自噬作用對TRIM5α調控EB病毒外鞘蛋白質BORF1的影響

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國立臺灣大學生命科學院生化科技學系碩士論文

Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science

National Taiwan University Master Thesis

自噬作用對 TRIM5α 調控 EB 病毒外鞘蛋白質 BORF1 的影響

Role of autophagy in the regulation of BORF1 of Epstein-Barr virus by TRIM5α

陳則堯 Tse-Yao Chen

指導教授：張麗冠博士

Advisor: Li-Kwan Chang, Ph.D.

中華民國 105 年 6 月

June, 2016

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致謝

碩士班這兩年經歷了非常多，總算完成了這本論文。在實驗室的這段時日除了實驗技術的磨練外，最大的收穫即是時間規劃的能力進步許多，此外兩年來也體驗了不少待人接物的道理，讓我對邁向人生下一個階段做了更充足的準備。首先要感謝我的指導教授張麗冠博士，從大學部開始就給予我良好的實驗環境與學習機會，讓我能以樂觀積極的心態從事研究。感謝劉世東博士的許多談話，使我深刻的了解從事研究應有的思維與態度。感謝口試委員張世宗博士與莊健盈博士提出的指教，使這本論文的品質得以改善。感謝實驗室的學長姊，將毫無頭緒的我一步步帶起，直到現在可以完成碩士班學業，也感謝同學與學弟妹們不斷的互相砥礪，一起度過重重關卡。感謝施妤璇小姐兩年來的關照，包辦實驗室大小事，

並不時指點我很多研究以外的哲理。此外也感謝所有實驗室外的朋友們，做為我心靈上最好的調節，為實驗室的生活增色許多。特別感謝陳俋秀的陪伴，包容我各種情緒，很慶幸我們都能順利畢業。最後感謝我的父母親與家人們，讓我在做研究的這段時間內毫無後顧之憂，能有這麼穩固的靠山是我一輩子的福氣。兩年時光或許並不算長，但在大家的幫助下我在各方面都成長了非常多，相信未來不論走在什麼道路上，碩士班的訓練都能夠幫助我解決問題，克服難關。

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中文摘要

EB 病毒 (Epstein-Barr Virus)，屬於皰疹病毒科 γ 亞科，其生活史包括潛伏期 (latency) 與溶裂期 (lytic cycle)。病毒在進入溶裂期後會大量表現病毒基因，複製遺傳物質並組裝成為病毒顆粒，此過程中外鞘殼體 (capsid) 的組裝是非常重要的步驟。BORF1 是 EB 病毒的次要外鞘蛋白質 (minor capsid protein)，能與 BDLF1 形成三聚體 (triplex) 並引導其餘的外鞘蛋白質進入細胞核內進行組裝。 Tripartite-motif 5 alpha (TRIM5α) 是反轉錄病毒的限制因子 (restriction factor)，本實驗室先前研究發現 TRIM5α 能與 BORF1 直接結合，並利用其 E3 連接酶 (E3 ligase) 活性催化 BORF1 的泛素化修飾使其穩定性下降，進而抑制病毒溶裂期的發展。本研究首先證明TRIM5α B30.2 功能區上的 surface patch 區域對其與 EB 病毒

外鞘蛋白質 BORF1 的結合相當重要。接著觀察 BORF1 泛素化修飾的情形，顯示

lysine 114 為其上重要的泛素化修飾位置，若突變會提昇 BORF1 蛋白質的穩定性。

TRIM5α 亦能催化 BORF1 的 K63 鍵結長鏈泛素化修飾，顯示其降解可能與選擇性自噬作用有關。本研究進一步發現選擇性自噬作用的受體 p62/sequestosome 1 (SQSTM1) 能透過辨認 BORF1 上的泛素化修飾而與其結合。此外，若抑制溶酶體 (lysosome) 活性則會使受泛素化修飾的 BORF1 累積，並提昇與 p62 的結合量。最後，若以siRNA 抑制細胞中 p62 的含量，則 BORF1 的表現量會上升。綜合以上結果，本研究發現TRIM5α 能與 p62 共同作用，透過選擇性自噬作用降解 BORF1。

關鍵字：Epstein-Barr Virus (EB 病毒)、外鞘蛋白質、BORF1、TRIM5α、泛素化修飾、p62、自噬作用

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Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpesvirus with two distinct life cycles, latency and lytic cycle. During the lytic cycle, it encodes proteins that are involved in viral lytic DNA replication, capsid assembly and maturation. BORF1, a minor capsid protein of EBV, forms a triplex with BDLF1 and recruits other capsids into the nucleus for capsid assembly. Tripartite-motif 5 alpha (TRIM5α) is a restriction factor with the activity of ubiquitin E3 ligase. Previous study indicated that TRIM5α binds to BORF1 and enhances its ubiquitination, thus inhibiting lytic progression. This study

demonstrated the surface patch region on B30.2 in TRIM5α is responsible for the interaction with BORF1. Moreover, lysine 114 of BORF1 is the major ubiquitination site. Mutating Lys-114 stabilizes BORF1. TRIM5α also promotes K63-linked poly ubiquitination of BORF1, which implies the possibility of involvement of autophagy in this process. This study reveals that the cargo receptor of selective autophagy,

p62/sequestosome 1 (SQSTM1), recognizes the K63-linked poly ubiquitin chain on BORF1 and target it for autophagic degradation. Inhibition of lysosome activity causes the accumulation of ubiquitinated BORF1, and the interaction between p62 and BORF1 is evident. Finally, knockdown of p62 enhances the expression of BORF1. Taken together, this study demonstrates that TRIM5α functions concordantly with p62 and destabilizes BORF1 via autophagic degradation.

Key words: Epstein-Barr Virus (EBV), capsid proteins, BORF1, TRIM5α, ubiquitination, p62, autophagy

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圖目錄

圖1、EB 病毒的結構 ... 35

圖2、TRIM5α 的功能區 ... 36

圖3、TRIM5α 限制反轉錄病毒的機制 ... 37

圖4、p62/SQSTM1 的功能區 ... 38

圖5、Surface patch 突變ˇ棒對 TRIM5α 與 BORF1 結合的影響 ... 39

圖6、Surface patch 突變對 TRIM5α 與 BORF1 分布位置的影響 ... 40

圖7、Lysine 114 突變對 BORF1 泛素與類泛素化修飾的影響 ... 41

圖8、Lysine 114 突變對 BORF1 穩定性的影響 ... 42

圖9、TRIM5α 與 BORF1 lysine 114 突變蛋白質的結合 ... 43

圖10、p62 與 BORF1 的結合 ... 44

圖11、p62 與 BORF1 在 293T 細胞內的分布位置 ... 45

圖12、抑制溶酶體活性對 BORF1 泛素化修飾的影響 ... 46

圖13、抑制溶酶體活性對 p62 與 BORF1 結合的影響 ... 47

圖14、p62 對 BORF1 穩定性的影響 ... 48

圖15、TRIM5α 對 EB 病毒外鞘殼體組裝的影響 ... 49

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表目錄

表1、本研究使用之質體 ... 50 表2、本研究使用之抗體 ... 53

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前言

一、 Epstein-Barr virus (EB 病毒) 的發現與其相關疾病

Burkitt (1958) 在非洲孩童身上發現伯奇氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma, BL)，

並認為此腫瘤是由病毒所引起 (Burkitt 1962)。其後 Epstein 與 Barr 確立了 BL 細胞株的培養，並在細胞中發現型態類似於簡單皰疹病毒 (Herpes simplex virus) 的病毒顆粒，證實伯奇氏淋巴瘤是由病毒所引起 (Epstein et al. 1964, Epstein & Barr 1964)。後續研究證實此病毒為新型態的皰疹病毒，將其命名為 Epstein-Barr virus (EBV)，是第一個被報導具有致癌能力的人類病毒 (Henle & Henle 1966)。EB 病毒目前估計感染90% 以上人類 (Young & Rickinson 2004)，主要感染淋巴細胞與口咽上皮細胞，進入細胞後大多以潛伏感染的方式存在於體內，只有少數病毒會自發性或受到外在刺激後進入溶裂期 (lytic cycle)，產生大量病毒顆粒進而感染其他細胞 (Gerber et al. 1972, Yao et al. 1985) (附錄 1)。目前已知鼻咽癌 (Nasopharyngeal Carcinoma, NPC) (Andersson Anvret et al. 1979) 、伯奇氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma, BL) (Epstein et al, 1964)、何杰金氏症 (Hodgkin’s disease) (Weiss et al.

1989)，以及傳染性單核球增多症 (Infectious mononucleosis, IM) (Crawford 2001) 與EB 病毒感染相關。

二、 EB 病毒的遺傳物質組成與結構特性

EB 病毒又稱為第四型人類皰疹病毒 (human herpesvirus 4, HHV-4)，屬於皰疹病毒科γ 亞科，病毒顆粒直徑約 155~220 nm，所攜帶的遺傳物質為線性雙股 DNA，

可轉錄出約 85 種基因 (Baer et al. 1984)。病毒顆粒由外至內依序由外套膜 (envelope)、間質 (tegument) 及外鞘 (capsid) 所包覆。外套膜來自宿主細胞膜及核

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膜，其上嵌有病毒的膜蛋白質 (Dolyniuk et al. 1976)，往內則包裹一層間質，含有許多宿主以及病毒的蛋白質 (Johannsen et al. 2004)，最內層為直徑約 100 nm，呈正二十面體結構的外鞘殼體 (Dolyniuk et al. 1976)，包裹著病毒的遺傳物質 (圖 1)。

EB 病毒的基因體的末端具有兩個 terminal direct repeats (TRs)，在 EB 病毒感染細

胞時，其基因體能藉由兩端的TR 序列互相連接，形成在細胞質中游離的環狀質體

(episome)。EB 病毒的基因以 BamHI 限制酶圖譜表示，將截切後的片段大小依序以 大小寫英文字母編號，根據基因所位在的片段與open reading frame (ORF) 的方向來對病毒基因命名 (Dambaugh et al. 1980)。

三、 EB 病毒的生活史

EB 病毒成功感染細胞後的生活史可分為潛伏期 (latency) 與溶裂期 (lytic cycle) 兩個時期。通常 EB 病毒感染細胞後會以潛伏的形式存在於細胞內，少部分會自發性進入溶裂期 (Crawford & Ando 1986)，其餘在 UV、X 光照射 (Henderson

& Long 1981) 、 sodium butyrate (Kallin et al. 1979, Luka et al. 1979) 、 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) (zur Hausen et al. 1978)、trichostatin A (TSA) (Chang & Liu 2000)、抗免疫球蛋白質 (anti-immunoglobulin) (Tovey et al.

