探討三環藥物Teroxirone抑制肝癌細胞生長的機制

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 探討三環藥物 Teroxirone 抑制肝癌細胞生長的機制 Study of Mechanisms in Suppressing the Growth by Teroxirone in Hepatocellular Carcinoma Cells. 研究生：王文興 Wen-Hsing Wang. 指導教授：方剛博士 Kang Fang. 中華民國 105 年 8 月.

(2) 目錄. 壹、中文摘要.............................................................................. 2 貳、英文摘要.............................................................................. 4 參、文獻回顧.............................................................................. 6 肆、研究目標............................................................................ 14 伍、材料與方法 ....................................................................... 15 陸、結果.................................................................................... 30 柒、討論.................................................................................... 38 捌、參考文獻............................................................................ 46 玖、圖 ........................................................................................ 56. 1.

(3) 壹、中文摘要肝癌在全球癌症致死率排名第二，而肝內轉移途徑是造成肝癌復發與高死亡率的主要原因之一。但肝癌轉移機制仍不清楚。三環氧化物 triptolide 的衍生物 teroxirone 為一合成的抗癌試劑，過去研究發現 teroxirone 會使人類非小細胞肺癌細胞經內源性途徑細胞凋亡。本篇使用常見的肝癌細胞株 Huh7 (具有突變 p53)、HepG2 (野生型 p53)與 Hep3B (無 p53)進行實驗，實驗顯示 teroxirone 會使肝癌細胞株 Huh7 產生外源性途徑細胞凋亡。進一步使用 caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-FMK 來確認 teroxirone 所誘導 Huh7 產生細胞凋亡是否透過外源性途徑，發現細胞在加藥前經過 caspase-3 抑制劑處理，外源性細胞凋亡相關的蛋白質表現降低。另外，透過傷口癒合檢測 (wound-healing assay)與細胞遷移與侵入實驗 (transwell migration and invasion assay)都顯示藥物濃度低於 IC50 的 teroxirone 處理可以抑制 Huh7 產生細胞遷移與侵入。而利用酶譜分析 (zymography)與西方墨點法 (western blot)之結果可看出在低濃度的 teroxirone 處理後促進細胞轉移相關的蛋白基因表現皆有受到抑制。此外，證明了 teroxirone 會去降低 Huh7 stem-like cells 增生與其幹細胞指標。在動物模式中，異體移植的 Huh7 腫瘤 teroxirone 處理，會使腫瘤透過細胞凋亡的方式達到抑制腫瘤生長的目的。結論，teroxirone 會透過活化外源性細 2.

(4) 胞凋亡途徑抑制人類肝癌細胞的生長，且低濃度的藥物處理能抑制肝癌細胞的遷移與轉移。另外，teroxirone 能降低肝癌類幹細胞的幹細胞特性，並抑制動物模式中異體移植之腫瘤生長，顯示 teroxirone 在治療肝癌具有發展潛力。. 關鍵字：肝癌細胞、teroxirone、外源性細胞凋亡、轉移、肝癌類幹細胞. 3.

(5) 貳、英文摘要 Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second most common cause of cancer mortality, worldwide. The poor prognosis and high mortality rate is mainly the result of intra-hepatic metastases. The mechanisms underlying the metastasis of HCC remain unclear. The triepoxide derivative, teroxirone, is a synthetic antitumor agent. Previously, teroxirone was shown causing apoptotic cell death in human non-small cell lung cancer cells and the effects related to intrinsic pathway. In this study, human HCC cell lines HepG2 (wild type p53) , Huh7 (mutated p53), and Hep3B (p53 null) were used to study the effect of teroxirone on liver cancer cells. Teroxirone was shown inducing of apoptotic cell death of Huh7 cells through extrinsic pathway. Caspase-3 inhibitor, Z-DEVD-FMK, was used to confirm that teroxirone induced Huh7 apoptosis by inducing extrinsic pathway characters. Protein levels of extrinsic apoptosis pathway markers were decreased as a result caspase-3 inhibitor pretreatment. The data of wound-healing assay, transwell migration assay and transwell invasion assay, showed that low concentrations of teroxirone suppressed migration and invasion determination of Huh7 cells. The zymographic and western blot analysis indicated that the expression of metastasis promoting genes MMP-2, MMP-9, and VEGF were reduced after low concentrations teroxirone treatment. Furthermore, we also proved that teroxirone attenuated the cell viability and the stem cell markers intensity of Huh7 stem-like cells. In an in vivo model, subcutaneous injection of teroxirone suppressed the growth of xenograft Huh7 tumor cells by apoptosis. In conclusion, this 4.

