以上實驗結果顯示，TRIM5α 能促進 BORF1 K63-linked 泛素化修飾，使得 BORF1 被 p62 辨認，因此後續實驗將繼續探討 BORF1 是否會由 p62 帶往選擇性 自 噬 作 用 降 解 途 徑 。 在 293T 細 胞 中 轉 染 質 體 pFlag-BORF1 、 pHA-Ub 或 pHA-Ub-K63，隔日加入 60 µM chloroquine 或對照組 H2O 作用 16 小時後收取細胞，
以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱，後利用抗 HA 抗體進行西方點墨法分析。結
果顯示，在以chloroquine 處理的組別中，LC3B-II 的表現量較未加藥的控制組高 (圖 12, Input, lanes 4-6)，顯示 chloroquine 抑制了溶酶體的活性，導致自噬體的累積。
在細胞中共同表現pFlag-BORF1 與 pHA-Ub 或 pHA-Ub-K63 時，能偵測到 BORF1
的泛素化修飾 (圖 12, IP, lanes 2, 3, 5, 6)。比較以 chloroquine 處理的組別與未加藥
響。在293T 細胞中轉染 pEGFP-C2-BORF1，隔日加入 60 µM chloroquine 或對照 組H2O 作用 16 小時後收取細胞，以抗 p62 抗體進行螢光免疫分析。結果顯示，相 較於未加藥處理的組別 (圖 11, f-j)，以 chloroquine 處理後的細胞能觀察到在細胞 內點狀分布的p62 增加，且 p62 與 BORF1 共同分布的情形更為明顯 (圖 11, k-o)，
顯示抑制溶酶體活性會累積與BORF1 結合的 p62 蛋白質。
在確認BORF1 會與 p62 結合並透過溶酶體降解後，本研究接著觀察 p62 是否 直接影響 BORF1 的蛋白質表現量。在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、
pFlag-BORF1-K114R 與 p62 shRNA D1-1 和 E1-1 或控制組 Ct-shRNA，培養 24 小 時後再次轉染 shRNA D1-1 和 E1-1 或控制組 Ct-shRNA，隔日收取細胞以抗 Flag 抗體進行西方點墨法偵測。實驗結果顯示，轉染 shRNA D1-1 和 E1-1 的組別 p62
蛋白質表現量明顯受到抑制 (圖 14, lanes 2, 4)，而相較於控制組 Flag-BORF1 表現 量明顯上升 (圖 14, lanes 2, 4)，顯示 p62 會造成 BORF1 的的蛋白質表現量下降。
討論
本實驗室先前研究顯示，若將 TRIM5α 的 SIM domain 突變會使其無法促進 8)。此外本研究進一步實驗發現 BORF1-K114R 與 TRIM5α 的結合量較正常的 BORF1 還要高，顯示此 lysine 突變並不影響 BORF1 與 TRIM5α 之間的結合 (圖 結合並穩定TRIM5α (O'Connor et al, 2010)，因此推測 BORF1 在經過 TRIM5α 催化
泛素化修飾後，可能會被 p62 專一性辨認並走向自噬作用降解途徑。本研究首先
觀察到p62 與 BORF1 在細胞內結合，且若同時表現 TRIM5α 能觀察到 p62 會結合
受轉譯後修飾的 BORF1，推測其應為受 K63 鍵結長鏈泛素化修飾的 BORF1。此
外，在實驗結果中也可以觀察到p62 會與沒有經過泛素化修飾的 BORF1 蛋白質結
合，顯示期間可能有直接結合關係 (圖 10A)，而 p62 是透過什麼功能區與 BORF1
為chloroquine 的處理而增加，顯示抑制溶酶體活性能增加 BORF1 的蛋白質穩定性 (圖 12)。此外，chloroquine 亦能造成 p62 與 BORF1 的結合量上升 (圖 13)、在細 胞內更明顯的共同分布 (圖 11)，證明 BORF1 會透過選擇性自噬作用途徑降解，
若抑制溶酶體的活性會導致BORF1 維持在與 p62 結合的狀態。
本實驗室先前研究觀察到TRIM5α 會降低 BORF1 的穩定性 (徐詩媁, 2013)，
同時過去文獻中指出p62 會與 TRIM5α 結合並增加其穩定性 (O'Connor et al, 2010)，
