酚氧化酶活性檢測… - 蝦白點病毒極早期表現蛋白WSSV IE1在白蝦原酚氧化酶活化系統上的角色探索

參考前人的實驗 (Sung et al., 1998)，利用 1 倍體積的抗凝血劑 (30 mM Sodium Citrate, 338 mM NaCl, 115 mM Glucose, 277U/ mg Heparin, Osmolarity = 780 osm/kg, pH 7.55) 混和三倍體積的蝦血，抽出後的蝦血球細胞將其混合均勻後，在 4℃ 3,000

× rpm 離心 10 分鐘，移除上清液。再利用 Cacodylate-citrate buffer (0.01 M Cacodylate, 0.45 M sodium Chloride, 0.1 M Sodium Citrate, pH 7) 懸浮細胞以 4℃ 3,000 × rpm 離心 10 分鐘，重複此步驟兩次後，移除上清液。收取細胞並以 1/3 × PBS 溶解血球細胞，此時再進行 4℃ 10,000 × rpm 離心 2 分鐘，移除細胞溶解沉澱物，吸取細胞溶解上清液進行 Bradford assay 蛋白定量測定，測定總血球蛋白量為 12 g/l，

加入 96 孔盤後，再分別加入重組病毒蛋白 WSSV IE1 0.3, 1, 3 g、WSSV364 0.3, 1, 3 g，以及 30 l 活化劑 (3 mg/ml LPS)、30 l 5% SDS，抑制劑 30 l 1 mM Phenylthiurea (PTU) 於 30℃各別同時反應 10 分鐘，再加入受質左旋多巴胺 (3 mg/ml L-DOPA) 30℃反應 10 分鐘，並以 Cacodylate (CAC) buffer (0.01 M cacodylate, 0.45 M NaCl, 0.01 M CaCl2, 0.26 M MgCl2, pH 7) 補充每孔最終體積至 120 l，測定 OD 490 吸光值。

結果

1 純化重組蛋白 WSSV IE1

在比較含有不同濃度 glyceorl 的緩衝液 A (50 mM Tris-HCl , 500 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.8) 於 IE1 純化過程的差別後，發現以未含有 glycerol 的緩衝液 A 純化之 IE1 容易降解 (Fig. 1, Panel A)；而以含有 10% glycerol 的緩衝液 A 純化之 IE1 較為穩定 (Fig. 1, Panel B) 且以含有 20% glycerol 的緩衝液 A 純化之 IE1 也較為穩定 (Fig. 1, Panel C)，因此純化過程中的緩衝液需至少含有 10% glycerol 以穩定 IE1

蛋白之純化過程。

2 Thrombin 與 GST- IE1 於低溫 4℃之反應

將純化後 GST-IE1 置於緩衝液 A (50 mM Tris-HCl , 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% Glycerol, pH 7.8)，進行離心濃縮，再與 Thrombin 在低溫 4℃下反應約 20 小時移除 GST-IE1 的 GST 蛋白，移除後的 GST 和 IE1，其分子量大小皆為 26 kD (Fig.

2, Lane 1)；GST-IE1 與 Thrombin 在室溫 20℃下反應約 3 小時後的 GST 和 IE1 ，其分子量大小約為 26kD (Fig. 2, Lane 2)，thrombin 於 4℃下仍可與 GST-IE1 作用且不會有蛋白沉澱的現象。

3 純化重組蛋白 IE1 鑑定

將與 thrombin 於 4℃下反應 20 小時後的 GST-IE1 蛋白再以 GST column 純化 IE1，

IE1 之分子量大小約為 26kD ，由 N 端定序後發現該蛋白的胺基酸序列 GSPEFMAFNEE 中的 GSPEF 為 vector pGEX 4T-1 的 GST 部分序列，而 MAFNEE 始為 IE1 蛋白序列 (Fig. 3, Lane 1)。

4 西方墨點法分析純化之重組蛋白 IE1

將所純化之重組蛋白 0.3 g IE1 進行 15% SDS 聚丙烯醯胺膠電泳後，再進行西方墨點法分析。將 0.3 g IE1 蛋白轉印至 PVDF 膜後利用抗體-抗原的辨認方式，

可以在分子量大小約 26kD 處看到經由 Western Blot Chemiluminescence Reagent (NEN Life Science) 進行呈色並以底片（Fuji superRX）進行曝光後的 IE1 訊號 (Fig.