(6) research elucidates the effects and molecular mechanism for teroxirone on HCC cells. Thus, teroxirone is a new candidate in eradicating liver cancer cells.. Keyword：liver cancer, teroxirone, extrinsic apoptosis, metastasis, liver cancer stem-like cell. 5.

(7) 參、文獻回顧 1、肝癌肝癌是全球第四常見的癌症，且死亡率僅次於肺癌[1]。根據行政院衛生署的統計資料，民國 101 年台灣地區主要死亡原因，因惡性腫瘤死亡仍是所有死亡原因之首，而在所有惡性腫瘤造成的死亡之中，肝細胞癌 (簡稱肝癌)佔死亡原因中第二位 [2]。而肝癌主要發生原因包括肝硬化 B 型與 C 型肝炎、遺傳、肥胖等 [3]。治療方法主要分為兩種，一種是手術治療，包括肝臟切除與肝臟移植；另一種為非手術治療的方法，包括經導管動脈栓塞、化療、藥物治療與放射性治療等 [4]。. 2、癌症轉移癌症轉移是部分癌細胞離開原發腫瘤器官移動到其他器官並再次增生、發展並生成腫瘤的生理現象。透過基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs)產生，侵犯腫瘤外組織之胞外基質 (extracellular matrix, ECM)與血管管壁，使癌細胞得以內滲進入循環系統 [5,6]。轉移能力是治療癌症所遭遇到的最大阻礙，即便透過手術方式切除腫瘤，轉移到其他部位的癌細胞仍可能復發產生腫瘤，造成病人有較差的預後表現，甚至導致病人死亡。因此它被當成是評斷 6.

(8) 癌症發展程度以及治療難度的重要指標 [7]。轉移需要入侵循環系統，過程十分複雜。當腫瘤增長擴大到一定程度，就需要更多的養分與氧氣，故 hypoxia-inducible factor 2-會使血管生成因子 (VEGF、angiopoirtin-2 與 PDGF)過度表現 [8]。產生新的微血管來提供腫瘤所需的資源。而這些微血管比正常組織者來得脆弱、不但管壁細胞稀少且到處都是裂隙，使得部分脫離腫瘤的癌細胞能夠透過移動與侵犯進入微血管，並順著循環系統到達身體其他重新增殖形成新的病灶 [9]。以肝癌為例，最常見的轉移為肝內轉移，癌細胞透過肝門靜脈轉移到該地其他區域；而肝外轉移的目標多為肺臟、骨頭或淋巴結等器官 [10,11]。. 3、血管新生血管新生 (angiogenesis)是後天的生理過程，意指以舊有血管系統為基礎，發展出一套新的微血管網而形成一個血流供應系統。不同於胚胎時期的血管生成 (vasculogenesis)，新生的血管是由血管前驅性細胞分化而來 [12]。血管生成在腫瘤生長扮演重要的控制角色，若沒有血管生成腫瘤呈現休眠狀態，其中細胞增生速率與細胞死亡速率達到平衡 [13]，而腫瘤與其微環境都會釋出促進血管新生的因子，當血管新生發生時， 7.

(9) 新生血管不僅提供腫瘤生長代謝所需的養分，也可做為腫瘤進入轉移的潛在途徑 [14,15]。Vascular endothelial growth factor (VEGF) 就是其中之一，VEGF 為一類促進血管表皮細胞生長、存活與形成血管的因子，其有不同亞型分別為 placental growth factor (PLGF)、 VEGF-B,VEGF-C 和 VEGF-D [16]。VEGF 會與內皮細胞表面的血管內皮生長因子受體-2 (VEGFR-2)結合，活化 tyrosine kinase pathway 進行相關的訊息傳遞，誘發內皮細胞增生 [17]。. 4、基質金屬蛋白酶基質金屬蛋白酶 (MMPs) 是一系列鋅依賴性內肽酶 (zinc-dependent endopeptidases)能降解細胞外基質 (ECM)的酵素，過去文獻利用 MMPs 的抑制劑 (TIMPs)或上調 MMPs 基因表現等方式，得到 MMPs 的多與少直接影響腫瘤細胞的侵襲 [7]。其中在癌症研究領域又以 MMP-2 與-9 研究最為透徹。因為 MMP-2 與-9 分別為 gelatinase A 與 gelatinase B，同屬於Ⅳ型膠原酶，能降解基底膜 (basement menleanes，BMs)，在癌細胞侵入時扮演重要角色 [18]。另外 MMP-2 與-9 除了參與血管基底膜的降解，同時也參與血管生成過程中 ECM 的重塑，是調控血管新生十分關鍵的角色。故血管內皮細胞受到 VEGF 刺激會釋出大量 MMP-2 與-9 來水解周圍 ECM 8.