顯示p62 可能幫助 TRIM5α 來降解 BORF1。本研究發現抑制細胞內 p62 表現會導 致BORF1 表現量上升 (圖 14)，證明 p62 會降低 BORF1 的穩定性，推測其作用機
制可能是透過將BORF1 帶到自噬體中透過溶酶體活性分解，或是 p62 可能間接以
穩定TRIM5α 的方式使 BORF1 表現量下降。
TRIM5α 做為選擇性自噬作用的自噬受體
近期研究指出 TRIM 家族蛋白質能調控自噬作用，且 TRIM5α 具有 LIR 功能 區，能與Atg8 (GABARAP) 蛋白質結合，做為 ULK1 與 Beclin 1 的結合平台，幫 助自噬作用起始。此外同篇研究也顯示，TRIM5α 能透過 C 端 B30.2 功能區直接辨
認反轉錄病毒蛋白質p24，並透過選擇性自噬作用使其降解，顯示 TRIM5α 也能做
為選擇性自噬作用的受體 (Mandell et al, 2014) (附錄 6)。未來研究可以建立 TRIM5α LIR 突變之質體，觀察缺乏 LIR 功能區的 TRIM5α 是否喪失影響 BORF1 穩定性的能力，或觀察RING 功能區突變的 TRIM5α 是否仍能使 BORF1 降解，藉 此釐清TRIM5α 是否可做為自噬受體將 BORF1 送入自噬體降解。
TRIM5α 瓦解 EB 病毒外鞘殼體結構
本實驗先前研究中利用 P3HR1 收集胞外病毒顆粒，在去除外套膜後觀察
TRIM5α 對病毒外鞘殼體泛素化修飾的影響，結果顯示 TRIM5α 的存在會增加病毒 外鞘殼體的泛素化修飾 (徐詩媁, 2013)。EB 病毒組裝好的外鞘殼體中，VCA 蛋白 質能與BFRF3、BDLF1 以及 BORF1 直接結合，然而 BFRF3 與 BDLF1 或 BORF1 則沒有直接的結合 (Wang et al, 2011)。基於以上原因，未來可利用 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)，在 96 孔盤上固定抗 BFRF3 抗體以抓下病毒
外鞘殼體，後利用抗 BORF1 或 BDLF1 抗體偵測病毒外鞘殼體組裝量。未來實驗
可以使用抑制TRIM5α 或 p62 表現的 P3HR1 細胞株，運用上述 ELISA 技術，分析 是否干擾病毒外鞘殼體的組裝。
綜合本以上結果，本研究發現TRIM5α 可能透過選擇性自噬作用影響 EB 病毒
外鞘蛋白質的穩定性，且p62 對 EB 病毒的溶裂期發展可能也有重要的影響。綜合
本研究與實驗室先前的實驗證據，希望在未來能夠釐清TRIM5α 是否確實能與 p62
偕同作用，透過選擇性自噬作用造成組裝好的病毒外鞘殼體瓦解，降低病毒顆粒
的產量。本研究結果有助於了解宿主抑制EB 病毒溶裂期進展的機制，期能運用於
EB 病毒相關疾病的治療。
圖表
圖 1、EB 病毒的結構
EB 病毒攜帶的遺傳物質為的線性雙股 DNA，由內至外依序由外鞘 (capsid)、間 質 (tegument) 及外套膜 (envelope) 所包覆，而外套膜上嵌有病毒的膜蛋白質。
圖 2、TRIM5α 的功能區
TRIM5α 的蛋白質組具由 N 端到 C 端依序有 RING、B-box、coiled-coil 及 B30.2 (SPRY) 功能區。RING 功能區使其具有泛素 E3 連接酶的角色，此外 RING 功能 區雙體化偕同 B-box 與 coiled-coil 功能區能幫助 TRIM5α 形成高度聚合晶格結構 (higher-order self-association oligomers)。C 端的 B30.2 (SPRY) 功能區則能結合目 標蛋白質，在不同物種間具有特異性。
圖 3、TRIM5α 限制反轉錄病毒的機制
當反轉錄病毒核心進到細胞內時，TRIM5α 會與病毒的外鞘殼體結合，並利用其 泛素E3 連接酶活性促使病毒的外鞘蛋白質前往 proteasome 或自噬作用途徑降解，
導致病毒外鞘殼體提早解體而抑制反轉錄作用進行。此外TRIM5α 能透過與病毒
的preintegration complex (PIC) 結合，使得其無法進入細胞核進行嵌合作用，因 而限制病毒的感染。
圖 4、p62/SQSTM1 的功能區
