1、Z-DEVD-FMK 處理能降低 teroxirone 抑制 Huh7 細胞生長之效果 且下調外源性細胞凋亡相關基因表現
利用 MTT assay 檢測 teroxirone 對三株常見肝癌細胞株 Hep3B、
HepG2 與 Huh7 之影響 (圖一 A)，在較低濃度藥物處理僅 Huh7 細 胞生長會受到明顯抑制。由西方墨點法結果顯示 (圖一 B)，
extrinsic apoptosis pathway 相關蛋白則隨加藥時間延長或濃度上升 而上升，訊息傳遞上游的 Fas-associated protein with death domain (FADD)、caspase-8 與 caspase-6 隨加藥濃度上升，表現量上升，到 最高濃度時因為已處於凋亡晚期，所以表現量開始下降；下游的 caspase-3 與 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)則有隨著加藥時 間或濃度上升而有表現量上升的趨勢，證明 teroxirone 會誘發 Huh7 細胞產生外源性細胞凋亡。
Caspase-3 為細胞凋亡相關蛋白，藉由 caspase-3 抑制劑
Z-DEVD-FMK 前處理對於 teroxirone 所造成的細胞凋亡與其抑制 增生效果是否會影響，就可以間接證明 teroxirone 所誘發的細胞凋 亡是否與其抑制增生有關連性，以及確定其細胞凋亡是否透過外 源式途徑。比較有無抑制劑 Z-DEVD-FMK 處理的 MTT 結果 (圖 二)。發現相同藥物濃度處理下有抑制劑前處理的存活率較高，且
31 Z-DEVD-FMK 處理確實會抑制 teroxirone 所引發的細胞凋亡，並 讓細胞出現 G2/M arrest 的現象。由上述 MTT 與細胞週期分析證明 teroxirone 是因為誘發 Huh7 產生細胞凋亡，才使得細胞存活率下 降。
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FADD 下游 caspase-8,-6,-3 與 PARP 都要到最高濃度藥物作用才看 到有活性的蛋白表現。由此可看出抑制劑 Z-DEVD-FMK 前處理能 降低細胞凋亡程度，上述結果可以間接證明 teroxirone 所誘發的細 胞凋亡是透過外源式途徑。
2、低濃度的 teroxirone 能抑制 Huh7 細胞遷移並降低癌細胞轉移相 關基因表現 傷口快要完全癒合，而有加藥的組別，與低濃度 teroxirone 處理的 細胞傷口寬度比較，高濃度藥物處理下細胞刮痕傷口較寬。由統
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Huh7 細胞遷移實驗 (transwell migration assay)結果 (圖六 A)，
可看出未加藥的控制組，通過 transwell 的細胞明顯較有加藥的組 別來的多，而顯微鏡下觀察亦可發現，藥物處理濃度越高，細胞 通過 transwell 的數目越少。統計結果顯示隨加藥濃度上升，細胞 通過的 transwell 的比例有明顯下降，在 0.5 M 就達到顯著差異。 細胞遷移的能力。以細胞侵入實驗 (transwell invasion assay)觀察 Huh7 細胞侵入能力是否受到藥物影響，結果顯示 (圖七 A)不論是 LAS4000 影像紀錄還是顯微鏡下的細胞數量，隨加藥濃度越高，
細胞穿越 matrigel 通過 transwell 的比例越低，統計結果在最低濃 度的藥物處理下 (0.5 M)，細胞穿越 matrigel 到達下層的數量較 控制組達到顯著差異。相較 HepG2 結果 (圖七 B)，在藥物處理後 細胞侵入能力不受影響，統計結果加藥組與控制組亦無顯著差異，
為負控制組。
34 量有隨 teroxirone 藥物濃度增加而有下降的趨勢。與血管新生相關 的 VEGF 也同樣有下降趨勢。反觀負控制組 HepG2 細胞則沒有因 為 teroxirone 處理而有下降趨勢。這些結果都說明低濃度的
teroxirone 對於抑制癌細胞轉移有很好的效果。
