第四章、 結果與討論
第三節、 酵素抑制動力學試驗
取冷凍香蕉皮40°C減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP40M)約能抑制酪胺酸酶50%活
性 之 濃 度 ， 於 不 同 濃 度 之L-Dopa 下 測 定 酪 胺 酸酶 活 性 ， 並 利 用 繪 製
Lineweaver-Burk雙倒數作圖分別得到酪胺酸酶的雙倒數動力學作圖和抑制劑—冷
凍香蕉皮40°C減壓濃縮甲醇萃取物之雙倒數抑制動力學作圖。求得酪胺酸酶之 Km
和Vmax值分別為 0.23 mM與0.67 OD/min，在加入抑制劑後 Km 和 Vmax 值分別為 0.10 mM 和0.29 OD/min，Km、Vmax 均較未加入抑制劑前變小，可推得冷凍香蕉 皮40°C減壓濃縮甲醇萃取物對酪胺酸酶之抑制為不競爭型 (uncompetitive) 之抑 制（圖十三）。
另取冷凍香蕉皮70°C減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP70M) 約能抑制酪胺酸酶50%
活性之濃度，於含有不同濃度之 L-Dopa 下測定酪胺酸酶活性，並利用繪製
Lineweaver-Burk 雙倒數作圖分別得到酪胺酸酶的酵素雙倒數動力學作圖和抑制
劑—冷凍香蕉皮 70°C 減壓濃縮甲醇萃取物之雙倒數抑制動力學作圖。求得酪胺
酸酶之Km和Vmax值分別為 0.40 mM 與0.77 OD/min，在加入抑制劑後 Km 和 Vmax值分別為0.33 mM 和0.61 OD/min， Km 與 Vmax 在加入抑制劑後均變小，得
知冷凍香蕉皮70°C減壓濃縮甲醇萃取物對酪胺酸酶之抑制為不競爭型之抑制（圖
十四）。
FBP40M 和 FBP70M 對酪胺酸酶催化以 L-Dopa 為基質的反應均為不競爭
型抑制，結果也顯示香蕉皮甲醇萃取物，經過高溫減壓濃縮，對酵素之抑制機制 不會產生影響。
圖十三、冷凍香蕉皮40°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP40M) 對酪胺酸酶之抑制動力學試驗
Fig. 13. Lineweaver- Burk plots for inhibition of FBP40M on tyrosinase.
Triple reciprocal plot for determining the Vmax and Km values of FBP40M FBP40M: Frozen banana peel methanol extract concentrated at 40°C
圖十四、冷凍香蕉皮70°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP70M) 對酪胺酸酶之抑制動力學試驗
Fig. 14. Lineweaver- Burk plots for inhibition of FBP70M on tyrosinase.
Triple reciprocal plot for determining the Vmax and Km values of FBP40M FBP70M: Frozen banana peel methanol extract concentrated at 70°C
第四節、 香蕉皮甲醇萃取物之液液萃取區分 產物分離。液液萃取區分 (liquid-liquid partition)之方法主要是利用兩不互溶之溶劑 (immiscible solvent)，由於物質的分佈與不同的分配系數 (partition coefficient) 有關，
也就是受溶質在兩不互溶之溶劑間於界面處達到平衡時的濃度比例所影響，因此
低極性之物質，如酚類、類黃酮、三萜類及可能帶有醣基之類固醇。最後將剩下 之水層與正丁醇進行液液萃取區分，得到之區分層含中高極性物質，如帶醣基酚 類、帶醣基類黃酮、帶醣基三萜類、帶醣基之固醇。而剩下的水層，經減壓濃縮 冷凍乾燥後，呈現粘性之膠狀，其中含高極性物質，如醣苷類、多醣類。然而應 用液液萃取區分的方式並非總是準確的方法，時常能發現物質在不同區分層重複 出現 (Takeda and Fatope, 1988)。
香蕉皮甲醇萃取物不論是 BP40M、BP70M、FBP40M 或 FBP70M 得到各區分 層之萃取率由高至低分別為：水層 > 正己烷層 > 正丁醇層 > 乙酸乙酯層（表九），
可能與香蕉皮甲醇萃取物中不同極性物質之含量不同相關。
得到 BP40M、BP70M、FBP40M 及 FBP70M 各分層萃取物後，接著進行酪胺 酸酶抑制試驗，測試各分層萃取物之多巴色素生成量。
表九、香蕉皮及冷凍處理組甲醇萃取物有機溶劑之區分層萃取率
Table. 9. Extraction yield of banana peel and frozen banana peel by solvent partition.
