17 處理下 fin219-2 突變株及雙突變株 gasa4fin219-2 都對 JA 呈現較不敏感的外表型 (圖一 C~D)；而 gasa4 突變株則是在 25、50、75 μM MeJA 處理下與野生型皆會 呈現較敏感的外表型(圖一 C~D)。其中在 50 μM MeJA 處理下 gasa4 突變體較野 生型有稍微對 MeJA 較不敏感的現象，因此之後會固定使用 50 μM MeJA 作處理 濃度。
接著我們將野生型 Col、兩者的突變株 gasa4、fin219-2 以及雙突變株 gasa4fin219-2 播撒在不添加、只含50 μM GA3、只含50 μM MeJA 以及兩者均添 加的 0.3% GM 培養基上，在黑暗及不同光強度之遠紅光下生長三天後，測量植 株下胚軸長度。結果顯示，在黑暗或遠紅光照射下，50 μM GA 都能促進下胚軸 的延長(圖二；圖三)，而 gasa4、fin219-2 及雙突變體 gasa4fin219-2 只有在遠紅 光照射下會較 Col 具有較延長的下胚軸 (圖二 B~C；圖三 C~F)，顯示在遠紅光
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下各突變株都對 GA 的促進作用較敏感，因此 GASA4 及 FIN219 均可能參與在 吉貝素的訊息傳遞路徑中，並且都是扮演負調控者的角色。另一方面，我們也發 現添加50 μM MeJA 在各種情形下也都能抑制下胚軸的生長(圖二；圖三)；而 gasa4、fin219-2 及 gasa4fin219-2 無論在黑暗及遠紅光照射下都具有較長的下胚 軸(圖二；圖三)，顯示各突變株都對 JA 的抑制作用較不敏感，因此 GASA4 及 gasa4fin219-2 在黑暗及弱遠紅光照射下，在處理 MeJA 下都較野生型具有較少的 花青素累積，顯示其對於 MeJA 所造成花青素累積的作用較不敏感，因此 GASA4
19 株種子進行發芽率的測試。在此所使用的藥劑 Paclobutrazol (PAC)，為 GA 生合 成抑制劑，能抑制 ent-kaurene 進行氧化作用形成 GA12的反應，進而抑制內生性 GA 的生合成。我們將種子播撒在含不同濃度 (25、50、100、250 μM ) PAC 的 GM 培養基上，先經黑暗冷處理三天後，移至白光下生長並逐日觀察種子的發芽 比例。隨著 PAC 濃度提升，種子發芽的比例會越低。fin219-2 及 gasa4fin219-2 在不同濃度 PAC 處理下發芽率都較野生型高(圖六 A)；而 gasa4 則是只有在 50 μM PAC 處理下具有較野生型高的發芽率(圖六 A)。圖六(B)則是在 250 μM PAC 處理下，逐日所觀察到的發芽率之統計圖，我們同樣可以發現 fin219-2 及
gasa4fin219-2 的發芽率明顯高於野生型，而 gasa4 反而有略低於野生型的現象。
當 PAC 處理的時間延長到兩周後，發現長出的植株有白化的現象，測量其
20 同處理條件下 GASA4 及 FIN219 的蛋白質表現。我們利用 pGASA4GFP、
fin219-2pGASA4GFP 及 pGR219pGASA4GFP 為材料，並以 GFP 抗體偵測，觀察 FIN219 的表現是否影響 GASA4 的蛋白質表現。GASA4 的表現會受 GA 處理所 抑制，而在 MeJA 處理下 FIN219 也會負調控 GASA4 的表現(圖八 C)；另一方 面，我們也利用 Col、gasa4 及 pGASA4GFP 為材料，並以 FIN219 抗體偵測，觀 察 GASA4 是否影響 FIN219 的蛋白質表現。FIN219 的表現會受 GA 及 MeJA 所
ALLENE OXIDE SYNTHASE (AOS) 和 LIPOXYGENASE 2 (LOX2)是茉莉 酸的生合成酵素之一，在質體(plastid)中作用為將亞麻酸轉化成重要前驅物 OPDA。OPDA-REDUCTASE 3 (OPR3) 則是在過氧化氫體中將 OPDA 轉化為 JA 的重要酵素。在 MeJA 處理下，fin219-2 突變株中 LOX2、OPR3 及 AOS 的表現
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VEGETATIVE STORAGE PROTEIN 1 (VSP1)是參與 JA 所誘導之防禦反應的 重要基因，在植物受到逆境時會受 JA 誘導而大量表現。根據我們的實驗結果發
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之表現，觀察這些基因是否受到 GASA4 或 FIN219 的調控。
4-1、DELLA 基因
DELLA 蛋白是 GA 反應的關鍵調控者，而在先前的研究也發現部分 GASA
會影響 DELLA 的表現，因此我們檢測在各種處理下，阿拉伯芥五種 DELLA (RGA、GAI、RGL1、RGL2 及 RGL3)的基因表現。結果顯示在五個 DELLA 中只 有 RGL3 的表現明顯受 GASA4 及 FIN219 的調控(圖十一)。在 GA3處理下，RGL3 的表現量會些微上升，而 gasa4 突變株的表現則是有略高於 Col 的現象；外加 MeJA 也會促使 RGL3 的表現量上升。與 Col 相比，fin219-2 突變株明顯具有較 低的表現，而 gasa4 突變株則是具有較高的表現量。以上結果顯示在 MeJA 處理 下，FIN219 能正調控 RGL3 的表現，而 GASA4 則是扮演負調控者的角色。
4-2、SPY 基因
SPINDLY (SPY) 是影響 DELLA 蛋白活性的重要基因，因此我們也同樣檢測 SPY 基因在不同處理下的表現量。結果顯示，MeJA 處理會使 SPY 基因表現略微 下降，而 gasa4 突變株有明顯高於 Col 的表現量(圖十一)。因此在 MeJA 處理下，
