第二章 重組蛋白之蛋白質表現系統介紹
2.1 重組 DNA 技術
在整個蛋白質表現的實驗中，最先要做的事情就是將我們欲表現的目標蛋白 質基因與載體結合，而這個結合的過程就稱為重組 DNA。重組 DNA 技術 (recombination DNA technology)就是一般常聽到的基因工程。如圖 1，首先以相 同的內切酶(endonucleases)在質體(plasmid)與外源基因上切出相同的切位點，被 切開的質體與切成片段的外源基因再以連接酶(ligase)結合在一起，及形成重組的 DNA。
圖 1 重組 DNA 技術之過程
資料來源: 詴驗方案(http://www.51protocol.com/)
說明: 利用相同的內切酶(此圖範例為 EcoRI)在質體與外源基因上切出相同的切 口(此圖範例為 TTAA 與 AATT)，再利用連接酶連接切開的質體和外源基因片段，
重新組合成新的基因序列。
2.2 大腸桿菌蛋白質表現系統
將重組好的 DNA plasmid 轉殖入大腸桿菌後，先經過抗生素(antibiotic)的篩 選，可去除沒有轉殖成功的大腸桿菌，再將剩下帶有重組 DNA 的大腸桿菌大量 複製，如圖 2。
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圖 2 帶有特定質體的大腸桿菌大量複製 資料來源: 科學月刊三十卷十二期, 1999-基因工程的衝擊。
說明: 利用抗生素可篩選出含有帶重組 DNA 的大腸桿菌，再將帶有重組 DNA 的大腸桿菌大量複製。
經過篩選內部含有重組 DNA 的大腸桿菌接下來會被進行培養，通常是以正 常溫度 37℃在 LB broth (Luria-Bertani broth)中培養數個小時。經由加入誘導物可 啟動大腸桿菌內重組 DNA 所攜帶之外源基因的表現，而在培養的數個小時中，
藉由大腸桿菌的資源與運作，外源基因會轉錄成 RNA (ribonucleic acid)，再轉譯 成蛋白質，此表現出的蛋白質就是實驗人員想要的目標蛋白質。而目標蛋白質存 在於大腸桿菌內部，所以培養結束後再使用超音波震盪(sonication)、溶解(lisys) 或冷凍-解凍等方法打破菌體以萃取蛋白質。
2.3 凝膠體電泳法(SDS-PAGE)
凝膠體電泳法(SDS-PAGE)為利用界面活性劑 SDS (sodium dodecyl sulfate) 使蛋白質變性(denature)，並附在變性的蛋白質的表面，藉由通過電流讓蛋白質 上本身攜帶負電荷的 SDS 往正極移動，而膠體的密度，即內部孔洞大小對不同 分子量蛋白質有篩選效果，分子量越小的蛋白質在移動時的速率越快，相反的，
大分子量的蛋白質移動速率越慢，所已經過一段時間後，小分子量的蛋白質會跑 在膠體的前端，而大分子量的蛋白質會留在後端，再經過分子量的比對，則可得 知實驗中的目標研究蛋白質為哪一個。
將打破後的大腸桿菌經過低溫高速離心會分成上清液與沉澱物兩層，上清液 所包含的為大腸桿菌內部正常的蛋白質；而沉澱物則是由細胞碎片與蛋白質聚集 在一起大團分子。如果此次表現出的蛋白質為可溶性，則此蛋白質會存在於上清 液的部分，反之，如果蛋白質為不溶性的包涵體，則會存在於底部之沉澱物，拿 取上清液與沉澱物分別去跑 SDS-PAGE 後，藉由分子量的比對可看出表現出的 目標蛋白是存在於上清液還是沉澱物中，由此可判斷此次表現的蛋白質為可溶性 蛋白或是包涵體。
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2.4 包涵體(inclusion body)
從大腸桿菌表現出的外源蛋白質，有些是折疊(folding)正確且有正常功能或 酵素活性，萃取後可以直接拿來做後續的實驗，但有些表現出的蛋白質並非如此，
許多蛋白質在表現的過程中會聚集(aggregate)成包涵體，這些包涵體沒有正確的 折疊結構，也沒有正常的功能與酵素活性，且不溶於水，所以這些形成包涵體的 蛋白質並沒有任何功用，不能拿來應用在後續的實驗當中，而這個問題長久以來 一直困擾的生物學家。
許多生物學家會用降低表現時的溫度或是降低誘導物的濃度等方式[10]，讓 大腸桿菌新陳代謝速率減低，表現目標蛋白質的速率也減緩，避免在折疊的過程 中速率太快導致過多的疏水性胺基酸任意鍵結，形成不對的結構；或是在欲表現 的蛋白質之前端或後端添加一段融合蛋白(fusion protein)[11, 12]，以提高整體的 親水性；另外也還有其他方式例如:調整培養液的成分、選擇其他大腸桿菌品種 或其他表現系統等。但這些改變實驗條件以得到可溶性蛋白質的方法目前都還是 需耗費很多時間與資源的反覆測詴(Trial-and-error)，沒有特定的依據，只能逐一 去測詴每個實驗條件改變後的結果，且不管是從新製作重組 DNA 或是重新培養 大腸桿菌，都需要又再花費數小時至數天的功夫。而能夠有系統性指標出現的話，
將會讓科學家對於此機制有更多了解。
但是如果改變了許多實驗條件都無法得到可溶性蛋白質，那生物學家只好將 包涵體進行變性(denature)，先打斷蛋白質中所有的鍵結，讓蛋白質打開形成一 及結構，再藉由低溫緩慢的重新折疊(refolding)，讓蛋白質能折疊回原本正確有 生物活性的結構。但是變性與重新折疊的過程都需要花費非常久的時間，也會消 耗多餘的資源，且不是所有包涵體經過變性與再折疊都可以變回有生物活性的蛋 白質，大約只有三成的產量才具有生物活性，甚至更低[13]，而就算經過變性-重新折疊但沒有生物活性的蛋白質，也是沒有任何功用，無法在後續的實驗中被 使用。所以生物學家在做蛋白質表現實驗時，都會盡量以能直接取得可溶性蛋白 質為主，而花費許多時間與資源在反覆測詴表現時的實驗條件，如果能發展出一 套預測蛋白質在大腸桿菌表現系統中的溶解度工具，可以大幅減低實驗人員時間 與資源的耗費。
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