釘地蜈蚣成分研究概況

一、釘地蜈蚣已知化學成分如下：

1. ß-sitosterol⁽⁴⁾ 2. stigmasterol⁽⁴⁾

3. hexadecanoic acid⁽⁴⁾ 4. octadecanoic acid⁽⁴⁾ 5. eicosanoic acid⁽⁴⁾ 6. docosanoic acid⁽⁴⁾

7. campesteryl-D-glucoside⁽⁶⁾

8. 3-O-ß-D-glucopyranosyl-ß-sitosterol⁽⁶⁾ 9. 3-O-ß-D-glucopyranosylstigmasterol⁽⁶⁾

10. N-benzoyl-L-phenylalanyl-L-phenylalaninol acetate⁽⁶⁾ 11. ugonin A⁽⁶⁾

12. ugonin B⁽⁶⁾ 13. ugonin C⁽⁶⁾ 14. ugonin D⁽⁶⁾ 15. ugonin E⁽⁶⁾ 16. ugonin F⁽⁶⁾ 17. ugonin G⁽⁶⁾ 18. spiraeoside⁽⁶⁾ 19. dulcitol⁽⁵⁾

二、上述化合物依化學結構分類如下：

1. Fatty acids：

octadecanoic acid

OH O

O

eicosanoic acid

O

eicosanoic acid

2. Steroids：

RO

R = H : stigmasterol

R = D-glucosyl : stigmasterol-D-glucopyranoside hexadecanoic acid

OH O

RO

R = H : ß-sitosterol

R = D-glucosyl : ? -sitosterol-D-glucopyranoside_ß

RO

R = D-glucosyl : campesteryl-D-glucoside

3. Flavonoids：

O O

OR

OR

O OH

R = H ugonin A R = CH₃ ugonin B

O

O OH O

OH ugonin C

O

OH ugonin G

O

OH

OH O

OH

HO O-ß-D-Glc spiraeoside

4. Others：

C NH

O

C O

NH CH₂O C

O CH₃

aurantiamide acetate

H₂C CH CH O

OH CH OH

CH CH₂ O

dulcitol

第四節 藥理實驗法簡介

一、抗發炎、抗過敏作用：

肥大細胞(mast cell)及中性白血球(neutrophil)內的顆粒，含有多種 過敏性及發炎媒介物，當此兩種細胞受到刺激後，如肥大細胞中所含

的 顆 粒 會 釋 histamine 、 serotonin 、 PGs 、 neutral protease 、 ß-hexosamindase、PAF...等媒介物，而中性白血球會釋放 PGs、PAF、

leukotrienes、lysozyme、neutral protease、ß-glucuronidase....等媒介物。

其中有些是發炎介質，導致血管擴張、通透性增加、支氣管平滑肌收 縮及組織損傷，所以與急性發炎有密切關係(圖 2)。因此化合物若能 抑制肥大細胞及中性白血球之活化，就能對過敏及發炎症狀之預防與 治療有莫大幫助。

圖 2、肥大細胞釋出之媒介物質及所產生之生理反應

本研究之藥理實驗係由台中榮總醫學研究部王繼平教授實驗室 代 為 測 試 。 實 驗 模 式 係 以 compound 48/80 引 發 肥 大 細 胞 釋 放 histamine、ß-glucuronidase 及 FMLP 引發中性白血球釋放 lysozyme ß-glucuronidase，分別藉以測試各化合物以尋找抗過敏或抗發炎活性 成分。各實驗內容簡介如下：

(一) 利用 compound 48/80 誘導肥大細胞去顆粒作用之抑制實驗，測 定化合物之抗過敏活性：

試劑 compound 48/80 為 N-methyl-p-methoxyphenethylamine 與甲 醛(formaldehyde)反應之產物且為一個聚合物之結構。

Compound 48/80 的藥理作用是促使肥大細胞釋放組織胺，故可作 為化合物測定抗過敏的活性試驗時之誘導劑。實驗中以 mepacrine 為 positive control，觀察組織胺及 ß-glucuronidase 釋出量並求出抑制百 分比。

(二) FMLP 誘導的嗜中性白血球去顆粒作用(neutrophil degranulation) 之抑制實驗，測定化合物之抗發炎活性：

FMLP 為一種 chemotatic peptide (N-formyl-Met-Leu-Phe)之簡稱。

N-formyl peptide 類的化合物其藥理作用有促使嗜中性白血球去 顆粒作用，故 FMLP 可作為化合物測定抗發炎的藥理活性試驗時之誘 導劑。本實驗中以 trifluoperazine (TFP)為 positive control^，觀 察 lysozyme 及 ß-glucuronidase 釋出量並求出抑制百分比。