1978)、熱休克 (heat shock)、鈣離子載體 (calcium ionophores)、cocaine 等刺激下 (Amon & Farrell 2005)，會促使細胞內的 EB 病毒進入溶裂期 (附錄 1)。

在潛伏期EB 病毒只會表現六種核抗原蛋白質 (nuclear antigens)、三種潛伏期膜蛋白質 (latent membrane protein) 以及多種 micro-RNA (miRNA) (Allday et al.

1989, Pfeffer et al. 2004, Cai et al. 2006)。其中核抗原蛋白質 EBNA1 在潛伏期時會結合在origin of replication (oriP) 上，活化病毒基因體的複製使其與宿主細胞一起分裂而分布於子細胞中 (Hampar et al. 1974, Yates et al. 1985, Yates & Guan 1991)，

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其餘蛋白質則能影響宿主的基因表現與訊息傳遞路徑，避免宿主產生免疫反應或細胞凋亡，以保護病毒基因體能夠穩定存在於宿主內 (Young & Murray 2003, Pfeffer et al, 2004, Yenamandra et al. 2009)。

EB 病毒進入溶裂期後會大量表現病毒基因，複製病毒基因體並組裝成為病毒顆粒。溶裂期基因可分為極早期基因 (immediate early gene)、早期基因 (early gene) 以及晚期基因 (late gene)。極早期基因 BRLF1 和 BZLF1 所表現的蛋白質 Rta 與 Zta 皆具有轉錄因子的活性，可協同活化其他溶裂期基因 (Farrell et al. 1989, Chang et al. 1990, Quinlivan et al. 1993, Liu & Speck 2003)。早期基因則多表現與病毒基因體複製有關的蛋白質，其中包含六個重要的core replication factors (Fixman et al.

1992, Daibata & Sairenji 1993, Decaussin et al. 1995, Tsurumi et al. 1996, Fujii et al.

2000, Nakayama et al. 2009)。oriLyt 為 EB 病毒的溶裂複製起始點，其序列包含 7 個ZRE (Zta response element) (Xue & Griffin 2007)。當病毒開啟溶裂複製時，Zta 會與core replication factors 形成 EB 病毒的複製複合體 (replication complex)，結合並活化oriLyt 使得病毒基因體大量複製 (Baumann et al. 1999, Xue & Griffin 2007)。

EB 病毒在溶裂早期會以半保留 (semiconsertive) 的方式複製其基因體，而在溶裂複製的晚期則改以滾環複製模式 (rolling circle replication)，形成頭尾相接的串連體 (concatamer) (Jacob et al. 1979, Pfuller & Hammerschmidt 1996)。此外，溶裂期的 DNA 複製也會促進晚期基因的表現 (Chang et al. 1998, Serio et al. 1998)。EB 病毒晚期基因產物多與病毒顆粒的結構有關，如構成外鞘殼體的 BcLF1 (major capsid protein, MCP; VCA)、BDLF1 (minor capsid protein, mCP)、BORF1 (minor capsid protein binding protein, mCPBP)、BFRF3 (smallest capsid protein, sCP)、BBRF1 (portal protein) 等 (Johannsen 2004, Wang et al. 2011)，以及外套膜 (envelope) 上的醣蛋白質gp350、gp110、gB 等 (Borza & Hutt-Fletcher 2002, Connolly et al. 2011)。間質蛋

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白的表現則會橫跨早期及晚期，能參與病毒溶裂期的複製、活化早期基因及影響病毒的初期感染 (Wang et al. 2005, Feederle et al. 2006, Gershburg et al. 2007, Wang et al. 2010, Tsai et al. 2011)。最終病毒 DNA 會被送入組裝完成的外鞘殼體中，包覆間質蛋白質並由宿主細胞中釋出，產生具有感染能力的病毒顆粒。

四、皰疹病毒的外鞘蛋白質

皰疹病毒的外鞘殼體為正20 面體 (icosahedral structure)，由 20 個正三角形和 12 個頂角組成接近於球狀的結構。目前皰疹病毒外鞘殼體的組成與組裝過程多以第一型簡單皰疹病毒 (herpes simplex virus type 1, HSV-1) 為模型。HSV-1 外鞘殼體由162 個殼粒 (capsomers) 構成，其中包含 150 個六聚體 (hexons) 構成正三角形面，12 個五聚體 (pentons) 組成頂角 (Baker et al. 1990, Trus et al. 1992, Newcomb et al. 1993) (附錄 2)。此外，殼粒之間會由 320 個三聚體 (triplex) 連結 (Zhou et al. 1994, Newcomb et al. 1996)。除了由 UL6 基因所轉譯的入口蛋白質 (portal protein) 會形成供 DNA 進入外鞘中的通道外，其餘的殼粒是由主要外鞘蛋白質 (major capsid protein) VP5 組成 (Trus et al. 2004, Rochat et al. 2011)，而連結殼粒的三聚體則由兩種次要外鞘蛋白質 (minor capsid proteins) 以單體 (monomer) 的VP19C 和雙體 (dimer) 的 VP23 所組成 (Trus et al. 1996, Spencer et al. 1998, Zhou et al. 2000, Okoye et al. 2006)。

HSV-1 在細胞核中進行病毒殼體的組裝，而病毒殼體可依照組裝程度不同分為A、B、C 三種。初期的病毒殼體由主要和次要外鞘蛋白質與支架蛋白質 (scaffold protein) 組成，稱為 B 型。其後支架蛋白質會離開外鞘殼體而轉變為 A 型。C 型病毒殼體則是包裹了病毒 DNA，成為具有感染力的成熟的病毒顆粒 (Homa &

Brown 1997, Brown & Newcomb 2011)。病毒殼體組裝的初期，VP19C 會帶領 VP5

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與VP23 進入細胞核 (Rixon et al. 1996)，並與 UL6 基因產物所組成的 portal ring (Newcomb et al. 2003) 及支架蛋白質 (scaffold protein) 結合，組裝成球狀的 procapsid (Zhou et al, 1994)。支架蛋白質是由 UL26 基因所產生的多蛋白質 (polyprotein)，能利用本身的酵素活性分解成蛋白質酵素 VP24a 與兩個支架蛋白質 VP22a 及 VP21 (Preston et al. 1994, Sheaffer et al. 2000)。Procapsid 形成後支架蛋白

質會離開殼體結構，此時外鞘蛋白質會因為支架蛋白質離開而轉變為正20 面體構

造，之後由 UL15、UL28 和 UL33 所組成的末端酶 (terminase) 複合體會協助病毒DNA 通過入口蛋白質進入外鞘殼體中，形成成熟的病毒殼體 (Yang et al. 2007) (附錄 2)。

五、 EB 病毒的外鞘蛋白質

Johannsen 等人 (2004) 從細胞培養液中分離出 EB 病毒顆粒，利用電泳分離病毒蛋白質後進行 MALDI-TOF 分析，發現 EB 病毒的 BcLF1、BDLE1、BFRF3、

BORF1 和 BBRF1 基因可以分別轉譯出 EB 病毒的主要外鞘蛋白質、次要外鞘蛋

白質、小外鞘蛋白質、次要外鞘蛋白質結合蛋白質和入口蛋白質，此外 BVRF1

(capsid-associated cork)、BVRF2 (protease) 及 BdRF1 (protease-assemblin) 也與病毒顆粒的組裝有關 (Batisse et al. 2005)。病毒表現出外鞘蛋白質後，兩個 BDLF1 與一個 BORF1 蛋白質會形成三聚體並與 VCA 結合，藉由 BORF1 上的入核序列 (nuclear localization sequence, NLS) 引導進入細胞核內進行病毒外鞘殼體的組裝 (Wang et al, 2011)。近年來研究指出 EB 病毒進入溶裂期後，病毒的外鞘蛋白質會在細胞核內與 PML-NBs (promyelocytic leukemia nuclear bodies) 共同分布，且 BORF1 在胞外能與 PML 直接結合，推測在組裝病毒顆粒時是由 BORF1 將其餘外鞘蛋白質帶入核內，並於PML-NBs 處進行病毒顆粒組裝 (Wang et al. 2015)。此外

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另有研究指出，在秋夜盜蛾細胞株 (Spodopterafrugiperda, Sf cell) 的表現系統中，

可以電子顯微鏡觀察到 VCA、BORF1、BDLF1、BdRF1、BVRF2 以及 BFRF3 自行組裝而成的病毒顆粒，且能以蔗糖梯度離心將此病毒顆粒分離 (Henson et al.

2009)。

六、泛素與泛素化修飾 (Ubiquitin and ubiquitination)

泛素化修飾是一種蛋白質後轉譯修飾 (post-translational modification)。最初發

現被泛素化修飾的蛋白質會經由 proteasome 的路徑降解，因此泛素化修飾被認為

是用以調節蛋白質的半生期 (Hershko et al. 1980, Giles 2004)。泛素 (ubiquitin) 是由76 個胺基酸所組成的蛋白質，大小約為 8500 Dalton，具有高度的演化保留性。

泛素蛋白質的C 端具有保守 glycine 側基，會由泛素活化酶 E1 (ubiquitin-activating enzyme) 催化並與 E1 的 cysteine 形成 thiol-ester 鍵結。接著泛素接合酶 E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 會將 E1 上的泛素轉移至 E2 上，最後藉由泛素連接酶E3 (ubiquitin ligase) 將泛素與目標蛋白質的 lysine 側基形成共價鍵結的胜肽鍵 (isopeptide bonds) (Joazeiro & Weissman 2000, Fang & Weissman 2004)。目前已知人體細胞中具有2 種 E1、約 40 種 E2 及超過 600 種的 E3 酵素 (Deshaies & Joazeiro 2009)，而泛素則被至少 20 種 ubiquitin-binding domains (UBDs) 所辨認 (Hurley et al.