(10) 並降解血管基底膜讓其內皮細胞可以向外延生，新生的內皮細胞就會在被降解的 ECM 孔隙中增生，進而形成一個有效的微血管網絡 [15]。而過去有文獻指出若是抑制 MMP 的產生也能夠間接地降低 VEGF 的表現 [19]。. 5、Teroxirone Teroxirone(1,3,5-triazine-2,4,6(1H,3H,5H)-tri-one-1,3,5-tri-(oxiranyl methyl)，為天然三環氧化物 triptolide 的衍生物，由 Budonowski 於 1968 年合成，分子量為 297.3，化學式 C12H15N3O6。Triptolide 是由雷公藤甲素中所萃取出有抗癌功效的天然化合物，研究指出能使小鼠長期存活且不易引發白血病，亦可抑制裸鼠中的人類乳癌細胞和倉鼠中的人類膽管癌細胞的生長 [20]，由此可以推斷人工合成的三環氧化物 teroxirone，也應具有抗癌的效果。Teroxirone 為烷化劑，可分為-與 -兩種立體異構物，其中-isomer 有較好的水溶性，以及可以有效增加動物的存活率 [21]。它會和 DNA 的鹼基共價鑑結，並以烷基取代 DNA 上的氫原子，使 DNA 無法複製 [22]。針對有 cyclophosphamide (另一種烷化劑)抗藥性的 P388 和 L1210 型的白血病，teroxirone 有很好的療效 [23]。另外，實驗室也發現 teroxirone 也會透過活化內源性細胞凋亡抑制人類非小細胞肺癌細胞 9.

(11) 增生 [24]。. 6、細胞凋亡細胞凋亡主要有兩個途徑：內源性細胞凋亡途徑為細胞內 B-cell leukemia/lymphoma 2 (BCL-2)蛋白質家族被活化進而影響下游粒線體相關的訊息傳遞；外源性細胞凋亡途徑則是細胞膜上 death receptors 被活化，產生一連串 caspase 活化反應 [25]。內源性細胞凋亡是因為細胞內的壓力，如 DNA、細胞骨架損傷等，使細胞內產生促進細胞凋亡的 BH3-only protein family，此類蛋白保有 BH domains (Bcl-2 Homology domains)，透過結構上的不同，蛋白可以相互結合。正常細胞中有一群抗細胞凋亡的蛋白，Bcl-2、Bcl-XL 與 Mcl1 等，這類蛋白擁有 4 個 BH domains (BH1、BH2、BH3 與 BH4)。這類抗凋亡蛋白會與另一群僅有 BH3 domain 的 Bim (BCL2L11)或擁有 BH1、BH2、BH3 domain 的如 Bax、Bak 等促進細胞凋亡蛋白結合，目的是避免其被活化。當促進細胞凋亡蛋白的相對濃度高於抗細胞凋亡的蛋白，就會影響粒線體膜上的通透性，使細胞進入內源性細胞凋亡途徑。以 DNA 損傷為例，p53 大量表現會作用在其轉錄目標基因，產生大量 PMAIP1 (一種 BH3-only protein)，PMAIP1 活化被 MCL1 抑制的 BCL2L11，活化的 BCL2L11 會促使粒線體釋出 cytochrome c， 10.

(12) 其會與 Apaf-1 一起活化 caspase-9，活化的 caspase-9 與 cytochrome c 和 Apaf-1 形成複合物 apoptosome 執行細胞凋亡反應 [26]。外源性細胞凋亡是因為細胞外的配體 (ligand)，如 apoptosis ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (Apo2L/TRAIL) 接上細胞膜上的受體 (receptors)，如 death receptor 4 (DR4)與 TNFRSF10B (DR5)進而活化 Fas-associated death domain (FADD)， FADD 會與 procaspases-8 和 procaspase-10 形成複合體 DISC 並活化 caspase-8 與-10。caspase-8 會再活化 caspase-6 與 caspase-3。caspase-3 下游為 PARP，PARP 被 caspase-3 作用後，會由原本的 113 Kda 變成 89 Kda 的片段，失去其 DNA 修補的能力，使得細胞凋亡反應得以持續進行 [27]。. 7、Z-DEVD-FMK N-benzyloxycarbonyl-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-fluorom ethylketone (Z-DEVD-FMK)為不可逆的 caspase-3 合成肽抑制劑。其結構上在 aspartic acid 有甲基化，藉此增強其穩定性與細胞通透性 [28]。其作用機制與 Ac-DEVD-CHO 相似，活化的 caspase-3 會使下游的 PARP 由 116 KDa 被分解 85 KDa 的片段，而其作用位點在 C 端的 Asp-216，Z-DEVD-FMK 中有 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)的結構，故可以取代 caspase-3 作用在 PARP 上的切割位點，達到抑制下游訊息 11.