二、抗增殖作用：

細胞的增殖作用主要受到細胞週期的(cell cycle)調控，人體內的 正常細胞多半停留在 G0-G₁期(G0-G₁arrest)進一步成熟分化，而癌細胞 不同於正常細胞之處就是因為細胞週期的失控而導致細胞不斷的增 殖與複製不成熟的幼稚細胞，如此惡性循環變造成癌症一發不可收 拾，所以若能以藥物將不正常之增殖給停止當然也促成了分化成熟的 進行了。

本研究之藥理實驗模式係利用 3-(4,5-dimethylthiazol-2-diphenyl)- tetrazolium bromide (MTT)測試粗抽物及化合物之不同濃度對 HL-60 cell line 增殖的影響。MTT 染劑可穿透活細胞的細胞膜經由粒線體上 酵素的還原而成藍紫色反應，再利用 DMSO 將細胞膜溶解後釋出藍 色染料於 570 nm 下測量吸光值，即可得到粗抽物及化合物對細胞增 殖比例的百分比^(7~10)，本實驗是以 retinoic acid (RA)為 postive control。

第二章 釘地蜈蚣成分之抽取與分離

將乾燥之釘地蜈蚣根莖部分(10 Kg)經粉碎機粉碎後，以甲醇用 冷浸法反覆抽取 15 次，依照 Scheme 1~3 流程圖所述之方法分離。共 得到 4個化合物及 1個混合物，經光譜解析及化學方法確認其結構為：

1. ß-sitosterol & stigmasterol 之混合物 2. hexadecanoic acid

3. tetracosanoic acid 4. ugonin H

5. ugonin I

Mixture I

HO 3

19

18 20

21 22

23 24

ß-sitosterol

HO 3

5 19

18 21

20 22

2324 26 25 27

stigmasterol

Compound II

CH

3

(CH

2

)

14

COOH

hexadecanoic acid

Compound III

CH

3

(CH

2

)

22

COOH

tetracosanoic acid

Compound IV

O

Compound V

O

第三章 釘地蜈蚣成分之化學結構鑑定

【一】混合物 I ( ß-sitosterol & stigmasterol )

化合物 I 為白色針狀結晶，熔點 154-156 ℃。其 TLC 片經溶媒 (choloform)展開後 Rf值為 0.35，噴 10% H2SO4加熱後變色呈紫紅色。

對 Liebermann-Burchard 試劑呈陽性反應(由紫色變成藍色再變成綠 色)，紫外光在 200~380 nm 內不吸光，故初步推斷化合物為植物固醇。

紅外線光譜(圖 3)顯示，在 3400~3300 ㎝^-1有 -OH 基的吸收帶，

1458、1242 ㎝^-1是 -CH2、-CH3變角振動的吸收帶，1659 ㎝^-1是雙鍵 (C=C)的吸收帶，1049 ㎝^-1有 -C-O-基伸縮振動的吸收帶。

由 EIMS m/z (rel. int. %)圖譜(圖 4)顯示其 m/z 412 (46) [M⁺]為主要 之分子離子峰，414 (15)為次要化合物之分子離子峰，所以分子量為 414 及 412。故推測化合物主要為 stigmasterol 且尚含有 ß-sitosterol 之 混合物。

¹H-NMR 光譜(圖 5；CDCl3)顯示δ5.35 (1H, d, J＝5.1 Hz, H-6)是 烯基氫的吸收訊號。δ5.14 (1H, dd, J＝15.2 , 8.1 Hz)，δ5.10 (1H, dd, J＝15.2, 8.0 Hz)為 stigmasterol 之 H-22、H-23 的訊號。δ3.52 (1H, m, H-3)羥基根部質子訊號。

¹³C-NMR 光譜(圖 6；CDCl₃)顯示與 DEPT 圖譜(圖 7)顯示在δ 140.5、121.4 及 138.1、129.0 的訊號分別為雙鍵 C-5、C-6 及 C-22、

C-23 之吸收，經與文獻比對^(11~14)整理如表二所示，得知此化合物為 ß-sitosterol 及 stigmasterol 的混合物。

HO

表二、ß-sitosterol、stigmasterol 與混合物 I 之碳譜化學位移比較 Carbon stigmasterol ß-stitosterol Mixture I