2006)。泛素化修飾是可逆的過程，可由去泛素化酵素 (deubiquitinating enzyme, DUB) 將泛素分子從目標蛋白質上移除，而目前已知人類有近 100 種去泛素化酵素 (Reyes-Turcu et al. 2009) (附錄 3)。

泛素化修飾有多種連結方式，分別代表不同的生理意義 (Komander 2009, Yao

& Ndoja 2012)。單一泛素分子修飾在蛋白質的單一位置 (mono-ubiquitination) 或是多個位置上 (multi-mono-ubiquitination)，其功能主要與組蛋白的調節 (histone

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regulation) (Pham & Sauer 2000, Robzyk et al. 2000) 、蛋白質的內吞作用 (endocytosis) (Terrell et al. 1998) 、 DNA 損壞反應 (DNA damage response) (Sigismund et al. 2004, Alpi et al. 2008) 及蛋白質運輸 (trafficking) 有關 (Hicke 2001)。泛素本身具有多個 lysine 側基可與其他泛素分子連結而形成泛素的多體 (ubiquitin polymers, poly-ubiquitination) (Ikeda & Dikic 2008)，其中被研究最深入的

是K48 鍵結以及 K63 鍵結的長鏈泛素化修飾。當細胞中損壞或不必要的蛋白質受

到 K48 鍵結的長鏈泛素化修飾後，會被送到 proteasome 進行降解 (Thrower et al.

2000)。K63 鍵結的長鏈泛素化修飾主要參與 DNA 修補機制中辨認 DNA 雙股缺口的角色以及與蛋白質的運輸有關 (Lauwers et al. 2009, Panier & Durocher 2009)。在選擇性自噬作用 (selective autophagy) 中，K63 鍵結的長鏈泛素化會與自噬受體 (cargo receptor) p62 的 UBA (ubiquitin-associated) 功能區結合，促使 p62 將具有 K63 鍵結長鏈泛素化修飾的蛋白質帶入自噬體中降解 (Tan et al. 2008)。K63 鍵結長鏈

泛素化修飾亦會阻礙蛋白質與 26S proteasome 的結合而使蛋白質不會被送到

proteasome 中 (Nathan et al. 2013)。不與受質結合之游離的 K63 鍵結長鏈泛素則能活化TAK1，進而活化 NF-κB 路徑 (Xia et al. 2009, Pertel et al. 2011)。

七、類泛素 (Small ubiquitin-like modifier, SUMO)

類泛素又簡稱SUMO 蛋白質，大小約為 10 kDa，其結構與泛素類似，修飾過

程與泛素化修飾雷同 (Hershko & Ciechanover 1998)。首先，SENP (SUMO-specific proteases) 酵素會對 SUMO 蛋白質的 C 端進行截切，露出兩個 glycine，接著此 glysine 會經由 E1 酵素 AOS1-UBA2 活化，與 UBA2 的 cysteine 形成 thioeaster 鍵

結，之後轉移到E2 酵素 UBC9 上。與泛素化修飾不同的是，UBC9 能直接將類泛

素以isopeptide 共價鍵結到目標蛋白質的 lysine 側基上，而 SUMO E3 酵素的功能

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則是促進 UBC9 將類泛素轉移到目標蛋白質 (Geiss-Friedlander & Melchior 2007, Meulmeester & Melchior 2008)。大多數受類泛素修飾的 lysine 位於 Ψ-K-X-E/D 的保守性序列上，其中Ψ 為疏水性胺基酸，X 為任意胺基酸 (Johnson 2004, Hay 2005)，

而類泛素化修飾反應也具有可逆性，能透過 SENP 酵素將類泛素從目標蛋白質上

去除 (Mukhopadhyay & Dasso 2007)。

類泛素化修飾能調節許多細胞功能，如蛋白質的分布的位置、穩定性、細胞週期、轉錄作用以及DNA 修復機制等 (Melchior 2000, Johnson 2004, Ulrich et al.

2005)。哺乳動物含有四種類泛素的同源基因 SUMO-1、2、3、4，其中 SUMO-1~3 廣泛存在於各種細胞內，而SUMO-4 僅在腎臟、淋巴結以及脾臟中表現 (Guo et al.

2004)。在胺基酸序列上 SUMO-2 與 3 則只在 N 端具有三個胺基酸的差異，因此常被統稱為SUMO-2/3 (Melchior 2000, Hay 2005)。不同於 SUMO-1，SUMO-2/3 上具有能形成類泛素長鏈的lysine 側基，若將 SUMO-1 修飾於 SUMO-2/3 長鏈的尾端，

則會終止類泛素長鏈的延長 (Tatham et al. 2001)。三種類泛素在細胞內的分布也有所不同，SUMO-1 廣泛分布在核仁 (nucleoli)、細胞核膜 (nuclear envelope) 以及細胞質中 (cytoplasm) (Ayaydin & Dasso 2004)，而細胞內游離的 SUMO-2/3 則較 SUMO-1 來的多 (Saitoh & Hinchey 2000)。

SUMO-interacting motif (SIM) 為一段由疏水性序列 V/I/L-X-V/I/L-V/I/L 或 V/I/L-V/I/L-X-V/I/L 加上附近胺基酸所構成，含此序列的蛋白質能增進本身的類泛素化修飾，或透過此區域與被類泛素化修飾的蛋白質結合 (Song et al. 2004, Hannich et al. 2005, Hecker et al. 2006)。Ubiquitin ligases recognizing SUMO (ULS) 又稱作SUMO-targeted ubiquitin ligases (STUbLs) 為一類泛素接合酶，能透夠過本

身的SIM 區域與受類泛素化修飾的目標蛋白質結合，催化其泛素化修飾 (附錄 4)，

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顯示SUMO-2/3 長鏈修飾可做為類泛素化與泛素化修飾之間的連結 (Uzunova et al.

2007, Geoffroy & Hay 2009, Praefcke et al. 2012)。

八、病毒外鞘蛋白質的泛素化與類泛素化修飾

病毒外鞘蛋白質的泛素化與類泛素化修飾在病毒與宿主的相互競爭中扮演了重要的角色。UPS (ubiquitin-proteasome system) 是常見的宿主對抗病毒的防衛機制，

許多病毒的外鞘蛋白質會被宿主的泛素化連接酶辨識，後透過此途徑降解而抑制病毒的感染 (Luo 2015)。C 型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV) 外鞘殼體的主要成份 core protein 會被宿主的 E3 連接酶 E6AP 辨認，並透過 UPS 途徑導致其降解 (Shirakura et al. 2007)；而西尼羅病毒 (West Nile virus, WNV) 的外鞘蛋白質 WNVCp 也會被宿主的 E3 連接酶 MRFP1 (makorin ring finger protein 1) 辨認，透過 UPS 途徑使其降解並影響病毒的增生 (Ko et el. 2010)。另外，第二型腺病毒相關病毒 (adeno-associated virus-2, AAV-2) 的外鞘蛋白質 VP1、VP2 與 VP3 被報導會受到泛素化修飾，且使用proteasome 或泛素 E3 連接酶抑制劑會使病毒感染率大幅增加，顯示UPS 降解途徑會影響 AAV-2 的感染 (Duan et al. 2000)。過去研究也指出，

第一型人類免疫缺乏病毒 (Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1) 在感染宿主

細胞後，其外鞘殼體會被TRIM5α 辨認並透過其泛素 E3 連接酶活性導致病毒外鞘

殼體提前瓦解 (uncoating)，進而限制病毒感染 (Lienlaf et al, 2011, Pertel et al, 2011)。

以上文獻顯示宿主可以藉由促進病毒外鞘蛋白質的泛素化修飾來抵抗其入侵，然而泛素化修飾系統也被許多病毒所利用，藉由泛素化修飾外鞘蛋白質來幫助感染。

委內瑞拉馬腦炎病毒 (venezuelan equine encephalitis virus, VEEV) 的外鞘蛋白質被報導會受到K48 鍵結泛素化修飾，若加入 proteasome 抑制劑會穩定病毒的外鞘殼體進而影響病毒基因體的釋放，導致病毒複製量下降 (Amaya el al. 2015)。此外，

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登革病毒 (dengue virus) 在進入宿主細胞後，其外鞘殼體也會受到泛素化修飾，若抑制此泛素化修飾會導致其基因體無法正常釋放，但與VEEV 不同的是 proteasome 活性並不會影響登革病毒基因體的釋放機制 (Byk et al. 2016)。泛素化修飾外鞘蛋白質除了可以幫助病毒基因體的釋放外，也能影響病毒在宿主細胞內的移動。腺病毒 (Adenovirus) 的次要外鞘蛋白質 protein VI 具有一段 PPxY 序列，能與泛素 E3 連接酶 Nedd4 結合，催化 protein IV 的泛素化修飾。若將 PPxY 序列突變或抑

制 Nedd4 的表現會影響病毒透過微管往核內移動的能力，顯示泛素化修飾外鞘蛋

白質能幫助腺病毒在細胞內的運輸 (Wodrich et al. 2010)。

病毒外鞘蛋白質的類泛素化修飾則多被病毒利用來幫助本身的複製及組裝 (Mattoscio et al. 2013)。A 型流感病毒 (influenza A virus) 的外鞘蛋白質 NP 被報導會在lysine 4 與 7 的位置被類泛素化修飾，若將此修飾位置突變會影響病毒在細胞內的運輸以及生長，顯示病毒需要利用類泛素化修飾系統來幫助自身的存活 (Han et al. 2014)。過去研究也指出，莫洛尼鼠類白血腫瘤病毒 (Moloney murine leukemia virus, MLV) 的外鞘蛋白質 CA 則會與 Ubc9 以及類泛素 E3 連接酶 PIASy 結合，

促進 CA 被 SUMO-1 修飾，若抑制此類泛素化修飾會導致病毒基因體的複製量下

降，但不影響晚期基因表現以及病毒顆粒的組裝 (Yueh et al. 2006)。第十六型人類乳突病毒 (human papillomavirus 16, HPV-16) 的次要外鞘蛋白質 L2 則被報導在 lysine 35 的位置會被 SUMO2/3 修飾，若將此 lysine 突變會使 L2 的穩定性下降，

且無法與主要外鞘蛋白質L1 結合，顯示類泛素化修飾能夠調控病毒外鞘殼體的組

裝 (Marusic et al. 2010, Van 2014)。此外，HIV-1 的 Gag 蛋白質 p6 被報導會與 Ubc9 結合，且其lysine 27 會受 SUMO-1 修飾 (Gurer, 2005)，顯示類泛素化修飾系統廣泛的被各類病毒所利用。

(20)

九、 TRIM5α 蛋白質

Tripartite motif 5 alpha (TRIM5α) 屬於 TRIM 家族成員，目前已知人類基因所表現的TRIM 家族蛋白質已近 100 種，可分為 11 大類 (Han et al. 2011)。TRIM5 基因中最大的產物 TRIM5α 在恆河猴 (rhesusmacaque) 中的同源物 TRIM5αrh是反轉錄病毒的限制因子 (restrictionfactor)，能夠抑制 HIV-1 的感染 (Keckesova et al.