3、Teroxirone 抑制 Huh7 肝癌類幹細胞之增生與幹細胞標誌物 透過 BrdU staining assay 之螢光強度，來判斷細胞增生程度。
螢光強度越強，表示細胞有頻繁的增生，使 BrdU 可大量嵌入新合 成的 DNA 中；反之亦然 (圖十 A)。由結果可看出隨加藥濃度上升，
Huh7 肝癌類幹細胞的大小有明顯變小，BrdU 螢光強度亦有明顯
35 CD133、ALDH1A 之結果相似，在 30 M 的 teroxirone 處理後，
Huh7 肝癌類幹細胞 NANOG 螢光強度跟 control 相比有明顯下降 趨勢，比對西方墨點法結果 (圖十一)，最高濃度 30 M 的 teroxirone 處理後，NANOG 蛋白表現量下降高達約 50%。實驗證明 teroxirone 處理具有抑制 Huh7 肝癌幹細胞的細胞標誌物 CD133、ALDH1A1 與 NANOG 的能力。
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4、Teroxirone 抑制 Huh7 細胞於裸鼠形成之腫瘤生長
由實驗期間測量腫瘤體積的統計結果 (圖十二 A)，沒有藥物 mg/kg 的 teroxirone 處理下，腫瘤的大小有明顯的變小，腫瘤重量 也有明顯減輕 (圖十二 D)。腫瘤組織切片以 PCNA 為一抗進行免 疫螢光染色，於共軛焦顯微鏡下觀察 (圖十三)，在沒有藥物處理 的控制組，多數細胞的細胞核之位置，都有偵測到 PCNA 的綠色 螢光，表示多數細胞處於細胞增生的狀態；反觀有加藥的實驗組，
代表 PCNA 的綠色螢光與控制組相比，有明顯下降，且隨加藥濃 度上升，下降的幅度越大，證明 teroxirone 的確具有抑制癌細胞生 長的效果。由 H&E 染色結果 (圖十四)可以發現，經過藥物處理的
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組織切片與控制組相比，細胞排列較為鬆散。並可以透過觀察細 胞型態發現，部分細胞開始凋亡，出現細胞凋亡的細胞特徵 (圖十 四黑色箭頭所指出之細胞)，這些特徵包括：細胞開始皺縮，使之 脫離周圍細胞、細胞核變成類似新月狀緊貼於細胞膜、部分細胞 核開始裂解成數個小核等。進一步利用 TUNEL 分析腫瘤組織切片 中是否有產生細胞凋亡 (圖十五)，未加藥的控制組，細胞核皆未 偵測到 TUNEL 的綠色螢光；而有藥物處理的實驗組，部分細胞有 偵測到 TUNEL 的綠色螢光，且隨藥物處理濃度上升，有綠色螢光 強度越強，表示 teroxirone 會使癌細胞產生細胞凋亡。最後，初步 的西方墨點法結果 (圖十六)顯示，執行細胞凋亡反應的 caspase-3 在低濃度 0.9 mg/kg 藥物濃度處理下有上升趨勢；其下游 PARP 在 有加藥的組別中亦被水解成 89 KDa 的片段，teroxirone 處理後細 胞凋亡相關蛋白開始表現，再次證明 teroxirone 確實會使癌細胞產 生細胞凋亡。
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因此本研究探討新興三環藥物 teroxirone 對於肝癌細胞生長機制的影 響。過去已有文獻指出 teroxirone 具有抑制非小型肺癌細胞株生長的 效果 [12]，而實驗室也根據 MTT 與西方墨點法之結果(圖一 A 與 B)，
初步證實 teroxirone 能抑制肝癌細胞株 Huh7 增生，並誘導產生外源 性細胞凋亡途徑。本篇利用 caspase-3 的抑制劑 Z-DEVD-FMK 前處理 後，透過 MTT、細胞流式儀與西方墨點法來驗證 teroxirone 對於 Huh7 細胞的影響。
選用 Z-DEVD-FMK 是因為有文獻指出，該抑制劑不僅僅對 caspase-3 有抑制效果，對其上游 caspase-8 亦有抑制效果 [30,41]，故 適用於本篇探討外源性細胞凋亡途徑。MTT 的結果證明
Z-DEVD-FMK 前處理後，能回復細胞存活率 (圖二)，表示 teroxirone 對 Huh7 細胞造成的細胞存活率下降與細胞凋亡有直接關係。流式細 胞儀分析細胞各週期分布，也發現 10 M 的 teroxirone 處理前若有