1 37.3 37.2 37.0

【二】化合物 II ( hexadecanoic acid )

化合物 II 為白色片狀結晶，熔點 61~62 ℃，其 TLC 經溶媒 (n-hexane：chloroform＝10：1)展開後 R_f值為 0.4，紫外光在 200~380 nm 內不吸光。

紅外線光譜(圖 8)顯示 2916 ㎝^-1 及 2851 ㎝^-1 為飽和碳氫的吸 收，1701 ㎝^-1為 carbonyl group (C=O)的吸收。

1H-NMR 光譜(圖 9；CDCl₃)顯示δ0.88 (3H, t)為長鏈末端甲基之 吸收訊號，δ1.26 (24H, s.br)為長鏈 methylene (-CH2-)的吸收訊號，δ 2.35 (2H, t)為 H-2 的吸收訊號。

13C-NMR 光譜(圖 10；CDCl3)顯示δ13.8 為長鏈末端甲基碳的吸 收訊號，δ22.4~33.7為長鏈 methylene 的吸收訊號，δ179.6為 carboxyl carbon (C=O)的吸收訊號。

綜 合 上 述 資 料 與 文 獻 值⁽¹⁵⁾比 對 ， 確 認 此 化 合 物 之 結 構 為 hexadecanoic acid，分子式為 C₁₆H₃₂O₂，其結構如下所示：

CH

3

(CH

2

)

14

COOH

【三】化合物 III ( tetracosanoic acid )

化合物 III 為白色片狀結晶，熔點 80~82 ℃，其 TLC 經溶媒 (n-hexane：chloroform＝10：1)展開後 R_f值為 0.35，紫外光在 200~380 nm 內不吸光。

紅外線光譜(圖 11)顯示 3340 ㎝^-1為羥基的吸收訊號，2916 ㎝^-1 及 2847 ㎝^-1為飽和碳氫的吸收，1709 ㎝^-1為 carbonyl group (C=O)的 吸收。

1H-NMR 光譜(圖 12；CDCl₃)顯示δ0.88 (3H, t)為長鏈末端甲基之 吸收訊號，δ1.26 (40H, s.br)為長鏈 methylene (-CH2-)的吸收訊號，δ 2.35 (2H, t)為 H-2 的吸收訊號。

13C-NMR 光譜(圖 13；CDCl3)顯示δ13.8 為長鏈末端甲基碳的吸 收訊號，δ22.4~33.5 為長鏈 methylene (-CH₂-)的吸收訊號，δ178.2 為 carboxyl carbon (C=O)的吸收訊號。

綜 合 上 述 資 料 與 文 獻 值⁽¹⁶⁾比 對 ， 確 認 此 化 合 物 之 結 構 為 tetracosanoic acid，分子式為 C24H48O2，其結構如下所示：

CH

3

(CH

2

)

22

COOH

【四】化合物 IV

化合物 IV 為黃色粉末，熔點 285~287 ℃，微溶於甲醇不溶於水。

TLC 經溶媒(chloroform：methanol＝10：1)展開後 R_f值為 0.45，且在 噴 10%硫酸溶液加熱後顯色呈淡黃色，FeCl3試驗呈青綠色。

紅外光光譜(圖 14)在 3442 ㎝^-1為寬幅吸收表示有羥基，1651 ㎝^-1 有共軛羰基吸收，1605、1559、1443 ㎝^-1為苯環之吸收，1165 ㎝^-1為 -C-O-基吸收。

紫外光光譜(圖 15)在 346 nm、275 nm 有最大吸收，前者為 Band I 吸收波長，後者為 Band II 吸收波長，符合黃酮類(flavones)化合物的 吸收特性，故推定化合物 IV 為黃酮類化合物。進一步將化合物加入 shift reagent，其變化如下表所示：

UV 圖譜(nm)：

shift reagent MeOH NaOH AlCl3 AlCl3/HCl NaOAc NaOAc/H3BO3

Band I 346 401 412 362 397 369 Band II 275 269 283 291 272 263

(1) 加入氫氧化鈉[1% (w/v) NaOH]：Band I 由 346 nm 向長波長移動 55 nm，且強度不變，表示化合物之 B 環在第 4'位有羥基(4'-OH)。

(2) 加入三氯化鋁[10% (w/v) AlCl3]：Band I 向長波長移動 66 nm，

Band II 向長波長移動 8 nm；且再加入鹽酸(1N HCl)後，Band I 往 短波長移動 50 nm，Band II 吸收幾乎不變，表示 B 環上有鄰位二 羥基，A 環第 5 位上有羥基(5-OH)。

