分別抽取注射白點症病毒顆粒及 60 l 1 × PBS 緩衝液的白蝦血球細胞，於注射 後 24 小時內各時間點 (0, 2, 4, 8, 12, 24 hpi.) 抽取 9 隻白蝦樣本(每組 3 隻)的白蝦 血球細胞後，再以 1/3 × PBS 溶解進行 Bradford assay 的蛋白濃度定量，加入 12
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其酚氧化酶吸光值於注射後 0 小時約為 0.2 與控制組無顯著差異 (P > 0.05)，於注 射後第 4 小時後其酚氧化酶吸光值上升約為 0.35 是控制組的 1.5 倍有顯著差異 (P
< 0.05)，注射後第 12 小時後其酚氧化酶吸光值下降至 0.2 為控制組的 0.8 倍無顯著 差異 (P > 0 .05)，注射後第 24 小時其酚氧化酶吸光值回復至 0.2 與控制組無顯著 差異 (P > 0.05)；注射稀釋 100000 倍白點症病毒液 60 l 白蝦血球細胞溶解液為實 驗組其酚氧化酶吸光值於注射後 0 小時約為 0.2 與控制組無顯著差異 (P > 0.05)，
於注射後第 4 小時後其酚氧化酶吸光值上升約為 0.75 是控制組的 3.5 倍有顯著差 異 (P < 0.005)，注射後第 12 小時後其酚氧化酶吸光值下降至 0.2 為控制組的 1/2 倍無顯著差異 (P > 0.05)，注射後第 24 小時其酚氧化酶吸光值回復至 0.2 與控制組 無顯著差異 (P > 0.05) (Fig. 8A)，同時以 proPO 抗體定量各時間點的 proPO 含量變 化，發現控制組各時間的 proPO 變化量不大，而感染後的 proPO 變化量也不大 (Fig.
8B)。
9. WSSV364 與 WSSV IE1 重組蛋白的純化
由大腸桿菌表現後的重組蛋白 GST-364 及 GST-IE1，通過 GST column 純化後 的產物 與 Thrombin 在 4℃下作用至少 13 小時後，再次通過 GST column 後得到 分子量大小約 51 kD 的 WSSV 364 (Fig. 9, Lane 1) 與 分子量大小約 26 kD 的 WSSV IE1。WSSV 364 則作為酚氧化酶活性分析的負控制組；WSSV IE1 則做為酚 氧化酶活性分析的實驗組。
10. IE1 對酚氧化酶活性之影響
共抽取 9 隻白蝦樣本（每組 3 隻）的白蝦血球細胞，再以 1/3 × PBS 溶解進行
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(P < 0.05)； 3 g IE1 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液反應 5mins 為實驗組織酚 氧化酶吸光值為 0.05 是控制組的 1/2 倍有顯著差異 (P < 0.05)；30 l LPS (3 mg/ml) 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液反應 10mins 之陽性控制組的酚氧化酶吸光值為 0.7，控制組的 7 倍且有顯著差異 (P < 0.0005)；30 l LPS (3 mg/ml) 與 12 g/l 的 白蝦血球細胞溶解液反應 5mins 為陽性控制組之酚氧化酶吸光值為 0.7，控制組的 7 倍且有顯著差異 (P < 0.0005)；12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液先與 30 l LPS (3 mg/ml) 反應 10mins 後再與 3 g IE1 反應 5mins 後的酚氧化酶吸光值為 0.37 是控 制組的 4 倍 (P < 0.005)，僅以 30 l LPS (3 mg/ml) 處理之陽性控制組的 1/2 倍且 有顯著差異 (P < 0.005)；12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液先與 3 g IE1 反應 10mins 後再與 30 l LPS (3 mg/ml) 反應 5mins 後的酚氧化酶吸光值為 0.1 與控制組無顯著 差異(P > 0.05)，為僅以 30 l LPS (3 mg/ml) 處理之陽性控制組的 1/7 倍有顯著差 異 (P < 0.005)；30 l 1 mM PTU 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為陰性對照組 之酚氧化酶吸光值約為 0.05，是控制組的 1/2 倍且與控制組有顯著差異 (P < 0.05) (Fig. 11)。
23 et al., 1993; Kaliappan and Sugumaran, 1996)，因此本實驗選用 Heparin (500 Units/ml)
做為本次實驗的抗凝劑。本次實驗的 CAC 緩衝液不會對酚氧化酶的活性造成影響，