(13) 傳遞的目的 [29]。過去有文獻指出 Z-DEVD-FMK 除了選擇性的抑制 caspase-3，其效果還包括抑制 caspase-8，在調節 Fas-induced intracellular signals 的半胱氨酸蛋白酶 (Cysteine proteases)扮演重要角色 [30,31]。. 8、癌症幹細胞幹細胞 (stem cells)可以透過自我更新 (self-renew)的過程，分裂增殖出與本體完全相通的未分化細胞，亦可經由不對稱分裂 (asymmetric cell division)分化成多種具有不同功能的子細胞 [32]。哺乳類的幹細胞分為兩類：一是胚胎幹細胞 (embryonic stem cells)，來自囊胚的內細胞團，有能力分化成所有組織類型；另一為成體幹細胞，存在身體各種成體組織中，如骨髓，腦，肝和皮膚 [33]，幹細胞負責組織的維持、生長與修補，在生物體中扮演重要角色。癌症幹細胞 (cancer stem cells, CSCs)為一群具有正常幹細胞特性的癌細胞。癌症幹細胞的起源有不同說法，有研究指出癌症幹細胞來自正常幹細胞，當正常幹細胞遇到特定的基因突變或環境改變，使其得到生成腫瘤的能力；另一種說法是癌幹細胞從癌細胞細胞在上皮細胞間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)的過程中，透過基因突變，進而獲得癌幹細胞特性。癌症幹細胞最早於 1994 年由急 12.

(14) 性髓性白血病 (acute myeloid leukemia)病患分離出來，可以引發 SCID 實驗小鼠產生白血病症狀 [34,35]。且癌症幹細胞被證實能造成癌症復發、轉移，以及對藥物產生多重抗藥性的結果 [36,37]。故偵測癌幹細胞或開發針對癌幹細胞的標靶藥物，對於病患的治療及預後都有很大的幫助。. 13.

(15) 肆、研究目標肝癌的發生率與死亡率在世界排名居高不下，現有的治療方式多適用於肝癌早期，若患者確診時已是晚期肝癌，治療方式就十分有限。雖然過去現有療法可以提高病人生存能力，但因癌細胞轉移所導致的肝癌復發率仍很高。近年來陸續有研究指出癌症類幹細胞因具有自我更新的能力，容易造成癌症復發、轉移以及對放射與化學藥物治療會產生抗藥性，故癌類幹細胞又被稱為腫瘤起使細胞。本篇論文觀察 teroxirone 對肝癌細胞的生長、轉移與肝癌類幹細胞的蔓延是否有任何抑制效應，以及藥物對於活體異體移植之腫瘤的影響，藉此達到根除肝癌的目的。首先是透過抑制劑 Z-DEVD-FMK 來驗證實驗室未發表的結果，確認 teroxirone 抑制 Huh7 細胞增生是透過外源式途徑細胞凋亡。並進一步探討低濃度 teroxirone 對於細胞遷移、侵入與癌細胞轉移相關指標蛋白之改變，包括 MMP-2、MMP-9、VEGF 等，鑑別 teroxirone 是否有抑制肝癌轉移的潛力。以及觀察肝癌類幹細胞的增生與相關幹細胞指標的基因表現是否因為 teroxirone 處理而受到抑制，藉此了解藥物對肝癌類幹細胞的影響，進而達到更好的治療效果。最後以動物實驗來觀察 teroxirone 對異體移植 Huh7 腫瘤的體積及重量之變化，並透過組織染色與蛋白質分析了解其機制，確認 teroxirone 在活體中是否仍能抑制癌細胞生長，達到對抗癌症的目的。 14.