(3) 加入醋酸鈉[10% (w/v) NaOAc]：Band I 往長波長移動 51 nm，Band

II 的移動很小，表示第 4'位有羥基且第 7位不含羥基；再加入硼酸[10%

(w/v) H3BO3]後，Band I 往短波長移動 28 nm，亦證明含有鄰位二羥 基。

綜合以上紫外光譜資料得知此化合物為 3', 4', 5 位有羥基之黃酮類 化合物。

由 EI 質譜(圖 16)顯示其分子離子峰為 436 (7.6)，其它碎片離子峰

尚有 369、313、283、179、134、123、109 等吸收，且 m/z 313 應為 黃酮類化合物之本體部分。

綜觀 NMR 光譜資料，¹H-NMR 光譜 (圖 17；DMSO-d₆) 顯示在 δ3.86 (3H, s)有芳香環上甲氧基的訊號，也有δ13.13 (1H, s)為 5-OH 質子訊號。¹³C-NMR 光譜 (圖 18；DMSO-d₆)和 DEPT 實驗 (圖 19；

DMSO-d₆)顯示此化合物有 6 個次甲基 (CH)、5 個亞甲基 (CH₂)、3 個甲基 (CH3)及 12 個四級碳總共 26 個碳，其中δ182.1 為 flavones 之 carbonyl (C-4)的吸收訊號。

而 COSY 光譜(圖 20；DMSO-d6)顯示在δ7.41 (s)、δ6.71 (s)、

δ6.68 (s)、δ7.42 (d)、δ6.88 (d)有芳香族之質子訊號，其中依 COSY 交叉峰，可以確定δ7.42 與δ6.88 二訊號有偶合關係，應可分別歸屬 給 H-6'及 H-5'。從 HMQC 光譜 (圖 21；DMSO-d₆)交叉峰，發現 H-5' (δ6.88 )與δ146.1 (C-3')、δ121.6 (C-1')、δ150.2 (C-4') 有關，而 H-6'與δ113.6 (C-2' ) 之訊號相關，故 flavone 結構上 C 環之訊號可正 確歸屬。δ7.41 訊號與δ121.6 (C-1')、δ146.1 (C-3')、δ119.2 (C-6') 的遠程相關支持此等歸屬。因δ103.2 訊號歸屬給 C-3 (HMQC 顯示 δ6.68 之質子訊號為 H-3)與 C-1'有遠程相關，推測 C 環接在 C-2，

正是 flavone 的結構。δ 103.2 (C-3)訊號也與δ164.2、δ182.1、δ104.5 等訊號相關，故分別歸屬給 C-2、C-4、C-10。最後一個芳香族質子 訊號δ6.71 應是 H-6 (依 HMQC，δ90.3 是 C-6)與δ155.6、δ163.6、

δ112.2、δ104.5 (C-10)的 HMBC(圖 22；DMSO-d6)相關，分別可順 利歸屬為 C-5、C-7、C-8 的訊號。而δ2.81 及δ2.65 經 HMQC 確定 是 C-1"(δ21.0)碳十三訊號的質子訊號與 C-8 (δ112.2)有遠程偶合關 係，也與碳譜上δ158.0 (可歸屬給 C-9)芳香族碳十三訊號有相關，另 外從上述紫外光光譜及化學位移資料，可以確定化合物 IV 是 8 位有 取代之 7-methoxy-5,3',4'-trihydroxyflavone，而且δ2.81 及δ2.65 應歸 屬於 H-1"，δ21.0 應歸屬於 C-1"，均能符合 HMBC 的要求。

至於分佈在較高磁場的脂肪族質子訊號，從 H-1"的 COSY 偶合關 係，可確定δ2.18 歸屬於 H-2"，依 HMQC，δ52.4 歸屬於 C-2"。其 他 HMBC 偶合關係與上述 NMR 光譜資料整理如表三所示。且從 H-2"

綜合上述資料推知化合物 IV 可能的結構如下：

O

表三、ugonin H 之 NMR 光譜(DMSO-d6, 200 及 50 MHz)

【五】化合物 V

化合物 V 為黃色粉末，熔點 254~256 ℃，微溶於甲醇不溶於水。

TLC 經溶媒(chloroform：methanol＝10：1)展開後 R_f值為 0.35，且在 噴 10%硫酸溶液加熱後顯色呈淡黃色，FeCl3試驗呈青綠色。

