一、苦參萃取物之製備
1.苦參水萃取物（aqueous extract）之製備
將苦參藥材600 克加 4L 的水煮沸萃取，之後過濾，將濾液冷凍乾燥濃縮，可 得苦參水萃取物重116 克。
2.苦參甲醇萃取物（methanol extract）之製備
將苦參1200 克經粉碎後加 8 公升的甲醇，迴流加熱二次，把溶液過濾所得濾 液經濃縮冷凍乾燥，可得苦參甲醇萃取物重224 克。
二、動物處理
1. C57BL/6J 鼷鼠（五週齡，體重 16~20g）於國立中國醫藥研究所動物室，並 給予正常的飼料與水源，有自動控制系統控制12 小時光照/12 小時黑暗，室 溫在20±2。先適應環境一週後，將苦參科學中藥（powdered concentrate）用 研磨器研磨過後溶於水中，依實驗需要分別依不同劑量或不同處理時程來處 理老鼠，用餵食管餵食老鼠，在最後一次處理24 小時後將動物犧牲，犧牲後 取出肝和腎以製備微粒體或細胞質液，建立劑量與酵素活性以及處理時程與 酵素活性之關係圖。而水萃取物及甲醇萃取物分別用研磨器研磨並溶於水 中，依實驗需要分別餵食0.1、0.5、0.75、1、3g/kg，連續餵食三天，將動物 犧牲。
2. Sprague-Dawley 大鼠（五週齡，體重 180~200g）於國立中國醫藥研究所動物 室給予正常的飼料與水源，並有自動控制系統控制12 小時光照/12 小時黑 暗。在適應環境一週後，將苦參科學中藥（powdered concentrate）用研磨器 研磨過後溶於水中，用餵食管餵食老鼠，依實驗需要分別餵食1、3 g/kg，連 續餵食三天，在最後一次處理24 小時後將動物犧牲，犧牲後取出肝和腎以製 備微粒體或細胞質液，依不同劑量與酵素活性分別說明於結果及圖表中。
三、肝微粒體（microsome）及細胞質液（cytosol）之製備
微粒體和細胞質液製備的方法是採分段離心的方法（Alvares and Mannerung, 1970），且製備全程保持於冰浴中。鼷鼠經二氧化碳迷昏後，以斷頸方法犧牲，將鼠 肝和腎於1.15％ KCl 中漂洗三次後，清除結締組織、血塊及脂肪，並以吸水紙吸去
多餘的水分，給予秤重。將組織剪碎，加入1.15％KCl 溶液於細胞研磨機（teflon pestle-glass homogenizer）中來回均質研磨六次，倒入高速離心管兩管兩管平衡後在 4℃以下以 9,000×g 離心 20 分鐘後，取得含微粒體沉澱及細胞質液之上清液，將上清 液移置於超高速離心管中兩兩平衡，在4℃以下以 10,000×g 離心 1 小時後，取得微粒 體沉澱及細胞質上清液。收集細胞質液，將剩下微粒體沉澱加1.15％ KCl，再均質 一次，倒回超高速離心管後兩兩平衡，在4℃以下以 10,000×g 離心 1 小時後，取得微 粒體（wash microsome），上面覆以 0.1 M 磷酸鉀緩衝溶液（pH 7.4），保存於-75℃冷 凍冰箱，並於二周內完成藥物代謝酶活性測定。
四、蛋白質含量之定量
微粒體及細胞質液蛋白含量之測定，沿用Lowry（1951）等人之方法，以 0.1、
0.2、0.3 及 0.4 mg/ml之牛血清蛋白（BSA）做為標準品，標準品與經水稀釋之微粒體 或細胞質液均加入 2 ml copper溶液（2％ Na2CO3/0.1N NaOH：1％ CuSO4‧5H2O：
2％ Na-K Tartrate＝100：1：1），混合均勻置室溫 10 分鐘後，加入 0.2 ml 1N
Folin-Ciocalteu，s phenol 試劑，均勻混合後放置室溫 30 分鐘後，記錄在 750 nm之吸 光值，所有蛋白質含量之測定須在30 分鐘內測定完成。利用標準品濃度與其吸光值 作回歸直線來求得微粒體與細胞質液之蛋白質含量。