(16) 伍、材料與方法 1、細胞株實驗使用 Huh7 ( p53A220G)、HepG2 ( wild-type p53)與 Hep3B (p53null)三株人類肝癌細胞株。Huh7 該株細胞株是由罹患高分化之肝癌細胞的日本 57 歲男性手術切除下培養 [38]；HepG2 則是取自 15 歲男性青少年。這一類細胞不含 B 型肝炎病毒基因組或病毒顆粒。而 Hep3B 則取自 8 歲大的男性青少年，有別於 Huh7 與 HepG2， Hep3B 帶有 B 型肝炎病毒基因組 [39]。. 2、細胞培養 Huh7 與 HepG2 兩株細胞用含有 10% 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)的 DMEM ( Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中； Hep3B 培養於 10% FBS 的 RPMI (Roswell Park Memorial Institute)中，三株皆培養於 5% CO2、37℃的培養箱中。細胞繼代時，先移除舊的培養液，以 1 mL PBS 洗去殘餘培養液，然後移除 PBS，加入 trypsin-EDTA，於 37℃作用 5 分鐘。以培養液終止 trypsin-EDTA 的作用，將細胞由培養盤上沖下，取適量的細胞於新的培養盤中，補新鮮的培養液繼續培養。細胞計數時，將由培養盤沖下來的細胞移置到 15 ml 離心管中， 15.

(17) 以 800 rpm 離心 5 分鐘後，去除含 trypsin-EDTA 的上清液，再加入 1 ml 的新鮮培養液使細胞懸浮，取 10 l 的細胞懸浮液於 1.5 ml 離心管中，加入等比例的 trypan blue 混勻，取 10 l 於血球計數器，於顯微鏡下計算細胞數量。肝癌類幹細胞培養時，取適量細胞於低貼附培養盤 (ultra low attachment dish)中，加入含 10 ng/mL bFGF (basic fibroblastic growth factor)、20 ng/mL EGF (epidermal growth factor)與 1% B27 的 DMEM/F12 培養液後，放入 5% CO2、37℃的環境培養 7 天後開始進行實驗。. 3、3-(4, 5-Dimethylthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltrazolium bromide (MTT) assay 取 2×103 個細胞，置於 96 孔盤中培養 24 小時後，移除舊的培養液，再放入含待測藥物的新鮮培養液，藥物濃度分別為 0.5、1、2、5、 10 及 20 M。藥物作用 48 小時後，將含待測藥物的培養液移除，再同時加入 80 l 不含血清的培養液及 10l 的 MTT 試劑 (5 mg/ml, Sigma)，置於 37℃培養箱 3 小時。將含有 MTT 的培養液吸出，加入 100l 的 dimethyl sulfoxide (DMSO)，待紫色結晶溶解後，以光電比色計 (BioRad)測試樣品在波長 540 nm 下的吸光值。 16.

(18) 4、流式細胞儀分析細胞凋亡將 2×105 個細胞種於 12 孔盤中培養一天，以濃度 0、2、5 及 10 M 的藥物處理 48 小時。回收含有待測藥物的培養液，以 PBS 洗去殘餘培養液後回收 PBS，加入 trypsin-EDTA 於室溫作用 5 分鐘，再用 PBS 將細胞由 12 孔盤沖下，並回收之。將回收的培養液與細胞以 800 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液後再加入 PBS 用同樣條件離心洗去殘餘廢液，移除 PBS 接著加入 70%酒精於-20℃固定一天。隔天，以 800 rpm 離心 5 分鐘後去除酒精，加入 PBS 用同樣條件離心洗去殘餘酒精，移除 PBS 加入 500 ml 含 1% propidium iodide (PI)與 1% RNase 的 PBS，避光 30 分鐘，利用流式細胞儀 (BD Bioscience)分析細胞週期，並用 FlowJo 軟體 (Tree star, Inc.)分析實驗數據。. 5-1、蛋白質萃取與定量將經藥物處理的細胞樣品的培養液移除，加入 PBS 洗去殘餘培養基，再移除 PBS 並加入適量的 RIPA buffer (20 mM Tris-HCL(pH 7.5), 1 mM Na2EDTA, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 g/ml leupeptin)，buffer 完全覆蓋於培養盤後，放入 4℃冰箱內的震盪器 (shaker)搖 15 分鐘。以細胞刮勺 17.