GASA4 似乎也能藉由抑制 SPY 的表現去影響 DELLA 蛋白的活性，進而調控 GA 反應。
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討論
一、GASA4 與 FIN219 共同參與在吉貝素訊息傳遞路徑
經由對 GA 相關性狀的觀察，我們發現不同的植物組織中 GASA4 及 FIN219 的影響程度不同。在下胚軸的促進性測試中(圖二；圖三)，gasa4 及 fin219-2 都 呈現對 GA3處理較為敏感的長下胚軸外表型，而 gasa4fin219-2 則是具有更加抽 長的下胚軸，可見 GASA4 與 FIN219 會分別影響 GA 促進下胚軸的過程。但在 種子萌發率的測試中，在外加 PAC 處理下 gasa4 種子的萌發速度會較野生型來 的慢，而 fin219-2 種子反而會較快萌發，gasa4fin219-2 則較類似 fin219-2 的性狀 (圖四)。因此在種子萌發的過程中 GASA4 與 FIN219 又扮演相反的角色。 突變株具有較不敏感的外表型，而雙突變株 gasa4fin219-2 則較偏向於 fin219-2 的性狀(圖二；圖三；圖五)，可見在這兩種組織中 FIN219 扮演著主導的角色，
GASA4 的影響並不明顯；在花青素累積的部分，在弱遠紅光下處理 MeJA，則
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雙突變株 gasa4fin219-2 的花青素累積量會明顯少於 gasa4 及 fin219-2 突變株(圖 四)，此時 FIN219 與 GASA4 比較像是經由不同調控路徑去影響相同性狀。
目前研究已知 FIN219 為 JA 反應的正調控者，在外表型的檢測都一致顯示 fin219-2 突變株會對 JA 相關性狀呈現較敏感的現象；而在基因檢測方面，fin219-2 突變株中 JA 生合成基因及訊息傳遞因子的表現較低(圖九；圖十)，也符合 FIN219 (Nahirñak et al., 2012)。
GASA4 大量表現轉殖株在創傷處理下過氧化氫的累積量會比野生型低，因 此 GASA4 具有抗氧化的功能。但若大量表現的是將保守序列置換後的片段，則 抑制的效果變的不明顯，因此 GASA4 能藉由此保守序列影響氧化還原狀態的恆 定，進而影響植物對於 GA 的反應 (Rubinovich and Weiss, 2010)。而氧化還原的 恆定是否會影響到植物對 JA 的反應也是之後可以研究的目標。GASA 基因家族 也能調節除了 GA 以外其他荷爾蒙的恆定，研究發現大量表現 FsGASA4 不但能 增加內生 SA 的量，還能增加 SA 生合成及訊息傳遞基因的表現(Alonso-Ramı´rez
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et al., 2009)。我們的研究則發現 GASA4 會影響 JA 生合成基因及訊息傳遞基因 的表現，因此 GASA4 也可能藉由影響內生 JA 的含量去影響 JA 反應。最近也有 幾篇研究指出，GASA 基因家族會影響 DELLA 基因表現。AtGASA5 能藉由促 進 GAI 的表現去負調控開花(Zhang et al., 2009)。GsGASA1 會促進 RGL2 及 RGL3 的表現，進而影響慢性冷處理對根的抑制性(Li et al., 2011)。在我們的研究則發
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(圖四)。而各突變株在黑暗及弱遠紅光照射下，在處理 MeJA 下都較野生型具有 較少的花青素累積，但在強遠紅光照射下則與野生型沒有顯著差異(圖四)。會造 成這樣的性狀可能是因 GASA4 與 FIN219 在不同的遠紅光強度條件下的表現量 不同有關。
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結論與未來展望
根據所得的研究結果，我們推論出 GASA4 與 FIN219 的可能調控模式圖(圖 十二)：外加 GA 能促進 GASA4 的表現，GASA4 能藉由抑制 FIN219 的表現而抑 制 JA 反應，此外 GASA4 本身也能藉由抑制 RGL3 的基因表現而促進 GA 反應 的進行，兩條路徑的共同調控使植物最終偏向於進行 GA 所調控的生長發育反應；
外加 MeJA 則是會促進 FIN219 的表現，FIN219 本身能促進 JA 反應，而其又能 藉由抑制 GASA4 的表現而抑制 GASA4 對於 SPY 及 RGL3 基因的抑制作用，兩 條路徑的共同調控使植物最終偏向進行 JA 所調控的防禦反應。
本實驗以 RT-PCR 觀察在外加 GA3及 MeJA 的情形下，GASA4 與 FIN219 對於 JA 生合成基因、JA 訊息傳遞因子及 GA 相關基因表現之影響，但差異性並 不是很明顯，建議之後能以 qPCR 再次驗證，或是利用抗體直接觀察蛋白質表現 量。此外我們也發現 GASA4 會影響 JA 生合成基因表現，推測 GASA4 能藉由影 響植物體內 JA 生合成以調控 JA 反應，因此之後可直接偵測內生 JA 含量，以證 實此推論。在 GASA4 及 FIN219 彼此調控及外加 GA3或 MeJA 對兩者表現量之 調控的部分，基因表現結果與蛋白質表現有些出入，推測可能還有其他後轉譯修 飾作用共同調控，因此之後可再檢測 GASA4 及 FIN219 是否影響蛋白質降解或 磷酸化過程。
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