五、單氧酶組成分子含量或活性測定 1. P450 含量之測定
沿用 Omura 及 Sato（1964）之一氧化碳差異光譜法。製備 2 ml 約含 1.0~1.25 mg蛋白質之鼠肝及腎微粒體懸浮液，加入約為 1mg之硫代硫酸鈉（Na2S2O4） 予以還原，分別分裝 1 ml樣品至參考比色槽與樣品比色槽，將光譜儀自 350~550
nm作基準線校正，完成後將樣品比色槽取出，緩慢注入一氧化碳 20 秒，放回 樣品比色槽，掃瞄並紀錄波長450 nm附近最大吸收波長與波長 490 nm時之吸 光值差，其吸光係數91 mM-1cm-1，以計算CYP含量。
2.Cytochrome b5含量之測定
沿用 Omura 及 Sato（1964）之方法。將 1 ml 約含 1mg 微粒體蛋白量之鼠 肝微粒體懸浮液，置於參考比色槽與樣品比色槽，將光譜儀自 350~550 nm 作 基準線校正，完成後將樣品比色槽取出，加入 35.3 nM NADH，混合均勻後放
回光譜儀中，掃瞄並紀錄波長最大吸收波長與最小吸收波長時之吸光值差，其 吸光係數 185 mM-1cm-1，以計算cytochrome b5含量。
3.NADPH-P450 reductase 活性之測定
沿用Phillips及Langdon（1962）之方法，使用 cytochrome c當作受質。反 應總體積為 1.2 ml，其中含 0.02~0.04 mg鼠肝與腎之微粒體蛋白，0.6 M磷酸 鉀溶液（pH 7.7），0.2 mM EDTA，5.13 mg/ml cytochrome c，混合均勻後將光 譜儀自動歸零，再分別於參考與樣品比色槽中加入等量之二次去離子水與 0.1mM NADPH 溶液，混合後開始紀錄室溫下 2 分鐘內波長 550 nm之吸光值 變化，其吸光係數21 mM-1cm-1及單位時間內吸光值之變化計算還原cytochrome c之活性。
六、單氧酶活性之測定 1. EROD 之活性測定
沿用 Pohl 及 Fouts（1980）之方法，使用蛋白質含量 0.05~0.1 mg 之肝微 粒體懸浮液或使用 0.2~0.4 mg 腎微粒體懸浮液，反應總體積為 1 ml，反應溶 液含 0.13 M Hepes buffer（pH7.8），6.4 mM G6P，0.14 mM NADP，0.25 單位 G6PDHase，1.8μM 7-ethoxyresorufin。在 37℃恆溫水浴槽中避光反應 10 分鐘 後，加入2.5 ml methanol 終止反應，再以 560×g 離心 15 分鐘去除蛋白質沉澱 後，使用螢光光譜儀讀取上清液，以波長550 nm 為激發波長，585 nm 為放射 波長時之螢光強度，並以0.01μM 及 0.1μM Rhodamine B 的螢光強度來比較，
以求得此酶反應活性。
2. PROD 之活性測定
沿用Lubet（1985）之方法，使用蛋白質含量 0.3~0.6 mg之肝微粒體懸浮 液或使用0.2~0.4 mg腎微粒體懸浮液，反應總體積為 1 ml，反應溶液含 0.1 M MgCl2，0.05 M Tris buffer（pH7.5），6.4 mM G6P，0.14 mM NADP，0.2 單位 G6PDHase，10.6μM 7- pentoxyresorufin。在 37℃恆溫水浴槽中避光反應 10 分 鐘後，加入2.25 ml methanol終止反應，再以 560×g離心 15 分鐘去除蛋白質沉 澱後，使用螢光光譜儀讀取上清液，以波長522 nm為激發波長，586 nm為放 射波長時之螢光強度，並以0.01μM及 0.1μM Rhodamine B的螢光強度來比 較，以求得此酶反應活性。