2004, Stremlau et al. 2004)。TRIM5α 的蛋白質組成除了具有在 TRIM 家族蛋白質中保守的RING、B-box 及 coiled-coil (RBCC) 功能區外 (Reymond et al. 2001)，在 C 端具有獨特的B30.2 (SPRY) 功能區 (Javanbakht et al. 2005) (圖 2)。N 端的 RING

功能區使TRIM5α 具有泛素連接酶的活性，可促進自身與其他受質的泛素化修飾，

且 RING 功能區對 TRIM5αrh 限制反轉錄病毒感染具有相當的重要性 (Meroni &

Diez-Roux 2005, Maegawa et al. 2010, Kim et al. 2011, Lienlaf et al. 2011)。此外，近年研究發現 RING 功能區雙體化 (dimerization) 能協助 TRIM5αrh形成高度聚合晶格結構 (higher-order self-association oligomers)，且會增強其 E3 連接酶活性 (Yudina et al. 2015)。TRIM5α 的 B-box 功能區為一段約 40 個胺基酸的鋅指序列，

其功能與形成六角形高度聚合晶格結構有關 (Li & Sodroski 2008)。TRIM5αrh單體

結合 HIV-1 的能力很弱，但在形成相似於 HIV-1 外鞘表面構造的六方晶格

(hexagonal lattice) 聚合結構後，會大幅提高與病毒結合的能力而增進對反轉錄病毒感染的限制作用 (Li & Sodroski 2008, Diaz-Griffero et al. 2009, Ganser-Pornillos et al. 2011)。TRIM5α 也能藉由其 coiled-coil 區域形成多聚體 (homomultimerize) 以增加對病毒外鞘蛋白質的辨識能力，且coiled-coil 功能區發生突變會造成 TRIM5αrh

對 HIV-1 的限制能力大幅下降 (Mische et al. 2005, Perez-Caballero et al. 2005, Javanbakht et al. 2006, Maillard et al. 2010)。B30.2 (SPRY) 功能區則具有區分結合目標蛋白質的功能，也是主要造成TRIM5α 有物種特異性之原因 (Javanbakht et al,

(21)

2005)，如 TRIM5αrh 可以限制 HIV-1 的感染 (Stremlau et al, 2004)，而人類的 TRIM5αhu則對HIV-1 沒有限制能力 (Perron et al, 2004)。近年研究發現，若將 B30.2

功能區表面上一系列帶電胺基酸突變，並不影響TRIM5αrh與病毒外鞘蛋白質的結

合，卻使TRIM5αrh喪失限制反轉錄病毒感染的能力，顯示B30.2 功能區可能具有除了蛋白質結合以外的功能 (Yang et al. 2014)。除上述功能區外，近年研究也指出 TRIM5α 具有 LIR 功能區，能與 Atg8 (GABARAP) 蛋白質結合，參與自噬作用的起始，並做為選擇性自噬作用的受體，將反轉錄病毒的蛋白質以自噬作用途徑降解 (Mandell et al. 2014) (附錄 6)。

TRIM5α 在細胞內有形成 cytoplasmic bodies 聚集與擴散兩種分布形式，當 TRIM5α 被單一泛素修飾會影響其在細胞內兩種分布形式的轉換 (Campbell et al.

2007)。TRIM5α 大多分布於細胞質中，但若以 leptomycin B (LMB) 藥物抑制 CRM-1 的運輸時會導致 TRIM5α 在細胞核內大量累積 (Fukuda et al. 1997, Lukic et al.

2013) ，並與 Promeylocytic leukemia (TRIM19) nuclear body (PML-NB) 重合 (Diaz-Griffero et al. 2011)。先前研究指出 TRIM5αrh與PML 在細胞核內的結合能夠增加TRIM5αrh的穩定性，當TRIM5αrh的SIM1 及 SIM2 功能區突變時，TRIM5αrh

無法進到細胞核內與受SUMO 修飾的 PML 結合，會使得 TRIM5αrh快速降解，因而降低抑制反轉錄病毒的能力 (Lukic et al. 2013)。

十、 TRIM5α 限制反轉錄病毒的機制

前人對於TRIM5αrh限制反轉錄病毒感染的機制已有多面向的研究。當反轉錄

病毒感染宿主細胞時，病毒核心 (virion core) 進到細胞內，此時在細胞質中的

(22)

TRIM5αrh會藉由其C 端的 B30.2 domain 與病毒的外鞘殼體結合，並促進病毒的外鞘蛋白質提早解體 (uncoating)，導致反轉錄作用無法正常進行 (Luban 2007)。過去研究指出，TRIM5αrh能直接與proteasome 蛋白質 PSMC2 結合 (Lukic et al. 2011, Danielson et al. 2012)，且失去泛素 E3 連接酶活性會導致 TRIM5αrh無法限制病毒感染 (Lienlaf et al, 2011, Pertel et al, 2011)。若以 proteasome 抑制劑處理會使得 TRIM5αrh無法降低病毒反轉錄作用產物 (Wu et al. 2006)，但 TRIM5αrh仍能透過與病毒的preintegration complexes (PICs) 結合，使得其無法進入細胞核進行嵌合作用 (integration)，因而限制病毒的感染 (Anderson et al. 2006, Wu et al, 2006, Campbell et al. 2008)。TRIM5α 具有自我泛素化修飾的能力 (autoubiquitination)，過去研究指出，

當TRIM5αrh與反轉錄病毒外鞘蛋白質結合後會使得其更易被proteasome 辨認，連帶使得與其結合的病毒殼體瓦解 (Diaz-Griffero et al. 2006, Rold & Aiken 2008, Lienlaf et al, 2011)。以上文獻顯示 TRIM5αrh限制病毒感染的機制至少部分與其能

泛素化修飾病毒外鞘殼體並造成其透過 proteasome 路徑降解有關。另一方面，過

去也有文獻報導TRIM5α 能與自噬作用受體蛋白質 p62/sequestosome 1 (SQSTM1) 結合，且若以siRNA 抑制 p62 蛋白質表現會使得 TRIM5αrh表現量下降，且影響其限制病毒感染的能力 (O'Connor et al. 2010)。Mandell 等人 (2014) 的研究發現，

TRIM5αrh 能與自噬作用相關蛋白質結合，做為自噬作用起始的平台。此外，

TRIM5αrh也能做為自噬作用的受體蛋白質 (cargo receptor)，透過其 B30.2 功能區結合HIV-1 病毒外鞘蛋白質 p24 後將其帶入自噬體中降解，顯示 TRIM5αrh也能以自噬作用途徑限制病毒的感染 (附錄 6)。近期研究顯示 TRIM5αrh 的穩定性和 proteasome 降解路徑及自噬作用皆有相關，且抑制自噬作用會導致 TRIM5αrh累積在細胞質的自噬體當中 (Imam et al. 2016)，顯示 TRIM5αrh與自噬作用間的關係密切 (圖 3)。

(23)

TRIM5α 除了能在早期限制反轉錄病毒的感染外，在晚期也具有限制能力。當反轉錄病毒準備組裝病毒顆粒時，TRIM5α 能造成 Gag 蛋白質穩定性下降而影響病毒顆粒的生成 (Sakuma et al, 2010, Pratt et al. 2012)。此外，TRIM5α 亦可做為免

疫反應的感測器，辨認反轉錄病毒的外鞘蛋白質，後與細胞內的 E2 泛素接合酶

UBC13/UEV1A 作用，產生游離的 K63 鍵結泛素長鏈以活化 TAK1 (MAP3K7)，進而活化下游的NF-κB 路徑 (Pertel et al, 2011)。

十一、自噬作用 (Autophagy)

自噬作用是一種調節機制，對細胞內的能量平衡以及對抗壓力相當重要。自噬作用參與細胞凋亡 (autophagic cell death) 、生物體的發育、老舊胞器的降解、

蛋白質構形的摺疊以及免疫反應等 (Beaulaton & Lockshin 1977, Veenhuis et al.

1983, Lemasters et al. 1998, Yano et al. 2008, Thurston et al. 2009)。在正常細胞狀態下，mTOR (mammalian target of rapamycin) 會磷酸化 Ulk1 與 Ulk2，因而抑制細胞的自噬作用 (Kim et al. 2011)。但在飢餓、代謝壓力、微生物感染等刺激下，或是加入 mTOR 抑制劑 rapamycin，會使得 mTOR 失去活性因而活化自噬作用。在自噬作用起始時，Beclin1 (BECN1) 會與 Bcl2 分離並與細胞內的 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) Vps34 形成複合體，參與自噬體的初始形成 (nucleation)。自噬體上的LC3 (Microtubule-associated protein light chain 3) 蛋白質是自噬體的標誌蛋白質，

在自噬體初始形成後，LC3 的 C 端會被端截切並加上 phophatidylethanolamine (PE) 基團，從 LC3-I 轉變為 LC3-II，並聚集鑲嵌在雙層膜上形成 autophagophore (phagophore)，其後雙層膜結構會逐漸延展，形成具有雙層膜構造的完整自噬體 (autophagosome) 。最終，自噬體會進一步與溶酶體 (lysosome) 融合形成 autophagolysosome ，將自噬體內的蛋白質、胞器、病毒或細菌等物質降解

(24)

(Novikoff et al. 1964, De Duve & Wattiaux 1966, Deter & De Duve 1967, Kabeya et al.