(19) (scraper)刮起已經與 buffer 作用的細胞，再將含有細胞與蛋白的 buffer 放入 1.5 ml 離心管中，於 4℃冰箱中以 13,000 rpm 離心 30 分鐘。取上清液至另一新的 1.5 ml 離心管中，接著做蛋白質定量及相關實驗，最後將之保存於-20℃冰箱。蛋白質定量首先在 96 孔盤中各加入 295 l 的 Coomassie Blue (Bio-Rad protein assay, Coomassie® Brilliant blue G-250 dye, 1:4 二次水稀釋)。以已知濃度的蛋白質牛血清蛋白 (BSA)作為定量的標準品，稀釋濃度依序為 1,000、500、250、125 與 62.5 g/ml，每個濃度加入 4 l 充分混勻，並做兩重複；代測樣品則是加入 1 l 充分混勻，且同樣做兩重複。加完避光反應 10 分鐘，以光電比色計測試樣品在波長 595 nm 下的吸光值。最後以標準品的吸光值做出標準曲線，再進一步換算出樣品的蛋白質濃度。. 5-2、Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE) 配製 12%的 separating gel(2.69 ml ddH2O, 2 ml 1.5M Tris-HCL, 3.2 ml 30% bis-acrylamide, 80 l 10% SDS, 50 l 10% APS, 9 l TEMED)，加至 BIO-RAD 的製膠台中，在其上層加入異丙醇使膠體表層平整。待其完全凝固後，以二次水去除異丙醇並吸乾，接著配製 5%的 stacking gel(1.17 ml ddH2O, 0.5 ml 1.5M Tris-HCL, 333 l 30% 18.

(20) bis-acrylamide, 20 l 10% SDS, 20 l 10% APS, 3 l TEMED)，將其注入 separating gel 上層後插入齒梳，置於室溫讓膠體凝固。之後將膠體組裝於直立式電泳槽，加入電泳緩衝液，再緩慢拔出齒梳，即完成膠體備製。蛋白質樣本的製備，首先將已經定量好的蛋白樣品與 3× sample buffer (350 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12% SDS, 0.02% bromophenol blue, 35% glycerol, 30% -mercaptoethanol)以 2:1 的比例混和均勻，於乾浴槽以 95℃加熱 5 分鐘。逐一將樣品加入膠體的樣品槽中，最後加入標記蛋白 (Infinigen EZColorIITM)標示蛋白分子量。接上電源供應器，電流方向由負極到正極進行電泳，帶負電的蛋白質因分子量大小而有不同的移動速度，藉此分離樣本中的蛋白質。. 5-3、西方墨點法(western blot) 首先準備兩片濾紙以及與膠體大小相似的聚二氟乙烯膜(PVDF)，由負極端依序堆疊海綿、濾紙、經 SDS-PAGE 後的膠體、聚二氟乙烯膜、濾紙、海綿。利用轉漬板夾緊後放入轉漬槽，加入 8 分滿的轉漬緩衝液(blotting buffer)，接上電源供應器以 80 伏特的固定電壓，轉漬 80 分鐘。轉漬完成後以 PBST (含 0.05% Tween-20 的 PBS)搖晃清洗 5 分鐘，再以 blocking buffer (含 5% skim milk 的 PBST)於室溫緩慢搖晃約一小 19.

(21) 時，目的是為了佔據轉漬膜上沒有蛋白的空白區域，避免非專一性鍵結的產生。之後用 PBST 洗去 blocking buffer，接著加入不同稀釋倍率的一級抗體 (primary antibody)，於 4℃冰箱搖晃作用 48 小時。利用 PBST 洗去非專一性的一抗鍵結，加入二級抗體 (secondary antibody) 於室溫作用 2 小時，再以 PBST 清洗數次。在轉漬膜上均勻覆蓋 ECL (Luminal reagent: peroxide solution=1:1)，最後於冷光儀 (LAS4000, Fuji Film)中呈像。. 6、抑制劑 Z-DEVD-FMK 的處理 Z-DEVD-FMK (Merck Millipore)的加入時機為細胞加藥處理前。去除舊的培養液，先會加入含 20 M 抑制劑 Z-DEVD-FMK 的培養液於 37℃培養 24 小時後，移除含 Z-DEVD-FMK 的培養液，以沒有 FBS 的培養液洗去含有抑制劑的殘餘培養液，再以不同濃度的藥物處理 48 小時，之後再進行後續實驗。. 7、細胞傷口癒合分析 (Wound healing assay) 種 1×105 的細胞於 12 孔盤中，待細胞長到九分滿，用 10 l tip 於其上劃出刮痕 (製造傷口)。移除舊的培養液，補上含有低濃度藥物 (分別是 0、0.5、1、2 M)的培養液，進行第一天 (0 小時)的觀察並利用顯微鏡照相機做影像紀錄，紀錄結束後放回培養箱繼續培養。 20.