3. Coumarin hydroxylation 之活性測定
沿用 Souček（1999）之方法，使用蛋白質含量 0.03~0.06 mg之肝微粒體 懸浮液，反應總體積為0.5 ml，反應溶液含 0.05 M磷酸鉀溶液（pH7.4），0.5 mM NADP，5.0 mM G6P，0.1 M MgCl2，0.02 mM coumarin，0.5 單位G6PDHase。
在 37℃恆溫水浴槽中反應 20 分鐘後，加入 0.3 M HClO4終止反應，移置離心 管以8,000×g離心 2 分鐘，離心後取出上清液等待分析。以HPLC的方法分析 coumarin的代謝產物，使用C18 column，以 20％ acetonitrile/20 mM NaClO4
（pH2.5），流速 1 ml/min分析代謝產物，紀錄在紫外光波長 272 nm，螢光激 發光（Ex）338 nm和放射光（Em）458 nm波長時之積分面積，使用其 7-OH coumarin 代謝產物之標準品，以計算活性。
4. TOH 之活性測定
沿用 Yamazaki及 Shimada（1997a）與 Knodell（1987）等人之方法，使 用蛋白質含量0.0125 mg之肝微粒體懸浮液，反應總體積為 0.5 ml，反應溶液 含0.13 M磷酸鉀溶液（pH7.4），1.3 mM NADP，25 mM G6P，1 mM tolbutamide，
0.25 單位G6PDHase。在 37℃恆溫水浴槽中反應 15 分鐘後，加入 25μl 1N HCl 和 1.5 ml CH2Cl2終止反應，以560×g離心 5 分鐘，離心後取出 1 ml有機層置 於微量離心管中，以氮氣吹乾，等待分析。以HPLC的方法分析tolbutamide的 代謝產物，使用C18 column，以 36％(V/V) acetonitrile和 60%(V/V)0.04％
H3PO4，流速 1 ml/min分析代謝產物，紀錄在波長 230 nm時之積分面積，使用 其4-OH tolbutamide 代謝產物之標準品，以計算活性。
5. NDM 之活性測定
沿用 Greenlee及 Poland（1978）與 Nash（1953）之方法以呈色反應測定 N-nitrosodimethylamine N-demethylation產生甲醛的活性，使用蛋白質含量 0.8~1.2 mg之肝微粒體懸浮液，反應總體積為 1.25 ml，反應溶液含 0.07M KCl，0.4 mM NADP，12.3 mM G6P，0.5 單位G6PDHase。在 37℃恆溫水浴槽 中反應15 分鐘後，加入 1ml 2.2M ZnSO4，在 37℃恆溫水浴槽中震盪 5 分鐘 後，加入1ml 飽和的Ba（OH）2溶液，再在37℃恆溫水浴槽中震盪 5 分鐘，
將混濁液體以15,000×g離心 10 分鐘後，取出 1 ml加到 0.6 ml Nash試劑中，均 勻混和後在60℃恆溫水浴槽中反應 15 分鐘。反應後冷卻至室溫，使用光譜儀 讀取波長412 nm之吸光值，以formaldehyde 為標準品以計算活性。
6. NFO 之活性測定
沿用 Guengerich等人（1986）之方法，使用蛋白質含量 0.01 mg之肝微粒 體懸浮液，反應總體積為0.5 ml，反應溶液含 0.04 M磷酸鉀溶液（pH7.85），