的透明球 (Gary and Graves, 1985; Soderhall and Smith, 1983)，本次實驗直接利用抗 凝劑抽取蝦血球細胞進行酚氧化酶活性分析，粗抽後的血球細胞及血淋巴液含有 許多原酚氧化酶系統的相關蛋白因子 (Soderhall et al., 1990)，而無脊椎動物的原酚 氧化酶可能存在血淋巴液中或血球細胞中 (Sung et al., 1998; Kaliappan and
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Sugumaran, 1996; Soderhall and Cerenius, 1992, 1998; Johansson and Soderhall, 1989;
Pikul et al., 2006; Teresa et al., 1999; Washington and Danker, 1997; Yeh et al., 2009a)。
前人研究對於粗抽之血淋巴液進行酚氧化酶活性分析而未能有活性反應；對粗抽 血球細胞進行酚氧化酶活性分析則可測到酚氧化酶酵素的活性反應 (Sung et al., 1998; Soderhall and Hall, 1984; Teresa et al., 1999)，因血淋巴液中含有許多的蛋白酶 抑制劑，如：macroglobulin、serpin 等 (Soderhall et al., 2009b; Kallaya and Soderhall, 2000) 會抑制血淋巴液中酚氧化酶活性，使其活性測試需要反應約 24 小 2007; Yeh et al., 2009a; Yeh et al., 2009b)。感染白點症病毒後的蝦其酚氧化酶下降的 原因可能與白點症病毒極早期蛋白有關，所以利用遠端西方墨點法，探索能與 IE1 後酚氧化酶活性和基因表現量迅速下降的情形不同 (Siriporn et al., 2008; Suseela et al., 2007; Yeh et al., 2009b) 因此利用純化後的病毒顆粒進行酚氧化酶活性分析，發 現能隨著病毒顆粒劑量增加而刺激酚氧化酶活性上升 (Fig. 6)。本篇論文利用純化
25 球蛋白進行蛋白等量定量 (Sung et al., 1998; Soderhall et al., 2009)，雖然每次進行 實驗的總蛋白量有經過定量且為同等蛋白量，但是每隻蝦子所含有的酚氧化酶在 總蛋白的比例不同，且蝦子的酚氧化酶在蝦子脫殼前階段的酚氧化酶活性會上升 而脫殼後的酚氧化酶會下降 (Liu et al., 2006)，因此蝦子的個體差異可能會造成實 驗上的誤差，因此本實驗的測定時間點都有增加樣本數且三重複以減少個體誤差 (Fig. 7)。由於利用總粗抽蛋白的測定活性方式僅能測定到相對的活性變化，而本
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次實驗皆以定量後的總粗抽蛋白進行實驗 (Fig. 6, 7, 8, 10, 11)，所以不能排除酚氧 化酶活性的上升和下降是受到其他非病毒的相關因子干擾，例如：ROS 的反應或 者白蝦的血液凝集系統等都有可能影響蝦子的酚氧化酶活性 (Ji et al., 2011; Nagai et al., 2000; Cammarata and Parrinello, 2009)；此外，前人也利用 blue sepharose 及
phenyl sepharose column 移除甲殼類血液的血藍素並將鱟的原酚氧化酶純化出來 並進行酵素的活性測定，因此在活性測定方面可以較精準的測到比活性 (Aspan and Soderhall, 1991; Teresa et al., 1999)。前人研究發現，純化後的原酚氧化酶的分 子量大小為 76 kD 左右且經由蛋白酶的截切後產生分子量大小 60 kD 和 62 kD 的
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測定活性的同時也加入了 WSSV364 做為負控制組顯示不是所有病毒蛋白都能調 控酚氧化酶的活性下降，並同時加入了活化劑和抑制劑做為對照，確定酚氧化酶 活性分析平台是可以正常進行實驗 (Fig.10)，發現酚氧化酶能隨著 IE1 之劑量增 加而下降 (Fig.10)，隨後做了活化前後的酚氧化酶活性分析並同時加入 IE1 試圖 探索 IE1 在酚氧化還原酵素活化系統中可能作用之途徑，發現在先加入 IE1 蛋白後 再活化酚氧化酶的實驗組活性數值僅為以活化劑處理之酚氧化酶活性 1/2-1/4 倍 (Fig.11)，且與控制組無顯著差異 (p < 0.05)，顯示 IE1 病毒蛋白確實能與原酚氧化 酶活化系統的上游蛋白作用阻擋原酚氧化酶活化路徑。
