn 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.00 0.17

B 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.03 0.11

Zn 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.00 0.07

Cu 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.00 0.03

Mo 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.00 0.03

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圖 1. 水耕番茄栽培期間之溫室氣象資料

Figure 1. The meteorological data in greenhouse during hydroponic culture of tomato.

圖 2. 番茄、青椒、辣椒與茄子栽培期間之溫室氣象資料

Figure 2. The meteorological data in greenhouse during soil culture of tomato, bell pepper, hot pepper and eggplant.

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圖 3. (a) TPSI1 promoter: GUS (b) 35S promoter: GUS (c) 35S promoter: Luc 之載體構 築

Figure 3. Maps of (a) TPSI1 promoter: GUS, (b) 35S promoter: GUS and (c) 35S promoter: Luc constructs.

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圖 4. 菸草缺磷處理與農桿菌滲入法時間

Figure 4. Time frames of Pi starvation treatments and agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.