4)。

5 遠端西方墨點法

取 3g 的白蝦血球溶解液進行 12.5% SDS 聚丙烯醯胺膠電泳後，再轉印至

PVDF 膜並加入 50 g IE1 作為釣餌蛋白以 IE1 抗體進行抗體-抗原的辨認，於分子量大小約 100 kD、80 kD、76 kD 辨認出與 IE1 交互作用的蛋白，再經由液相層析串聯式質譜儀 (LC MS/MS) 鑑定蛋白後分別為白蝦血球內 100 kD 的轉谷氨酰

胺酶、80 kD 的原酚氧化酶、76 kD 血藍素等 (Fig. 5)。

6 病毒顆粒對酚氧化酶的活性影響

抽取 9 隻白蝦樣本 (每組 3 隻）的白蝦血球細胞以 1/3 × PBS 溶解後進行 Bradford assay 的蛋白濃度定量，加入 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液到 96 孔盤的待測試孔中進行酚氧化酶活性分析，發現僅有 CAC 緩衝液與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為控制組之酚氧化酶吸光值約為 0.5；0.4 g 的白點症病毒顆粒與 12

g/l 的白蝦血球細胞溶解液為實驗組之酚氧化酶吸光值約為 0.5 並與控制組無顯 著差異 (P > 0.05)；1.2 g 的白點症病毒顆粒與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為 實驗組之酚氧化酶吸光值約為 0.5 並與控制組無顯著差異 (P > 0.05)；2.8 g 的白 點症病毒顆粒與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為實驗組之酚氧化酶吸光值約為 0.7，是控制組的 1.5 倍且與控制組有顯著差異 (P < 0.05)；30 l LPS (3 mg/ml) 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為陽性對照組之酚氧化酶吸光值約為 1.6，是控制 組的三倍且與控制組有顯著差異 (P < 0.005)；30 l 1 mM PTU 與 12 g/l 的白蝦 血球細胞溶解液為陰性對照組之酚氧化酶吸光值約為 0.1，是控制組的三分之一倍 且與控制組有顯著差異 (P < 0.05) (Fig. 6)。

7. in vivo 酚氧化酶活性於注射病毒顆粒後時序變化

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分別抽取注射白點症病毒顆粒及 60 l 1 × PBS 緩衝液的白蝦血球細胞，於注射後 24 小時內各時間點 (0, 2, 4, 8, 12, 24 hpi.) 抽取 9 隻白蝦樣本(每組 3 隻)的白蝦血球細胞後，再以 1/3 × PBS 溶解進行 Bradford assay 的蛋白濃度定量，加入 12

其酚氧化酶吸光值於注射後 0 小時約為 0.2 與控制組無顯著差異 (P > 0.05)，於注 射後第 4 小時後其酚氧化酶吸光值上升約為 0.35 是控制組的 1.5 倍有顯著差異 (P

< 0.05)，注射後第 12 小時後其酚氧化酶吸光值下降至 0.2 為控制組的 0.8 倍無顯著 差異 (P > 0 .05)，注射後第 24 小時其酚氧化酶吸光值回復至 0.2 與控制組無顯著 差異 (P > 0.05)；注射稀釋 100000 倍白點症病毒液 60 l 白蝦血球細胞溶解液為實 驗組其酚氧化酶吸光值於注射後 0 小時約為 0.2 與控制組無顯著差異 (P > 0.05)，