p62/SQSTM 的蛋白質組具由 N 端到 C 端依序有 PB1、ZZ、TBS、LIR 及 UBA 等 多個功能區。PB1 功能區則能使 p62 形成多聚體，在形成 autophagosome 的過程 中相當重要。此外，PB1、ZZ 與 TBS 功能區能與 aPKC、RIP1 kinase 及 TRAF6 等蛋白質結合，活化 NF-kB 路徑。LIR 功能區可與自噬體上的 Atg8/LC3 結合，
因而參與自噬作用。UBA 功能區可專一性地辨認 K63 鍵結長鏈泛素化修飾，將 目標蛋白質送入自噬體中降解，因此可做為選擇性自噬作用的受體。p62 也具有 入核與出核序列，能在細胞質與核間穿梭。
圖 5、Surface patch 突變對 TRIM5α 與 BORF1 結合的影響 (A) TRIM5α B30.2 功能區上的 surface patch 2 (SP2) 點突變示意圖。
(B) 在 293T 細 胞 中 同 時 轉 染 質 體 pHA-BORF1 與 pFlag-TRIM5α 、 pFlag-TRIM5α-mSP2 或控制組 pCMV-Tag2B，培養 24 小時後收取細胞，以抗 Flag
抗體膠體進行免疫沈澱，並以抗HA 抗體進行西方點墨法。
IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 6、Surface patch 突變對 TRIM5α 與 BORF1 分布位置的影響
在 293T 細 胞 中 轉 染 pHcRed-BORF1 (a-j) 與 pEGFP-TRIM5α (a-e) 或 pEGFP-TRIM5α-mSP2 (f-j)，在玻片上培養 24 小時後收下，以 DAPI 標示細胞核 位置 (a, f)。將三種顏色疊合以共軛焦顯微鏡檢視 TRIM5α 與 BORF1 在細胞內分 布的位置 (d, e, i, j)。
圖 7、Lysine 114 突變對 BORF1 泛素與類泛素化修飾的影響
(A) 在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、pFlag-BORF1-K114R 與 pcDNA3-HA 或pHA-SUMO-2，轉染隔日加入 10 µM MG132 作用 12 小時後收取細胞，接著以
抗Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱後，利用抗 HA 抗體以西方點墨法偵測。
(B) 在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、pFlag-BORF1-K114R 與 pcDNA3-HA 或 pHA-Ub，轉染後 40 小時收取細胞，以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱後，
利用抗HA 抗體以西方點墨法偵測。IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 8、Lysine 114 突變對 BORF1 穩定性的影響
(A) 在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1 與 pFlag-BORF1-K114R，轉染後 40 小時加入100 µg/ml cycloheximide (CHX)，分別於 0、150、300 分鐘後收取細胞，
以抗Flag 及抗 α-Tubulin 抗體進行進行西方點墨法分析。
(B) 將圖 (A) 中 Flag-BORF1 與 α-Tubulin 的的訊號以 Image J 軟體量化，將每個 時間點的Flag-BORF1 訊號強度除以 α-Tubulin 的訊號強度後製作成折線圖。
IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting; CHX: cycloheximide。
圖 9、TRIM5α 與 BORF1 lysine 114 突變蛋白質的結合
在293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、pFlag-BORF1-K114R 與 pLPCX-TRIM5α，
轉染後 24 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沈澱，並以抗 TRIM5α 抗體進行西方點墨法。IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 10、p62 與 BORF1 的結合