2004)。自噬作用對於目標蛋白質也具有選擇性，能專一性清除蛋白質聚積、回收過氧化體、粒線體、內質網或核糖體等各種老舊胞器 (Bjorkoy et al. 2005, Bernales et al. 2006, Iwata et al. 2006, Kraft et al. 2008, Okamoto et al. 2009)。選擇性自噬作用 (selective autophagy) 能透過數種不同的自噬受體，辨認具有泛素化修飾之蛋白質，

將其帶到自噬體中降解 (Pankiv et al. 2007) (附錄 4)。

選擇性自噬作用常用以抵抗病原體感染，此機制又別名Xenophagy (Munz 2009, Zheng et al. 2009)。為了成功感染，許多病毒發展出抑制宿主自噬作用的機制，如 HIV-1、HSV-1、卡波西氏瘤相關皰疹病毒 (Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV) 等 (Orvedahl et al. 2007, Zhou & Spector 2008, Chaumorcel et al. 2012, Lussignol et al. 2013)。近期研究也顯示，EB 病毒的感染會活化宿主細胞的自噬作

用，但隨後會被病毒的溶裂期蛋白質抑制，顯示自噬作用為細胞對抗EB 病毒入侵

的手段之一 (De Leo et al. 2015)。此外，研究指出 TRIM 家族蛋白質能做為選擇性

自噬作用的受體，使 HIV-1 的外鞘蛋白質 p24 降解而限制反轉錄病毒的感染

(Mandell et al, 2014) (附錄 5)。病毒除了逃避宿主細胞的自噬作用外，登革病毒、

A 型流感病毒、C 型肝炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒 (varicella-zoster virus, VZV) 也進一步利用此機制來幫助複製與釋放 (Lee et al. 2008, Dreux et al. 2009, Bouley et al. 2014, Buckingham et al. 2014, Zhang et al. 2014)。此外，HIV-1 中的 Gag 蛋白質會與LC3 結合，且在胞外病毒顆粒中也發現 LC3 的存在，顯示 HIV-1 可能利用自噬作用來幫助病毒顆粒釋放 (Kyei et al. 2009)。KHSV 的極早期蛋白質 ORF50 也

被報導能夠促進細胞自噬作用的形成，若降低自噬作用活性會抑制 KSHV 進入溶

裂期 (Wen et al. 2010)。EB 病毒被報導能利用自噬作用調控細胞內的訊息傳遞路徑，影響宿主在潛伏期所引發的細胞凋亡現象 (Pratt et al, 2012, Pujals et al. 2015)。

(25)

此外，研究指出 EB 病毒的極早期蛋白質 Rta 會透過 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 路徑活化自噬作用，幫助 EB 病毒溶裂基因表現及病毒基因體複製 (Hung et al. 2014)。同時也有報導指出，EB 病毒能夠穩定自噬體的雙層膜，做為自

身的外套膜而幫助病毒顆粒的釋放，若抑制自噬體的形成則會導致病毒DNA 累積

在細胞內 (Nowag et al. 2014)。

十二、 p62/SQSTM1 蛋白質

p62/sequestosome 1 (SQSTM1) 又稱作 ubiquitin-binding protein，是一個受到廣泛研究的自噬受體，除了能將目標蛋白質帶入自噬體中降解外，本身也會透過自噬作用途徑降解。p62 的蛋白質組成具有 PB1 (Phox and Bem1)、ZZ、TBS (TRAF6 binding sequence)、LIR (LC3-interacting region) 及 UBA (Ub-associated) 等多個功能區，能與許多蛋白質結合，參與多種調控 (Lin et al. 2013) (圖 4)。PB1 功能區則能使p62 形成多聚體，在形成自噬體的過程中相當重要 (Itakura & Mizushima 2011)。

此外，PB1、ZZ 與 TBS 功能區能與 aPKC、RIP1 kinase 及 TRAF6 等蛋白質結合，

參與活化NF-kB 路徑 (Li & Sodroski 2008)。LIR 功能區可與自噬體上的 Atg8/LC3 結合，參與自噬作用的形成及細胞內聚集蛋白質的降解 (Pankiv et al, 2007, Ichimura et al. 2008)。而 UBA 功能區則可專一性地辨認 K63 鍵結長鏈泛素化修飾 (Long et al. 2008)，與泛素化修飾的蛋白質形成蛋白質聚集體，若促進自噬作用會使此聚集體消失 (Bjorkoy et al. 2006)。p62 也具有入核與出核序列，能與受泛素化

修飾的蛋白質聚集在核內PML 的位置，顯示 p62 也能幫助降解核內聚集的蛋白質

(Pikkarainen et al. 2011, Wang et al. 2011)。

過去研究指出p62 能與蟲媒病毒屈公病毒 (Chikungunya virus, CHIKV) 的外鞘蛋白質結合，在經過泛素化修飾後被p62 辨認而帶入自噬體中 (Judith et al. 2013)。

(26)

p62 也會與辛德畢斯病毒 (Sindbis virus, SV) 的外鞘蛋白質結合，將其帶到自噬體中降解 (Sumpter & Levine 2011)。此外，也有研究發現 p62 會與 TRIM5α 結合，若抑制 p62 在細胞內的含量會造成 TRIM5α 穩定性以及限制 HIV-1 的能力下降 (O'Connor et al, 2010)，而 p62 本身也能辨認到 HIV-1 的轉錄因子 Tat 並透過選擇性自噬作用將其將解 (Sagnier et al. 2015)，顯示 p62 在細胞內也扮演對抗病毒感染的角色。

(27)

研究目的

TRIM5α 能在反轉錄病毒感染細胞的過程中，使病毒外鞘殼體提早解體而抑制病毒的感染 (Stremlau et al. 2006)，但對於 DNA 病毒的影響則沒有深入的研究。本實驗室先前研究指出，TRIM5α 能透過 C 端的 B30.2 功能區與 EB 病毒的外鞘蛋白質BORF1 直接結合，且 TRIM5α 會促進 BORF1 泛素化修飾，造成其穩定性下降。

利用P3HR1 細胞收集 EB 病毒顆粒，可以觀察到若將 TRIM5α 抑制，EB 病毒的產量會大幅增加，顯示TRIM5α 對 EB 病毒溶裂期發展的影響 (徐詩媁, 2013) (附錄 7)。過去文獻指出選擇性自噬作用的受體 p62，其 UBA 功能區可專一性地與被 K63 鍵結長鏈泛素化修飾後的蛋白質結合 (Pankiv et al, 2007)，且 p62 已被報導能與 TRIM5α 結合並增加其穩定性 (O'Connor et al, 2010)，顯示 p62 可能協助 TRIM5α

透過選擇性自噬作用來降解目標蛋白質。因此，本研究進一步探討 TRIM5α 是否

能透過選擇性自噬作用途徑，與自噬受體p62 一同造成 EB 病毒的外鞘蛋白質降解，

影響病毒晚期外鞘殼體的組裝，期能更了解宿主對抗病毒的機制。

(28)

材料與方法

一、細胞株

293T 細胞株由人類胚胎腎臟細胞中分離 (Graham et al. 1977)，以 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Biological Industries) (另含 10% 胎牛血清、100 µg/mL penicillin G、100 µg/mL streptomycin 及 2 mM L-Glutamine) 在 37°C、5% 二氧化碳的環境中培養。

二、細菌

大腸桿菌 (Escherichia coli, E. coli) EPI300，以 Luria Broth (LB) (Bertani 1951) (另含 50 µg/mL Katamycin 或 100 µg/mL Ampicillin) 在 37°C 的環境中震盪培養。

三、質體與抗體

本研究所構築與使用到的質體條列於表1，抗體條列於表 2。

四、質體 DNA 的萃取

本研究所使用的質體DNA 以 High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid) 抽取，使用方法參照手冊說明。

五、細胞轉染

293T 細胞以 1×10⁵ cells/mL DMEM 濃度培養隔夜，將 TurboFect (Fermentas) in vitro 以 1 µg DNA/µL Turbofect 的比例與 DNA 質體混合，在不含血清的 DMEM 中 作用20 分鐘後加入細胞培養液，在 37°C 的環境下培養 24~40 小時。

(29)

六、免疫沉澱分析 (Immunoprecipitation, IP)

將轉染後的細胞離心去除培養液，以IP buffer [Phosphate buffered solution (PBS) 含 0.1% 或 0.5% IGEPAL、10 µg/mL leupeptin 及 10 µg/mL 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)] 回溶，以超音波震盪打破細胞。離心後取出細胞裂解液，加入ANTI-FLAG M2 膠體 (Sigma) 在 4°C 反應 1 小時，以 IP buffer 清洗膠體三次，以西方點墨法偵測蛋白質的結合情形 (Chang et al. 2004)。

七、變性免疫沉澱分析 (Denature immunoprecipitation, denature IP) 293T 細胞轉染所需質體 24 小時後，加入 10 µM MG132 或不處理，作用 16 小時後收取細胞，以含10 mM N-ethylmaleimide (NEM) (Sigma) 的 PBS 清洗細胞，

接著以denature IP buffer [含 1 倍體積的 buffer I (150 mM Tris-HCl pH 6.7 含 5% SDS 及30% glycerol)、3 倍體積的 buffer II (25 mM Tris-HCl pH 8.2 含 5% SDS、50 mM NaCl、0.5% IGEPAL、0.1% sodium azide)、5 mM DTT、10 µg/mL leupeptin 及 10 µg/mL AEBSF] 回溶，混合均勻後於 95°C 乾浴作用 20 分鐘，期間每 5 分鐘將樣本震盪直到沉澱物消失。離心後取出細胞裂解液，加入anti-Flag M2 膠體 (Sigma) 在4°C 反應 1 小時，後以含 0.1 % IGEPAL 的 PBS 清洗膠體三次，以西方點墨法觀察 (Sapetschnig et al. 2002, Chang et al, 2004, Yang et al. 2013)。