於注射後第 4 小時後其酚氧化酶吸光值上升約為 0.75 是控制組的 3.5 倍有顯著差 異 (P < 0.005)，注射後第 12 小時後其酚氧化酶吸光值下降至 0.2 為控制組的 1/2 倍無顯著差異 (P > 0.05)，注射後第 24 小時其酚氧化酶吸光值回復至 0.2 與控制組 無顯著差異 (P > 0.05) (Fig. 8A)，同時以 proPO 抗體定量各時間點的 proPO 含量變 化，發現控制組各時間的 proPO 變化量不大，而感染後的 proPO 變化量也不大 (Fig.

8B)。

9. WSSV364 與 WSSV IE1 重組蛋白的純化

由大腸桿菌表現後的重組蛋白 GST-364 及 GST-IE1，通過 GST column 純化後的產物與 Thrombin 在 4℃下作用至少 13 小時後，再次通過 GST column 後得到分子量大小約 51 kD 的 WSSV 364 (Fig. 9, Lane 1) 與分子量大小約 26 kD 的 WSSV IE1。WSSV 364 則作為酚氧化酶活性分析的負控制組；WSSV IE1 則做為酚氧化酶活性分析的實驗組。

10. IE1 對酚氧化酶活性之影響

共抽取 9 隻白蝦樣本（每組 3 隻）的白蝦血球細胞，再以 1/3 × PBS 溶解進行

(P < 0.05)； 3 g IE1 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液反應 5mins 為實驗組織酚 氧化酶吸光值為 0.05 是控制組的 1/2 倍有顯著差異 (P < 0.05)；30 l LPS (3 mg/ml) 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液反應 10mins 之陽性控制組的酚氧化酶吸光值為 0.7，控制組的 7 倍且有顯著差異 (P < 0.0005)；30 l LPS (3 mg/ml) 與 12 g/l 的 白蝦血球細胞溶解液反應 5mins 為陽性控制組之酚氧化酶吸光值為 0.7，控制組的 7 倍且有顯著差異 (P < 0.0005)；12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液先與 30 l LPS (3 mg/ml) 反應 10mins 後再與 3 g IE1 反應 5mins 後的酚氧化酶吸光值為 0.37 是控 制組的 4 倍 (P < 0.005)，僅以 30 l LPS (3 mg/ml) 處理之陽性控制組的 1/2 倍且 有顯著差異 (P < 0.005)；12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液先與 3 g IE1 反應 10mins 後再與 30 l LPS (3 mg/ml) 反應 5mins 後的酚氧化酶吸光值為 0.1 與控制組無顯著 差異(P > 0.05)，為僅以 30 l LPS (3 mg/ml) 處理之陽性控制組的 1/7 倍有顯著差 異 (P < 0.005)；30 l 1 mM PTU 與 12 g/l 的白蝦血球細胞溶解液為陰性對照組 之酚氧化酶吸光值約為 0.05，是控制組的 1/2 倍且與控制組有顯著差異 (P < 0.05) (Fig. 11)。

23 et al., 1993; Kaliappan and Sugumaran, 1996)，因此本實驗選用 Heparin (500 Units/ml)

做為本次實驗的抗凝劑。本次實驗的 CAC 緩衝液不會對酚氧化酶的活性造成影響，

的透明球 (Gary and Graves, 1985; Soderhall and Smith, 1983)，本次實驗直接利用抗凝劑抽取蝦血球細胞進行酚氧化酶活性分析，粗抽後的血球細胞及血淋巴液含有 許多原酚氧化酶系統的相關蛋白因子 (Soderhall et al., 1990)，而無脊椎動物的原酚 氧化酶可能存在血淋巴液中或血球細胞中 (Sung et al., 1998; Kaliappan and

Sugumaran, 1996; Soderhall and Cerenius, 1992, 1998; Johansson and Soderhall, 1989;

Pikul et al., 2006; Teresa et al., 1999; Washington and Danker, 1997; Yeh et al., 2009a)。