儘管如此，在探索 IE1 如何降低白蝦酚氧化酶活性的途徑上仍是需要持續努 力，因為目前的研究在病毒與酚氧化酶的報告相當不清楚。未來的研究除了持續 探索可能的交互作用因子之外也需要探索白點症病毒其餘 15 個極早期表現基因的 功能和是否能抑制或刺激酚氧化酶的活性上升。另外，除了利用蛋白體的方法持 續探索外也該利用其他的交互作用方法探索其他能與酚氧化酶交互作用的白點症 病毒蛋白。先前的研究利用免疫螢光檢測證實原酚氧化酶主要存在血球細胞的顆 粒和半顆粒球中，但是對於顆粒和半顆球中的顆粒是否含有原酚氧化酶及是否含 有可能影響酚氧化酶活化或抑制的可能因子仍需要進行免疫螢光染色等方法證明 之。
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結論
本篇論文主要為白點病毒極早期表現基因 IE1 於原酚氧化酶活化系統上的角 色探索，先前的研究發現甲殼類生物在感染白點症病毒後白蝦酚氧化酶的活性與 其基因表現量會迅速的降低，然宿主與病毒間的抗衡機制尚未清楚，因此本篇論 文假設感染白點症病毒的白蝦酚氧化酶之活性下降與白點症病毒極早期表現基因 IE1 有關，在測試不同的緩衝液系統並穩定白點病毒極早期表現基因 IE1 後，隨即 進行遠端西方墨點法的交互作用分析，發現 IE1 能與原酚氧化酶系統中的上游蛋 白血藍素、原酚氧化酶和轉谷氨酰胺酶交互作用。此外，將純化病毒顆粒於 in vitro 實驗分析，發現白點病毒顆粒會刺激酚氧化酶活性上升，隨後將白點病毒顆粒注 射於白蝦體內，觀察注射後 24 小時內白蝦酚氧化酶活性的時序變化，發現注射純 化病毒顆粒四小時後，白蝦酚氧化酶的活性會上升，隨後其酚氧化酶的活性則於 注射後 8-12 小時急劇降低，於注射白點病毒顆粒後 24 小時的白蝦酚氧化酶活性能 恢復至與控制組無顯著差異；另外，在利用病毒液進行人工注射感染後，觀察感 染後 24 小時的酚氧化酶活性變化也有相同的趨勢。更利用純化的白點病毒極早期 表現基因 IE1 進行酚氧化酶活性分析，發現白點症病毒極早期表現基因 IE1 能有效 抑制白蝦酚氧化酶活性；原酚氧化酶活化前後分別加入白點病毒極早期表現基因 IE1 發現其酚氧化酶活性皆較僅以活化劑激活的酚氧化酶活性低，因此白點病毒極 早期表現基因 IE1 能與原酚氧化酶活化系統的原酚氧化酶交互作用並抑制其活化 途徑與酵素活性。
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未來研究方向
白點症病毒極早期表現蛋白 IE1 能抑制酚氧化酶的活性且能與原酚氧化酶活 化系統的上游蛋白交互作用而抑制其活化路徑；但仍需增加交互作用的驗證方法 確認 WSSV IE1 與交互作用的蛋白為確實的現象，將嘗試構築谷氨酰胺轉胺酶、
原酚氧化酶及血藍素進行 pull-down assay 及 coimmunoprecipitation 證實是否能有 交互作用；此外，也需利用 blue sepharose 移除白蝦血球溶解液的血藍素，再利用 該白蝦血球溶解液進行遠端西方墨點法分析，以排除血藍素的沾黏與訊號干擾，
而 WSSV IE1 是否能與蛋白酶抑制劑有交互作用也仍需驗證。若確認 WSSV IE1 能與蛋白酶抑制劑交互作用後則能在原酚氧化酶活化系統與白點症病毒之間的關 係提供重要的參考資訊。
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參考文獻
Aspan A, Soderhall K (1991) Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells and its activation by an endogenous serine proteinase. Insect Biochem 21: 363-373 Aspan A, Huang TS, Cerenius L, Soderhall K, (1995) cDNA cloning of prophenoloxidase from the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus and its activation. PNAS 92: 939-943
Beck MH, Strand MR (2007) A novel polydnavirus protein inhibits the insect prophenoloxidase activation pathway. PNAS 104: 19267-19272
Blissard GW (1996) Baculovirus-insect cell interactions. Cytotechnology 20: 73– 93 Blissard GW, Rohrmann GF (1990) Baculovirus diversity and molecular biology. Annu Rev Entomol 35: 127– 155
Bradbury SL, Jakoby WB (1972) Glycerol as an enzyme-stabilizing agent: effects on
Bradbury SL, Jakoby WB (1972) Glycerol as an enzyme-stabilizing agent: effects on