八、西方點墨法分析 (Western blot)

將樣品以sample buffer (60 mM Tris-HCl pH 6.8 含 2% SDS、5% mercaptoethanol、

10% glycerol、2 mM EDTA 及 0.005% bromophenoblue) 稀釋後，於 95°C 乾浴作用 5 分鐘。依實驗需要將樣品加入 8、10 或 13% 的 SDS polyacrylamide 膠體中，以 168 V 進行膠體電泳。其後將 Hybond-C extra (Amersham Biosciences) 轉印膜覆蓋

(30)

於膠體上，置於 transfer buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.3 含 5.5% glycine 及 20%

methanol) 中以 94 V、400 mA 轉印 1 小時。以 TBST (20 mM Tris-HCl 含 150 mM NaCl 及 0.05% Tween 20) 清洗轉印膜，後以含 5% 安佳脫脂牛奶的 TBST 作用 30

分鐘。以 TBST 洗淨後加入一級抗體作用 1 小時。以 TBST 清洗後加入接有

horseradish peroxidase (HRP) 的二級抗體作用 30 分鐘。以 TBST 與二次水將轉印膜清洗淨後，後加入受質chemiluminescent HRP substrate (Millipore) 呈色，以 X-ray 底片 (FUJI) 進行偵測。

九、免疫螢光染色分析 (Immunofluorescence analysis)

293T 細胞培養於玻片上，轉染 24~40 小時後收起玻片。以 PBS 洗去多餘的細胞，後以4% paraformaldehyde (PFA) 於 4°C 作用 30 分鐘。以 PBS 洗去 PFA 後以含0.1% Triton X-100 的 PBS 作用 10 分鐘。以 PBS 洗去 Triton X-100 後以含 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) 的 PBS 作用 1 小時。以 PBS 清洗後加入一級抗體作用 1 小時。以 PBS 清洗後加入二級螢光抗體作用 45 分鐘，另取 5 µg/mL 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 加入玻片中作用 15 分鐘，以 PBS 清洗完成細胞的染色。在玻片上加入8 µL 的 Citifluor (Agar Inc.) 並覆蓋於載玻片上進行封片，後以Zeiss LSM 780 Confocal 進行觀察 (Chang et al, 2004)。

十、蛋白質穩定性分析

293T 細胞轉染所需質體 40 小時後加入 100 µg/ml cycloheximide (Sigma)，於不同時間點收取細胞，以西方點墨法分析蛋白質的含量 (Yang et al, 2013)。

(31)

十一、以 shRNA 抑制蛋白質表現

質體pLKO.1-shp62-D1-1 與 pLKO.1-shp62-E1-1 購買自中研院 RNAi 中心 (表 1)。使用 TurboFect (Fermentas) in vitro 將 300 ng shRNA 轉染至 293T 細胞中，培 養24 小時後再次轉染 300 ng shRNA，培養隔日即可抑制蛋白質表現。

(32)

結果

一、 TRIM5α SP 突變對其與 BORF1 結合的影響

本實驗室先前研究指出，TRIM5α 能透過 C 端的 B30.2 功能區與 EB 病毒的外鞘蛋白質 BORF1 直接結合，且 TRIM5α 會促進 BORF1 泛素化修飾，造成其穩定性下降 (徐詩媁, 2013)。同時目前已有研究顯示，B30.2 功能區上的 surface patch (SP) 突變後，會影響TRIM5α 抑制反轉錄病毒的感染 (Yang et al, 2014)，顯示 B30.2 功能區的SP 區域對 TRIM5α 抑制病毒能力的重要性。本實驗室先前已針對 TRIM5α SP2 數個胺基酸進行點突變，建立 pFlag-TRIM5α-mSP2 與 pEGFP-TRIM5α-mSP2 ( 圖 5A) 。在 293T 細胞中同時轉染質體 pHA-BORF1 與 pFlag-TRIM5α 、 pFlag-TRIM5α-mSP2 或控制組 pCMV-Tag2B，培養 24 小時後收取細胞，以抗 Flag

抗體膠體進行免疫沈澱，並以抗 HA 抗體進行西方點墨法偵測與共同結合的蛋白

質。實驗結果顯示，在單獨轉染 pHA-BORF1 的對照組中無法偵測到 HA-BORF1 蛋白質 ( 圖 5B, IP, lane 1) ，而在同時轉染質體 pFlag-TRIM5α 或 pFlag-TRIM5α-mSP2 與 pHA-BORF1 的組別中，則能偵測到 HA-BORF1 蛋白質 (圖 5B, IP, lanes 1, 2)。pFlag-TRIM5α-mSP2 之蛋白質表現量較 pFlag-TRIM5α 多 (圖 5B, Input, lanes 1, 2) ，但免疫沈澱所偵測到的 HA-BORF1 量卻少於轉染 pFlag-TRIM5α 的組別 (圖 5B, IP, lanes 1, 2)，顯示 TRIM5α SP2 胺基酸的突變會影響TRIM5α 與 EB 病毒外鞘蛋白質的結合。

接著本實驗繼續觀察SP 突變對於 TRIM5α 與 BORF1 在細胞內分布位置的影響。在 293T 細胞中轉染 pEGFP-TRIM5α 或 pEGFP-TRIM5α-mSP2 與 pHcRed-BORF1，培養 24 小時後進行螢光免疫分析。結果顯示，TRIM5α 與 BORF1

(33)

在細胞中以點狀共同分布於細胞質中 (圖 6, a-e)，而轉染 pEGFP-TRIM5α-mSP 的組別則未能觀察到共同分布的情形 (圖 6, f-j)。

二、泛素化與類泛素化修飾對 BORF1 穩定性的影響

以上實驗證實TRIM5α B30.2 功能區上 surface patch 區域對其與 BORF1 的結

合相當重要。本實驗室先前研究發現TRIM5α 與 BORF1 結合後會促進其泛素化修

飾，造成蛋白質穩定性下降，此外實驗室先前也對BORF1 各個 lysine 進行點突變篩選，發現到lysine 114 突變會造成 BORF1 泛素化修飾量大幅下降，顯示其可能為BORF1 主要泛素化修飾位置。本研究接著利用實驗室先前建立的 BORF1 lysine 114 突變表現質體 pFlag-BORF1-K114R，分析此 lysine 是否影響 TRIM5α 催化 BORF1 泛素化修飾的能力，並觀察泛素化與類泛素化修飾對其穩定性的影響。首先在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF、pFlag-BORF1-K114R 與 pcDNA3-HA 或 pHA-SUMO-2，轉染隔日加入 10 µM MG132 作用 12 小時後收取細胞，以抗 Flag

抗體的膠體進行免疫沉澱後，以抗 HA 抗體進行西方點墨法。結果顯示，在細胞

中共同表現pFlag-BORF1 與 pHA-SUMO-2 時，能偵測到 BORF1 的類泛素化修飾 (圖 7A, IP, lane 3)。以 pFlag-BORF1-K114R 取代 pFlag-BORF1 的組別類泛素化修飾量則較少 (圖 7A, IP, lane 4)，顯示此 lysine 點突變會造成 BORF1 類泛素化修飾量減少。

SUMO-targeted ubiquitin ligases (STUbLs) 為一類泛素接合酵素，能透夠過本

身的 SIM 區域與受類泛素化修飾的目標蛋白質結合並催化其泛素化修飾，顯示類

泛素與泛素化修飾可能有發生先後的關係 (附錄 4) (Uzunova et al, 2007, Geoffroy

& Hay 2009, Praefcke et al, 2012)，因此本研究接著觀察 BORF1 lysine 114 突變對其泛素化修飾的影響。在293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、pFlag-BORF1-K114R

(34)

與pHA-Ub，轉染 40 小時後收取細胞，接著以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱後，

利用抗 HA 抗體以西方點墨法偵測。結果顯示，在細胞中共同表現 pFlag-BORF1

與pHA-Ub 時，能偵測到 BORF1 明顯的泛素化修飾 (圖 7B, IP, lane 2)。若在轉染 pFlag-BORF1 與 pHA-Ub 的細胞中共同表現 pLPCX-TRIM5α 則能使 BORF1 的泛素化修飾量增加 (圖 7B, IP, lane 3)。以 pFlag-BORF1-K114R 取代 pFlag-BORF1 的組別泛素化修飾量則明顯下降 (圖 7B, IP, lanes 4-5)，證實此 lysine 點突變會造成 BORF1 泛素化修飾量減少。

確認 lysine 114 為 BORF1 重要泛素化修飾位置後，本研究接著觀察此 lysine 突變是否會影響其穩定性。在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1 、 pFlag-BORF1-K114R 與 pLPCX-TRIM5α ，轉染後 40 小時加入 100 µg/ml cycloheximide (CHX)，分別於 0、150、300 分鐘後收取細胞，以抗以抗 Flag 抗體、

抗TRIM5α 抗體及抗 α-Tubulin 進行進行西方點墨法分析。結果顯示，Flag-BORF1 在CHX 作用 150 分鐘後下降約 55%，而 Flag-BORF1-K114R 在 CHX 作用 300 分鐘後僅下降約10%，顯示降低泛素化修飾會造成 BORF1 穩定性上升 (圖 8A, B)。

上述實驗發現將BORF1 的 lysine 114 突變後，會使其泛素及類泛素化修飾量

下降，造成穩定性增加，本研究進一步分析此現象是否起因於 lysine 突變干擾

TRIM5α 與 BORF1 的結合能力。在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、

pFlag-BORF1-K114R 與 pLPCX-TRIM5α，轉染後 24 小時後收取細胞，以抗 Flag

抗體膠體進行免疫沈澱，並以抗 TRIM5α 抗體進行西方點墨法偵測與共同結合的

蛋白質。實驗結果顯示單獨轉染pLPCX-TRIM5α 的組別無法在免疫沈澱後偵測到

TRIM5α 蛋白質 ( 圖 9, IP, lane 1) ，而在同時轉染質體 pFlag-BORF1 以及 pLPCX-TRIM5α 的組別中，可以偵測到 TRIM5α 蛋白質 (圖 9, IP, lane 2)。轉染 pFlag-BORF1-K114R 與 pLPCX-TRIM5α 的組別在進行免疫沈澱後能觀察到更多的