前人研究對於粗抽之血淋巴液進行酚氧化酶活性分析而未能有活性反應；對粗抽 血球細胞進行酚氧化酶活性分析則可測到酚氧化酶酵素的活性反應 (Sung et al., 1998; Soderhall and Hall, 1984; Teresa et al., 1999)，因血淋巴液中含有許多的蛋白酶 抑制劑，如：macroglobulin、serpin 等 (Soderhall et al., 2009b; Kallaya and Soderhall, 2000) 會抑制血淋巴液中酚氧化酶活性，使其活性測試需要反應約 24 小 2007; Yeh et al., 2009a; Yeh et al., 2009b)。感染白點症病毒後的蝦其酚氧化酶下降的 原因可能與白點症病毒極早期蛋白有關，所以利用遠端西方墨點法，探索能與 IE1 後酚氧化酶活性和基因表現量迅速下降的情形不同 (Siriporn et al., 2008; Suseela et al., 2007; Yeh et al., 2009b) 因此利用純化後的病毒顆粒進行酚氧化酶活性分析，發 現能隨著病毒顆粒劑量增加而刺激酚氧化酶活性上升 (Fig. 6)。本篇論文利用純化

25 球蛋白進行蛋白等量定量 (Sung et al., 1998; Soderhall et al., 2009)，雖然每次進行 實驗的總蛋白量有經過定量且為同等蛋白量，但是每隻蝦子所含有的酚氧化酶在總蛋白的比例不同，且蝦子的酚氧化酶在蝦子脫殼前階段的酚氧化酶活性會上升 而脫殼後的酚氧化酶會下降 (Liu et al., 2006)，因此蝦子的個體差異可能會造成實 驗上的誤差，因此本實驗的測定時間點都有增加樣本數且三重複以減少個體誤差 (Fig. 7)。由於利用總粗抽蛋白的測定活性方式僅能測定到相對的活性變化，而本

次實驗皆以定量後的總粗抽蛋白進行實驗 (Fig. 6, 7, 8, 10, 11)，所以不能排除酚氧化酶活性的上升和下降是受到其他非病毒的相關因子干擾，例如：ROS 的反應或 者白蝦的血液凝集系統等都有可能影響蝦子的酚氧化酶活性 (Ji et al., 2011; Nagai et al., 2000; Cammarata and Parrinello, 2009)；此外，前人也利用 blue sepharose 及

phenyl sepharose column 移除甲殼類血液的血藍素並將鱟的原酚氧化酶純化出來並進行酵素的活性測定，因此在活性測定方面可以較精準的測到比活性 (Aspan and Soderhall, 1991; Teresa et al., 1999)。前人研究發現，純化後的原酚氧化酶的分 子量大小為 76 kD 左右且經由蛋白酶的截切後產生分子量大小 60 kD 和 62 kD 的

測定活性的同時也加入了 WSSV364 做為負控制組顯示不是所有病毒蛋白都能調控酚氧化酶的活性下降，並同時加入了活化劑和抑制劑做為對照，確定酚氧化酶活性分析平台是可以正常進行實驗 (Fig.10)，發現酚氧化酶能隨著 IE1 之劑量增加而下降 (Fig.10)，隨後做了活化前後的酚氧化酶活性分析並同時加入 IE1 試圖探索 IE1 在酚氧化還原酵素活化系統中可能作用之途徑，發現在先加入 IE1 蛋白後再活化酚氧化酶的實驗組活性數值僅為以活化劑處理之酚氧化酶活性 1/2-1/4 倍 (Fig.11)，且與控制組無顯著差異 (p < 0.05)，顯示 IE1 病毒蛋白確實能與原酚氧化酶活化系統的上游蛋白作用阻擋原酚氧化酶活化路徑。

儘管如此，在探索 IE1 如何降低白蝦酚氧化酶活性的途徑上仍是需要持續努

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