(22) 後續分別於 24 小時與 48 小時觀察刮痕傷口癒合情形與照相。統計是將每個時間點各濃度取三處刮痕傷口寬度進行計算，藉此評估細胞移動能力。. 8、細胞遷移實驗 (Transwell migration assay) 在 24 孔盤的 transwell (upper chamber, 8 m pore, PET)加入 500 l 有不同濃度藥物 (0、0.5、1、2 M)處理但不含血清的培養液；而於底下的 24 孔盤 (bottom chamber )內加入 700 l 有不同濃度藥物處理且含 10%胎牛血清的培養液。將 1×104 的細胞種於 transwell 中，置於培養箱培養 48 小時後，用棉花棒將 transwell 中沒有通過的細胞移除，再用沾有二次水的棉花棒進行清潔。將 transwell 浸於 100%甲醇 (Methanol)中 3 分鐘，目的是要固定細胞，再將 transwell 浸於 0.1% 結晶紫 (crystal violet)染色 3 分鐘後於二次水退染，有通過 transwell 的細胞會被染成紫色。最後利用 LAS4000 可見光照相，以及顯微鏡相機紀錄影像。此方法可以透過被染色細胞的多寡來評估細胞移動通過 transwell 的能力，將 LAS4000 所拍攝整個 transwell 染色細胞分布透過分析軟體 Multi Gauge V2.1 量化並進行統計。. 9、細胞侵入實驗 (Transwell invasion assay) 先將 Matrigel® Basement Membrane Matrix (corning, product 21.

(23) #354234，以下皆簡稱 matrigel) 置於 4℃待其溶解後，以未含有胎牛血清的培養液稀釋至 10~8 mg/ml。將 20 l matrigel 注入 24 孔盤的 transwell (upper chamber, 8 m pore, PET)中，於 37℃培養箱中放置 30 分鐘使之凝固。將 500 l 有不同濃度藥物 (0、0.5、1、2 M)處理但不含血清的培養液加入有 matrigel 覆蓋的 transwell 中；而在其下的 24 孔盤 (bottom chamber )內加入 700 l 有不同濃度藥物處理且含 15%胎牛血清的培養液。將 1×105 的細胞種於 upper chamber 中，置於 37℃培養箱培養 48 小時。先用棉花棒將 transwell 中的 matrigel 與沒有通過的細胞移除，再用沾有二次水的棉花棒進行清潔。將 transwell 浸於 100% 甲醇 (Methanol)中固定 3 分鐘，再將 transwell 浸入 0.1% 結晶紫 (crystal violet)進行染色，染 5 分鐘後於二次水退染，有通過 transwell 的細胞會被染成紫色。最後用 LAS4000 以及顯微鏡相機紀錄影像，並量化統計之。實驗中 matrigel 作為模擬人體胞外基質的物質，用 15%胎牛血清作為化學引誘因子，誘導細胞穿過 matrigel 進入下層，以此模擬癌細胞侵犯組織的過程，由穿過 matrigel 到達下層的細胞數量的改變，觀察藥物對細胞侵入能力的影響。. 22.

(24) 10、酶譜分析 (zymography) 種 3×105 細胞於 6 公分培養皿，培養 24 小時後移除舊的培養液，加入含有低濃度藥物 (0、0.5、1、2 M)的新鮮培養液，培養 48 小時，收集上清液進行濃縮。樣品是利用有特定孔隙濾膜的 Vivaspin 2 (GE Healthcare, 10 KDa MWCO)來濃縮，將回收的上清液移至 Vivaspin 2 中，以 3,750 ×g 離心 30 分鐘，大分子蛋白與部分培養液無法通過濾膜而留在管內，其他小分子物質與多餘培養液則會通過濾膜，藉此達到濃縮目的。取 25 l 濃縮樣本與 5 l 的 5 倍 sample buffer 混勻後，以 55℃ 加熱 5 分鐘後，放置於冰上 5 分鐘冷卻。將樣品混合液以含有 gelatin 的 SDS-gel(2.69 ml ddH2O, 2 ml 1.5M Tris-HCL, 3.2 ml 30% bis-acrylamide, 80 l 10% SDS, 50 l 10% APS, 9 l TEMED, 200 l 4% gelatin)進行 80 伏特的 SDS-PAGE 兩小時。電泳結束後取出膠體，浸泡於 2.5% triton X-100 搖晃 30 分鐘。並用二次水清洗兩次，每次 10 分鐘。加入 development buffer 於 37℃搖晃作用 24 小時。移除 development buffer，以二次水清洗兩次，每次 10 分鐘。加入 Coomassie brilliant blue 染色 3 小時後，先以二次水清洗多於染劑，再用 1st destain buffer 退染 30 分鐘，最後用 LAS4000 可見光照相。Gelatin 為 MMP-2 與-9 的受質。若 MMP 活性較強，gelatin 被降解較多，就不會被染劑 23.