(35)

TRIM5α 蛋白質 (圖 9, IP, lane 3)，顯示將 BORF1 的 lysine 114 突變並不會影響其與TRIM5α 的結合。

三、 p62 與 BORF1 在細胞內的結合

本實驗室先前研究發現TRIM5α 催化後的 BORF1 具有 K63 長鏈的泛素 (徐詩媁, 2013)，顯示 BORF1 可能透過自噬作用途徑降解。過去研究指出選擇性自噬作用的自噬受體蛋白質p62，其 UBA domain 可專一性地與被 K63 鍵結長鏈泛素化修飾後的蛋白質結合，且p62 已被報導能與 TRIM5α 結合並增加其穩定性 (O'Connor et al, 2010)，因此推測 p62 可能協助 TRIM5α 透過選擇性自噬作用來降解 BORF1。

本研究首先觀察 p62 與 BORF1 在細胞內是否結合，在 293T 細胞中同時轉染質體 pHA-BORF1、pFlag-p62 與 pLPCX-TRIM5α，培養 40 小時後收取細胞，以抗 Flag

抗體膠體進行免疫沈澱，並以抗 HA 抗體進行西方點墨法偵測與共同結合的蛋白

質。實驗結果顯示，若僅單獨轉染 pHA-BORF1，在進行免疫沈澱後無法偵測到

HA-BORF1 (圖 10A, IP, lane 1)，而在同時轉染質體 pFlag-p62 以及 pHA-BORF1 的組別中，可以偵測到 HA-BORF1 (圖 10A, IP, lane 2)。若在轉染 pFlag-p62 與 pHA-BORF1 的細胞中共同表現 pLPCX-TRIM5α 則能觀察到可能為泛素化修飾後的HA-BORF1 蛋白質 (圖 10A, IP, lane 3)，顯示 p62 在細胞內會與 EB 病毒外鞘蛋白質結合，且TRIM5α 能增加其結合量。

確認了 p62 與 BORF1 會在細胞內結合後，本研究接著觀察 BORF1 上的泛素化修飾對其與 p62 結合的影響。在 293T 細胞中同時轉染質體 pFlag-BORF1、

pFlag-BORF1-K114R 與 pDsRed-p62，培養 24 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠

體進行免疫沈澱，並以抗 p62 抗體進行西方點墨法偵測與共同結合的蛋白質。實

驗結果顯示，在單獨轉染pDsRed- p62 的對照組中無法偵測到 RFP-p62 蛋白質 (圖

(36)

10B, IP, lane 1)，在同時轉染質體 pFlag-BORF1 以及 pDsRed-p62 的組別中，則可以觀察到與Flag-BORF1 共免疫沉澱下來的 RFP-p62 以及 p62 蛋白質 (圖 10B, IP, lane 2)。以 pFlag-BORF1-K114R 取代 pFlag-BORF1 的組別可以觀察到 RFP-p62 以及p62 蛋白質的結合量明顯下降 (圖 10B, IP, lane 3)，顯示 BORF1 上泛素化修飾量下降會干擾其與p62 的結合。

四、 p62 與 BORF1 在細胞內的分布位置

實驗室先前在 P3HR1 細胞中觀察到 TRIM5α 會與 EB 病毒外鞘蛋白質在細胞

質中呈點狀共同分布，此外也有文獻顯示 p62 會與 TRIM5α 在細胞中共同分布，

因此本研究將進一步觀察 p62 與 BORF1 在細胞中的分布位置。在 293T 細胞中轉染pEGFP-C2 或 pEGFP-C2-BORF1，培養 40 小時後以抗 p62 抗體進行螢光免疫分析。結果顯示，p62 與 BORF1 在細胞中以點狀共同分布於細胞核內 (圖 11, f-j)，

而轉染pEGFP-C2 的控制組則未能觀察到共同分布的情形 (圖 11, a-e)。

五、選擇性自噬作用對 BORF1 穩定性的影響

以上實驗結果顯示，TRIM5α 能促進 BORF1 K63-linked 泛素化修飾，使得 BORF1 被 p62 辨認，因此後續實驗將繼續探討 BORF1 是否會由 p62 帶往選擇性自噬作用降解途徑。在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1 、 pHA-Ub 或 pHA-Ub-K63，隔日加入 60 µM chloroquine 或對照組 H2O 作用 16 小時後收取細胞，

以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱，後利用抗 HA 抗體進行西方點墨法分析。結

果顯示，在以chloroquine 處理的組別中，LC3B-II 的表現量較未加藥的控制組高 (圖 12, Input, lanes 4-6)，顯示 chloroquine 抑制了溶酶體的活性，導致自噬體的累積。

在細胞中共同表現pFlag-BORF1 與 pHA-Ub 或 pHA-Ub-K63 時，能偵測到 BORF1

(37)

的泛素化修飾 (圖 12, IP, lanes 2, 3, 5, 6)。比較以 chloroquine 處理的組別與未加藥

的控制組可以發現，若抑制溶酶體的活性會使BORF1 泛素化修飾的現象更為顯著

(圖 12, IP, lanes 5, 6)，顯示抑制溶酶體的活性會使受泛素化修飾的 BORF1 累積。

BORF1 K63 鍵結長鏈泛素化修飾的累積，顯示其與 p62 的結合量可能也會提

昇，因此本研究進一步觀察抑制溶酶體的活性對BORF1 與 p62 結合量的影響。在

293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1，隔日加入 60 µM chloroquine 或對照組 H2O 作用16 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體的膠體進行免疫沉澱後，以抗 p62 抗體進行

西方點墨法。結果顯示，在細胞中表現 pFlag-BORF1 後進行免疫沈澱，並無法偵

測到結合 p62 蛋白質 (圖 13, IP, lane 2)。若在轉染 pFlag-BORF1 細胞中以 chloroquine 處理，則能觀察到 p62 蛋白質的結合 (圖 13, IP, lane 4)，顯示抑制溶酶體活性能增加p62 與 BORF1 的結合量。

本研究接著觀察抑制溶酶體活性對於p62 與 BORF1 在細胞中的分布位置的影

響。在293T 細胞中轉染 pEGFP-C2-BORF1，隔日加入 60 µM chloroquine 或對照組H2O 作用 16 小時後收取細胞，以抗 p62 抗體進行螢光免疫分析。結果顯示，相較於未加藥處理的組別 (圖 11, f-j)，以 chloroquine 處理後的細胞能觀察到在細胞內點狀分布的p62 增加，且 p62 與 BORF1 共同分布的情形更為明顯 (圖 11, k-o)，

顯示抑制溶酶體活性會累積與BORF1 結合的 p62 蛋白質。

在確認BORF1 會與 p62 結合並透過溶酶體降解後，本研究接著觀察 p62 是否直接影響 BORF1 的蛋白質表現量。在 293T 細胞中轉染質體 pFlag-BORF1、

pFlag-BORF1-K114R 與 p62 shRNA D1-1 和 E1-1 或控制組 Ct-shRNA，培養 24 小時後再次轉染 shRNA D1-1 和 E1-1 或控制組 Ct-shRNA，隔日收取細胞以抗 Flag 抗體進行西方點墨法偵測。實驗結果顯示，轉染 shRNA D1-1 和 E1-1 的組別 p62

(38)

蛋白質表現量明顯受到抑制 (圖 14, lanes 2, 4)，而相較於控制組 Flag-BORF1 表現量明顯上升 (圖 14, lanes 2, 4)，顯示 p62 會造成 BORF1 的的蛋白質表現量下降。

(39)

討論

EB 病毒生活史包括潛伏期與溶裂期，病毒進入溶裂期後會大量表現病毒基因，

進行遺傳物質的複製以及病毒顆粒的組裝，其中外鞘蛋白質的產生及組裝是溶裂晚期非常重要的步驟。TRIM5α 是反轉錄病毒的限制因子，研究指出 TRIM5α 會使反轉錄病毒外鞘蛋白質解散而影響病毒的感染 (Stremlau et al, 2006)。本實驗室

先前研究也發現TRIM5α 會造成 EB 病毒外鞘蛋白質泛素化修飾的增加，進而導致

外鞘蛋白質降解而抑制EB 病毒溶裂期的發展 (徐詩媁, 2013)。本研究進一步發現 TRIM5α B30.2 功能區上的 surface patch 區域突變會影響其與 EB 病毒外鞘蛋白質 BORF1 結合，且 lysine 114 是 BORF1 上重要的泛素化修飾位置，對 BORF1 蛋白

質穩定性有重要影響。接著，受到泛素化修飾的BORF1 會被宿主的選擇性自噬作

用受體蛋白質p62 辨認，帶往自噬體中經由溶酶體途徑降解。

TRIM5α 催化 BORF1 的泛素化修飾並影響其穩定性

本實驗室先前研究已證實TRIM5α 能透過其 C 端 B30.2 功能區與 EB 病毒外鞘蛋白質直接結合，且造成外鞘蛋白質的泛素化修飾增加導致穩定性下降 (徐詩媁, 2013)。過去研究分析 B30.2 功能區的結構，發現到若將稱為 surface patch 區域，

即一系列暴露在表面的帶電胺基酸突變，並不影響 TRIM5α 與病毒外鞘蛋白質的

結合，但會使 TRIM5α 喪失限制反轉錄病毒感染的能力，顯示 B30.2 功能區可能

具有除了蛋白質結合以外的功能 (Yang et al, 2014)。本研究發現 surface patch 區域突變會造成 TRIM5α 與 BORF1 的結合量下降 (圖 5)，且在細胞內不會與 BORF1 共同分布 (圖 6)，顯示 TRIM5α 影響 EB 病毒外鞘蛋白質的方式可能與其限制反轉錄病毒的機制並不完全相同。