(A) 在 293T 細胞中同時轉染質體 pFlag-p62、pHA-BORF1 與 pLPCX-TRIM5α，
培養 40 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沈澱，以抗 HA 抗體進行 西方點墨法。(B) 在 293T 細胞中同時轉染質體 pFlag-BORF1、pFlag-BORF1-K114R 與pDsRed-p62，培養 24 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沈澱，以 抗p62 抗體進行西方點墨法。IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 11、p62 與 BORF1 在 293T 細胞內的分布位置
在293T 細胞中轉染 pEGFP-C2 (a-e) 或 pEGFP-C2-BORF1 (f-o)，隔日加入 60 µM chloroquine (CQ) (k-o) 或對照組 H2O (a-j) 作用 16 小時後收取細胞，以免疫螢光 染色法標定p62 (c, h, m) (一級抗體：rabbit anti-p62，二級抗體：Alexa fluor 594 anti-rabbit)，並以 DAPI 標示細胞核位置 (a, f, k)。將三種顏色疊合以共軛焦顯微 鏡檢視p62 與 BORF1 在細胞內分布的位置 (d, e, i, j, n, o)。
圖 12、抑制溶酶體活性對 BORF1 泛素化修飾的影響
在293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1 (lanes 2, 3, 5, 6)、pHA-Ub (lanes 1, 2, 4, 5) 或pHA-Ub-K63 (lanes 3, 6)，轉染隔日加入 60 µM chloroquine (CQ) (lanes 4-6) 或 對照組H2O (lanes 1-3) 作用 16 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫
沉澱，並利用抗HA 抗體進行西方點墨法。
IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 13、抑制溶酶體活性對 p62 與 BORF1 結合的影響
在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1，轉染隔日加入 60 µM chloroquine (CQ) (lanes 3, 4) 或對照組 H2O (lanes 1, 2) 作用 16 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體的
膠體進行免疫沉澱，之後以抗p62 抗體進行西方點墨法分析。
IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting。
圖 14、p62 對 BORF1 穩定性的影響
在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1 (lanes 1, 2) 與 shp62-D1-1 和 shp62-E1-1 (lane 2) 或控制組 Ct-shRNA (lane 1)，培養 24 小時後再次轉染 shp62-D1-1 和 shp62-E1-1 (lane 2) 或控制組 pLKO.1-shRNA (lane 1)，隔日收取細胞以抗 p62 抗 體、抗Flag 抗體進行西方點墨法偵測。
圖 15、TRIM5α 對 EB 病毒外鞘殼體組裝的影響
在EB 病毒進入溶裂晚期時，TRIM5α 能與病毒外鞘蛋白質 VCA 及 BORF1 結合，
並促進BORF1 的泛素化修飾。其後 p62 能藉由辨認 BORF1 上的泛素化修飾與其
結合，並將 BORF1 帶往自噬作用途徑，藉由溶酶體活性分解。此外 p62 能增加
TRIM5α 的穩定性，而 TRIM5α 也可能做為自噬作用受體直接將 BORF1 帶往自噬 體。最終 TRIM5α 能協同 p62 造成 BORF1 表現量下降，可能進一步抑制病毒外 鞘蛋白質的組裝。