BP40M BP70M FBP40M FBP70M
Fraction
Hexane 8.2±1.63 7.66±1.08 8.44±2.17 7.91±3.67 Ethyl acetate 2.64±0.23 1.66±0.41 1.86±0.20 0.55±0.01 Butanol 6.07±0.79 5.67±0.22 5.91±0.47 5.47±0.45 Water 86.59±0.35 86.2±1.02 84.71±6.81 85.26±2.06 Yield of extraction was expressed as g extract /g (dried wt.) banana peel and frozen banana peel * 100%.
Mean± SD (n = 3)
BPW: Banana peel water extract
FBPW: Frozen banana peel water extract
BP40M: Banana peel methanol extract concentrated at 40°C
FBP40M: Frozen banana peel methanol extract concentrated at 40°C BP70M: Banana peel methanol extract concentrated at 70°C
FBP70M: Frozen banana peel methanol extract concentrated at 70°C
第五節、 香蕉皮甲醇萃取物有機溶劑分層萃取物之體外酪胺酸酶活性試 將香蕉皮 40°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (BP40M)，經正己烷、乙酸乙酯、正丁醇
及水層分層後，以各層萃取物進行酪胺酸酶酵素抑制試驗。正己烷跟乙酸乙酯層
萃取物均較空白組減少多巴色素生成，且隨萃取物濃度增加而減少多巴色素之生 成，推測兩者均能抑制酪胺酸酶之活性。正己烷層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時，
較空白組減少56.23%多巴色素之生成；乙酸乙酯層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時則
減少了 68.75%，兩者無顯著性差異。而正丁醇層跟水層萃取物皆較空白組增進多
巴色素之生成，且隨萃取物濃度增加而增進多巴色素之生成。正丁醇層較水層更
加增進多巴色素之生成，正丁醇層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時，較空白組增加
79.15%之多巴色素生成；水層萃取物在相同濃度下，則增加 43.47%之多巴色素生 成（圖十四）。
香蕉皮 70°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (BP70M)經有機溶劑分層，各層萃取物進 行酪胺酸酶活性抑制試驗。正己烷及乙酸乙酯層萃取物均較空白組減少多巴色素
之生成，且隨萃取物濃度增加而減少多巴色素之生成，顯示兩者均抑制酪胺酸酶
之活性，正己烷層萃取物較乙酸乙酯層萃取物更能減少多巴色素之生成，正己烷 層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時，較空白組減少 50.32%多巴色素之生成；乙酸乙酯 層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時則減少 42.85%。正丁醇層萃取物則較空白組增進多 巴色素之生成，在濃度為8 mg/mL 時，能增進 47.94%多巴色素之生成。水層與空 白組相比則不增進或減少多巴色素之生成（圖十五）。BP70M 與 BP40M 相比，顯
示在萃取物製備過程中提高減壓濃縮溫度至 70°C，使水層萃取物由較空白組增進
多巴色素生成而變成不增進也不減少多巴色素之生成，可能是由於高溫減壓濃縮
造成植物化學成分降解揮發或促進活性物質發生反應。水層中可能含高極性之物 質如醣類、多醣體等，文獻指出香蕉皮中含有葡萄糖、果糖、蔗糖及麥芽糖等 (Chandraju et al., 2011)，醣類經過高溫加熱會發生非酵素型褐變，產生焦糖化之產 物 (caramelisation product)，焦糖化產物具有抗氧化活性 (Benjakul et al., 2005；
Manzocco et al., 2001)，因此影響酪胺酸酶催化生成多巴色素之反應。
冷凍香蕉皮 40°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP40M)經有機溶劑分層，各分層萃
取物進行酪胺酸酶活性抑制試驗。正己烷、乙酸乙酯與正丁醇層之萃取物皆較空
白組減少多巴色素之生成，且隨萃取物濃度增加而減少多巴色素之生成，推測此
三分層萃取物能抑制酪胺酸酶之活性，正己烷層萃取物在濃度為 8 mg/mL 時較空
白組減少60.64%多巴色素之生成，乙酸乙酯層萃取物在同濃度下則減少 42.23%多
巴色素之生成，正丁醇層萃取物在同濃度下亦減少 53.74%多巴色素之生成。而水
層則不增進也不減少多巴色素之生成（圖十六）。FBP40M 與 BP40M 相比可發現 經冷凍處理造成正丁醇層萃取物由較空白組增進成轉變為減少多巴色素之生成，