0.54 mM NADP，0.01M G6P，12.3 mM MgCl2，0.25 單位G6PDHase及 0.5 mM nifedipine。在 37℃恆溫水浴槽中反應 15 分鐘後，加入 0.1 ml 1M Na2CO3/1M NaCl和 1 ml CH2Cl2終止反應，以200×g離心 5 分鐘，離心後取出 0.5 ml有機 層置於棕色微量離心管中，以氮氣吹乾，等待分析。以HPLC的方法分析 nifedipine的代謝產物，使用C18 column，以 55％ methanol，流速 1 ml/min分 析代謝產物，紀錄在波長254 nm時之積分面積，使用其pyridine代謝產物之標 準品，以計算活性。
七、結合酶活性之測定 1. GST 活性之測定
沿用Habig（1981）等人之方法，以 1-chloro-2,4-dinitrobenzene為受質來進 行反應。反應溶液含之肝細胞質液蛋白，0.1 M CDNB及 1 M磷酸鉀緩衝溶液
（pH6.5）。在室溫下，將反應液以光譜儀自動歸零，再分別於參考與樣品比色 槽中加入等量之二次去離水與150 mM GSH混和後開始紀錄 2 分鐘內波長 340 nm之吸光值變化，以吸光係數為 9.6 mM-1cm-1，以計算GST活性。
2. NQO 活性之測定
沿用Liu（1989）等人之方法，以menadione為受質，在弱光中進行反應。
反應溶液含0.2 mM NADH，16 mM menadion及 100 mM磷酸鈉緩衝溶液
（pH7.4）。在室溫下，將反應液以光譜儀自動歸零，在樣品比色槽中加入 0.1~0.2 mg之肝細胞質液或 0.06~0.08 mg腎肝細胞質液蛋白混和後開始紀錄 2 分鐘內波長340 nm之吸光值變化，以吸光係數為 6.2 mM-1cm-1，以計算 NAD(P)H-quinone oxidoreductase活性。
3. UGT 活性之測定
沿用Bock（1983）等人之方法，以p-nitrophenol為受質，在弱光中進行反 應。使用蛋白含量0.1 mg之肝微粒體懸浮液或 0.25 mg腎微粒體懸浮液，反應 總體積為0.5 ml，反應溶液含 0.1 M Tris-HCl(pH7.4)，5 mM MgCl2，0.01％(V/V) Triton X-100，3 mM UDP-glucuronic acid，0.6 mM p-nitrophenol。在 37℃水浴
槽中反應10 分鐘後，加入 1 ml 5％(W/V) trichloroacetic acid 以終止反應。將 此混合液轉置棕色微量離心管中，以1,500×g離心 15 分鐘已沉澱蛋白質。離心 後取上清液1ml加入 0.25 ml 2N NaOH中，混合均勻後，紀錄空白與樣品組在 波長405 nm的吸光值，得樣品組因結合反應而降低之吸光值，最後以吸光係 數18.1 mM-1cm-1計算活性。
八、免疫轉印分析（Immunoblot）
本實驗沿用 Laemmli（1970）之非連續性電泳（discontinuous electrophoresis）方 法，使用stacking gel 及 separation gel 來進行十二烷基硫酸納（sodium dodecyl sufate, SDS）-聚丙烯醯（polyacrylamide）膠體電泳。將 Tris-HCl 緩衝溶液、acrylamide、
Bis- acrylamide 和 SDS 均勻混和後，以抽氣幫浦去除液體中的氣體，再加入 10％
ammonium persulfate 和 TEMED 催化 acrylamide 的聚合反應。其中 7.5％ separation gel 分離CYP2B 及 CYP3A，而 10％和 12％ separation gel 則分別分離 CYP1A 及 GST。
樣品處理過程是將微粒體在含 1.25 M Tris-HCl 緩衝溶液（pH6.8）、20％ SDS、
樣品處理過程是將微粒體在含 1.25 M Tris-HCl 緩衝溶液（pH6.8）、20％ SDS、