紅外光光譜(圖 24)在 3118 ㎝^-1附近為寬幅吸收表示有羥基， 1651

㎝^-1有共軛羰基吸收，1613、1450 ㎝^-1為苯環之吸收，1189 ㎝^-1為-C-O 基吸收。

紫外光光譜(圖 25)在 346 nm、275 nm 有最大吸收，前者為 Band I 吸收波長，後 者為 Band II 吸收波長，符合黃酮類(flavones)化合物的 吸收特性，且與 ugonin H 之紫外光光譜相似，故推定化合物 V 亦為 黃酮類化合物。進一步將化合物加入 shift reagent，其變化如下表所 示：

UV 圖譜(nm)：

shift reagent MeOH NaOH AlCl₃ AlCl₃/HCl NaOAc NaOAc/H₃BO₃ Band I 346 404 412 361 394 370 Band II 275 278 280 290 272 263

(1) 加入氫氧化鈉[1% (w/v) NaOH]：Band I 由 346 nm 向長波長移動 58 nm，且強度不變，表示化合物之 B 環在第 4'位有羥基(4'-OH)，Band II 也有些微往常波長移動，可能第 7 位有羥基。

(2) 加入三氯化鋁[10% (w/v) AlCl₃]：Band I向長波長移動 66 nm，Band II 向長波長移動 5 nm；且再加入鹽酸(1N HCl)後，Band I 往短波長移 動 51 nm，Band II 吸收幾乎不變，表示 B 環上有鄰位二羥基，A 環 第 5 位上有羥基(5-OH)。

(3) 加入醋酸鈉[10% (w/v) NaOAc]：Band I 往長波長移動 48 nm，

Band II 的移動很小，表示第 4'位有羥基；再加入硼酸[10% (w/v) H3BO3] 後，Band I 往短波長移動 24 nm，亦證明含有鄰位二羥基。

綜合以上紫外光譜資料得知此化合物亦為 3', 4', 5 位有 OH 基之黃酮 類化合物，但 7 位亦可能含有 OH 基。

EI 質譜(圖 26)顯示其分子離子主要吸收峰為 422 (1.0)，其它碎片

離子峰尚有 351、337、299、270、165、134、109 等吸收，與 ugonin H 裂解模式類似，故推定化合物 V 的基本骨架應與 ugonin H 相似。

¹H-HNR 光譜(圖 27；DMSO-d₆)顯示在δ7.35 (1H, s, H-2')、δ6.86 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5')、δ7.39 (1H, d, H-6')為 1,3,4 取代芳香環上的質 子訊號；δ6.43 (1H, s)及δ6.61 (1H, s)為芳香環上的質子訊號，δ 13.20 (1H, s)為第 5 位羥基的質子訊號，比較化合物 V 與 ugonin H 之 氫譜化學位移 (如表四)，發現化合物 V 除了缺少芳香環甲氧基的訊 號外，大致與 ugonin H 的氫譜相似。

¹³C-NMR 光譜(圖 28；DMSO-d₆)和 DEPT 實驗(圖 29；DMSO-d₆) 顯示此化合物有 6 個次甲基(CH)、5 個亞甲基(CH2)、2 個甲基(CH₃) 及 12 個四級碳總共 25 個碳，其中δ181.9為 flavones 之 carbonyl (C-4) 的吸收訊號。與氫譜情況相同，除缺少芳香環甲氧基的訊號外，大致 與 ugonin H 的碳譜相似 (如表四)。

比較化合物 V 在高磁場之化學位移訊號與 ugonin H 較為相近，

可能脂肪環部分之結構類似；且如前述化合物 V 並無δ56.3 之甲氧 基訊號，從 DEPT 光譜得知化合物之 C-7 依然為一四級碳，故推論 C-7 位置上仍有一取代基存在。比較化合物 V 與 ugonin H 的 ¹H-NMR 光譜，發現兩者在 H-6 之化學位移有較大差異，且往高磁場移動，故

在文檔中 1. 釘地蜈蚣抗過敏、抗發炎及抗細胞增殖活性成分之研究 2.引藻細胞分化誘導及抗細胞增殖之活性成分研究; 1.Studies on Antiallergic, Antiinflammatory and Antiproliferation Constituents of Helminthostachys zeylanica (L) Hook.2. Studies on Differentiation-induced and AntiproliferationConstituents of Cryptomon (頁 10-0)