並造成水層萃取物由增進轉變為不增進也不減少多巴色素之生成。由於正丁醇層 中可能含有帶醣基之固醇、三萜、類黃酮、酚類，推測造成此現象之原因，可能
由於酪胺酸酶（多酚氧化酶）為一具廣泛專一性的酵素，香蕉皮內原有之酚類亦
為其基質，因此在酪胺酸酶酵素試驗時，被氧化成醌類形成黑色素而造成吸光值
的增加。而冷凍過程造成細胞間隙的冰晶生成，在處理樣品過程中，發生解凍，
造成細胞內隔室遭到破壞，各種水解酵素及氧化酵素釋出，如多酚氧化酶與酚類
反應使之聚合成多酚類，不再受酪胺酸酶氧化，因此不會較未加入樣品組增加 475
nm 下之吸光值。此外經過多酚氧化酶催化反應之產物—黑色素 (Palmer, 1963；袁 等氏，2013；朱與陳，2011)，也具有抗氧化之功能 (Jacobson and Tinnell, 1993；
Jacobson et al., 1995；Wang et al., 2007)，因此可能具有抑制酪胺酸酶之活性。
冷凍香蕉皮 70°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP70M) 經有機溶劑分層，各層萃
取物進行酪胺酸酶活性抑制試驗。不論是正己烷、乙酸乙酯、正丁醇及水層各層
萃取物均較空白組減少多巴色素之生成，得知冷凍香蕉皮 70°C 減壓濃縮甲醇萃
取物之不同分層萃取物皆抑制酪胺酸酶活性，正己烷、乙酸乙酯、正丁醇及水層
各層萃取物在濃度於8 mg/mL 時分別較空白組降低 31.56%、58.06%、57.64% 及 41.06%之多巴生成（圖十七）。FBP70M 與 FBP40M 相比，顯示經過高溫減壓
濃縮，正己烷層之減少多巴生合成、抑制酪胺酸酶之能力有下降的現象，可能是
活性物質受到高溫的破壞，水層由不減少也不促進轉變減少多巴色素之生成，而 造成這個改變有可能是因為前述香蕉皮甲醇萃取物之水分層萃取物中富含醣類，
經由高溫減壓濃縮之後產生焦糖化產物，為一抗氧化物質，且能競爭型抑制以 L-Dopa 作為基質的多酚氧化酶（酪胺酸酶）催化反應 (Lee and Lee, 1996)。
不同處理之香蕉皮甲醇萃取物，經由冷凍處理會造成正丁醇分層萃取物由增 進轉變為減少多巴色素之生成，並使水層萃取物由增進轉變為不增進也不減少多
巴色素之生成。而在萃取物製備過程中，若使用 70°C 減壓濃縮，會造成正己烷
分層萃取物的抑制酪胺酸酶活性降低，也會造成水層對多巴色素生成之影響。選
定冷凍處理造成多巴色素產量變化最大之正丁醇分層萃取物做進一步的成分分 析。
圖十五、香蕉皮 40°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (BP40M) 有機溶劑分層萃取物 對酪胺酸酶活性之影響
Fig. 15. Tyrosinase inhibitory activity of different solvent fraction of BP40M.
The mean ± SE of three observations has been plotted.
Symbols followed by the same letter are not significantly different.
BP40M: Banana peel methanol extract concentrated at 40°C
圖十六、香蕉皮 70°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (BP70M) 有機溶劑分層萃取物 對酪胺酸酶活性之影響
Fig. 16. Tyrosinase inhibitory activity of different solvent fraction of BP70M.
The mean ± SE of three observations has been plotted.
Symbols followed by the same letter are not significantly different.
BP70M: Banana peel methanol extract concentrated at 70°C
圖十七、冷凍香蕉皮 40°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP40M) 有機溶劑分層萃取物 對酪胺酸酶活性之影響
Fig. 17. Tyrosinase inhibitory activity of different solvent fraction of FBP40M.
The mean ± SE of three observations has been plotted.
FBP40M: Frozen banana peel methanol extract concentrated at 40°C
圖十八、冷凍香蕉皮70°C 減壓濃縮甲醇萃取物 (FBP70M) 有機溶劑分層萃取物 對酪胺酸酶活性之影響
Fig. 18. Tyrosinase inhibitory activity of different solvent fraction of FBP70M.
Fig. 18. Tyrosinase inhibitory activity of different solvent fraction of FBP70M.