(40)

本實驗室先前研究顯示，若將 TRIM5α 的 SIM domain 突變會使其無法促進 BORF1 的泛素化修飾，因此 TRIM5α 可能為 BORF1 的 STUbL (徐詩媁, 2013)，能

辨認BORF1 上的類泛素化修飾後進一步催化其泛素化修飾 (附錄 4)。本實驗室纖

前已針對 BORF1 各個 lysine 進行點突變，分析其對 BORF1 泛素化修飾的影響，

結果發現到BORF1 lysine 114 突變會造成其泛素化修飾量大幅下降。在本研究中觀察BORF1 lysine 114 點突變，可以發現到其泛素化以及類泛素化修飾皆較未突變的BORF1 來的少，且 TRIM5α 無法促進 BORF1 lysine 114 點突變的泛素化修飾 (圖 7)，此外，在穩定性分析實驗中可以觀察到 BORF1-K114R 比 BORF1 穩定 (圖 8)。此外本研究進一步實驗發現 BORF1-K114R 與 TRIM5α 的結合量較正常的 BORF1 還要高，顯示此 lysine 突變並不影響 BORF1 與 TRIM5α 之間的結合 (圖 9)，因此推論穩定性增加的原因可能起因於類泛素化修飾較少導致 TRIM5α 無法促進其泛素化修飾，或此lysine 是 BORF1 主要的泛素化修飾位置。

TRIM5α 催化 BORF1 泛素化修飾增強其與 p62 的結合

過去研究指出選擇性自噬作用的受體蛋白質p62 具有 UBA 功能區，可專一性

地與 K63 鍵結長鏈泛素化修飾後的蛋白質結合，導致目標蛋白質透過自噬作用途

徑降解 (Pankiv et al, 2007)。本實驗室先前研究發現 TRIM5α 能催化 BORF1 的泛素化修飾具有 K63 鍵結長鏈 (徐詩媁, 2013)，且過去文獻顯示 p62 會與 TRIM5α 結合並穩定TRIM5α (O'Connor et al, 2010)，因此推測 BORF1 在經過 TRIM5α 催化

泛素化修飾後，可能會被 p62 專一性辨認並走向自噬作用降解途徑。本研究首先

觀察到p62 與 BORF1 在細胞內結合，且若同時表現 TRIM5α 能觀察到 p62 會結合

受轉譯後修飾的 BORF1，推測其應為受 K63 鍵結長鏈泛素化修飾的 BORF1。此

外，在實驗結果中也可以觀察到p62 會與沒有經過泛素化修飾的 BORF1 蛋白質結

(41)

合，顯示期間可能有直接結合關係 (圖 10A)，而 p62 是透過什麼功能區與 BORF1 結合尚待釐清。本研究接著利用K114R 點突變的 BORF1 觀察到，若 BORF1 泛素化修飾量下降會導致其與p62 的結合能力減弱 (圖 10B)，顯示 BORF1 上的泛素化修飾會影響其與p62 的結合，而 TRIM5α 能藉由促進 BORF1 上的泛素化修飾而增加p62 與 BORF1 的結合量。

本實驗室先前研究觀察到TRIM5α 會與 EB 病毒外鞘蛋白質在細胞質共同分布

(徐詩媁, 2013)。此外，也有文獻指出 TRIM5α 會與 p62 共同分布在細胞內 (O'Connor et al, 2010)，顯示 TRIM5α 可能會與 p62 一同作用降解 EB 病毒外鞘蛋白質。本研究利用免疫螢光染色，觀察到 p62 與 BORF1 在細胞核共同分布 (圖 11)，但此分布位置與TRIM5α 和 BORF1 共同分布位置不同。近年來研究指出 EB 病毒進入溶

裂期後，病毒的外鞘蛋白質會在細胞核內與 PML-NBs 共同分布，且 BORF1 在胞

外能與 PML 直接結合，推測 EB 病毒在組裝病毒顆粒時是由 BORF1 將其餘外鞘

蛋白質帶入核內，並於PML-NBs 處進行病毒顆粒組裝 (Wang et al, 2015)。過去研究也顯示p62 會在核內與 PML 結合，且能導致 PML 透過自噬作用降解 (Wang et al, 2011)。綜合以上文獻可推測，p62 能透過其入核序列進入核內結合 PML 與組裝中

的外鞘蛋白質，後將兩者帶到細胞質的自噬體中將解，而 TRIM5α 在此機制中所

扮演的角色則需要進一步的釐清。

TRIM5α 透過選擇性自噬作用降解 BORF1

p62 做為自噬作用的自噬受體，能將目標蛋白質送入自噬體 (autophagosome)，

之後透過與溶酶體融合後將之降解回收 (附錄 5)。本研究以溶酶體抑制劑 chloroquine 觀察到，若將溶酶體活性抑制，會累積受 K63 鍵結長鏈泛素化修飾的 BORF1，且在外送 K63 鍵結長鏈泛素的組別中，能觀察到 BORF1 的表現量會因

(42)

為chloroquine 的處理而增加，顯示抑制溶酶體活性能增加 BORF1 的蛋白質穩定性 (圖 12)。此外，chloroquine 亦能造成 p62 與 BORF1 的結合量上升 (圖 13)、在細胞內更明顯的共同分布 (圖 11)，證明 BORF1 會透過選擇性自噬作用途徑降解，

若抑制溶酶體的活性會導致BORF1 維持在與 p62 結合的狀態。

本實驗室先前研究觀察到TRIM5α 會降低 BORF1 的穩定性 (徐詩媁, 2013)，

同時過去文獻中指出p62 會與 TRIM5α 結合並增加其穩定性 (O'Connor et al, 2010)，

顯示p62 可能幫助 TRIM5α 來降解 BORF1。本研究發現抑制細胞內 p62 表現會導致BORF1 表現量上升 (圖 14)，證明 p62 會降低 BORF1 的穩定性，推測其作用機

制可能是透過將BORF1 帶到自噬體中透過溶酶體活性分解，或是 p62 可能間接以

穩定TRIM5α 的方式使 BORF1 表現量下降。

TRIM5α 做為選擇性自噬作用的自噬受體

近期研究指出 TRIM 家族蛋白質能調控自噬作用，且 TRIM5α 具有 LIR 功能區，能與Atg8 (GABARAP) 蛋白質結合，做為 ULK1 與 Beclin 1 的結合平台，幫助自噬作用起始。此外同篇研究也顯示，TRIM5α 能透過 C 端 B30.2 功能區直接辨

認反轉錄病毒蛋白質p24，並透過選擇性自噬作用使其降解，顯示 TRIM5α 也能做

為選擇性自噬作用的受體 (Mandell et al, 2014) (附錄 6)。未來研究可以建立 TRIM5α LIR 突變之質體，觀察缺乏 LIR 功能區的 TRIM5α 是否喪失影響 BORF1 穩定性的能力，或觀察RING 功能區突變的 TRIM5α 是否仍能使 BORF1 降解，藉此釐清TRIM5α 是否可做為自噬受體將 BORF1 送入自噬體降解。

(43)

TRIM5α 瓦解 EB 病毒外鞘殼體結構

本實驗先前研究中利用 P3HR1 收集胞外病毒顆粒，在去除外套膜後觀察

TRIM5α 對病毒外鞘殼體泛素化修飾的影響，結果顯示 TRIM5α 的存在會增加病毒外鞘殼體的泛素化修飾 (徐詩媁, 2013)。EB 病毒組裝好的外鞘殼體中，VCA 蛋白質能與BFRF3、BDLF1 以及 BORF1 直接結合，然而 BFRF3 與 BDLF1 或 BORF1 則沒有直接的結合 (Wang et al, 2011)。基於以上原因，未來可利用 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)，在 96 孔盤上固定抗 BFRF3 抗體以抓下病毒

外鞘殼體，後利用抗 BORF1 或 BDLF1 抗體偵測病毒外鞘殼體組裝量。未來實驗

可以使用抑制TRIM5α 或 p62 表現的 P3HR1 細胞株，運用上述 ELISA 技術，分析是否干擾病毒外鞘殼體的組裝。

綜合本以上結果，本研究發現TRIM5α 可能透過選擇性自噬作用影響 EB 病毒

外鞘蛋白質的穩定性，且p62 對 EB 病毒的溶裂期發展可能也有重要的影響。綜合

本研究與實驗室先前的實驗證據，希望在未來能夠釐清TRIM5α 是否確實能與 p62

偕同作用，透過選擇性自噬作用造成組裝好的病毒外鞘殼體瓦解，降低病毒顆粒

的產量。本研究結果有助於了解宿主抑制EB 病毒溶裂期進展的機制，期能運用於

EB 病毒相關疾病的治療。

(44)

圖表

圖 1、EB 病毒的結構

EB 病毒攜帶的遺傳物質為的線性雙股 DNA，由內至外依序由外鞘 (capsid)、間質 (tegument) 及外套膜 (envelope) 所包覆，而外套膜上嵌有病毒的膜蛋白質。

(45)

圖 2、TRIM5α 的功能區

TRIM5α 的蛋白質組具由 N 端到 C 端依序有 RING、B-box、coiled-coil 及 B30.2 (SPRY) 功能區。RING 功能區使其具有泛素 E3 連接酶的角色，此外 RING 功能區雙體化偕同 B-box 與 coiled-coil 功能區能幫助 TRIM5α 形成高度聚合晶格結構 (higher-order self-association oligomers)。C 端的 B30.2 (SPRY) 功能區則能結合目標蛋白質，在不同物種間具有特異性。

(46)

圖 3、TRIM5α 限制反轉錄病毒的機制

當反轉錄病毒核心進到細胞內時，TRIM5α 會與病毒的外鞘殼體結合，並利用其泛素E3 連接酶活性促使病毒的外鞘蛋白質前往 proteasome 或自噬作用途徑降解，

導致病毒外鞘殼體提早解體而抑制反轉錄作用進行。此外TRIM5α 能透過與病毒

的preintegration complex (PIC) 結合，使得其無法進入細胞核進行嵌合作用，因而限制病毒的感染。