(25) 染到，而呈現透明的 band；反之，MMP 活性較弱或沒有 MMP 的情況，gelatin 就不會被降解，染劑就能染到 gelatin，而呈現藍色。故可以利用透明 band 的大小來評估 MMP-2 與-9 的酵素活性。. 11、溴化去氧尿苷 (BrdU)細胞增生試驗溴化去氧尿苷 (5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)為胸腺嘧啶的類似物 (thymidine analog)，在 DNA 複製時可以取代 thymidine，併入新合成的 DNA 中，之後用 BrdU 專一性之抗體偵測，透過螢光強度的差異，來判斷細胞增生程度。首先種 5×105 細胞於 ultra low attachment dish 中，培養液為 DMEM/F12 (含有 10 ng/ml FGF、20 ng/ml EGF、 1% B27)，於培養箱培養七天。將培養 7 天的肝癌類幹細胞置於 24 孔盤中，處理不同濃度的藥物 (分別為 0、10、20 與 30 M)，作用 48 小時後，將細胞移至 1.5 ml 微量離心管中，待其自然沉澱後去除含有藥物的上清液，隨後加入 1 ml DMEM/F12 含 1 l 濃度為 10 mg/mL 的 BrdU (最終濃度為 10 g/mL)，在 5% CO2、37℃培養箱反應 24 小時。以 1,000 ×g 離心 5 分鐘，移除上清液，並用 PBS 清洗，在用 1,000 ×g 離心 5 分鐘，重複兩次。接著以 4% paraformaldehyde 固定細胞 24 小時，用 PBS 清洗兩次後，加入 blocking solution (5% H2O2 in methanol)處理 30 分鐘。PBS 沖洗 2 次，加入 BrdU 一級抗體 24.

(26) (GeneTex Inc.)於 4℃冰箱作用 48 小時。用 PBS 清洗 2 次，加入 FITC-conjugated goat anti-rabbit 的二級抗體於 4℃冰箱避光作用 24 小時。以 PBS 沖洗 2 次，最後加入 DAPI 避光作用 10 分鐘後。用 PBS 清洗，重新加入 1 ml PBS 使細胞懸浮後，將細胞懸浮液移至 24 孔盤，以活細胞顯微鏡 (live image, Leica)觀察並照相，以 photoshop 進行影像分析處理。. 12、免疫螢光染色鑑定癌類幹細胞標誌物抗原將培養 7 天的肝癌類幹細胞置於 24 孔盤中，用不同濃度的藥物作用 48 小時 (分別為 0、10、20 與 30 M)。將細胞移至 1.5 ml 微量離心管中以 1,000 ×g 離心 5 分鐘，去除上清液，並用 PBS 清洗兩次，每次以 1,000 ×g 離心 5 分鐘。接著以 4% paraformaldehyde (Sigma) 固定細胞 24 小時，用 PBS 清洗兩次後，加入 5% H2O2 處理 30 分鐘。 PBS 沖洗 2 次，加入癌類幹細胞標誌物抗原 (CD133、NANOG 以及 ALDH1A1)之一級抗體於 4℃冰箱作用 48 小時。用 PBS 清洗 2 次，加入 FITC-conjugated goat anti-rabbit 的二級抗體於 4℃冰箱避光作用一天。以 PBS 沖洗 2 次，最後處理 DAPI 避光 10 分鐘後。用 PBS 清洗，重新加入 1 ml PBS 使細胞懸浮後，將細胞懸浮液移至 24 孔盤，以活細胞顯微鏡觀察並照相，並以 photoshop 進行影像分析處理。 25.

(27) 13、動物模式實驗所使用的小鼠為三周大之雌性裸鼠，品系為 BALB/c，訂購自國家實驗研究院國家實驗動物中心。實驗動物飼養於國立臺灣師範大學生命科學系實驗動物中心，飼養環境控制光照 12 小時，黑暗 12 小時，鼠籠配置有獨立抽風設備 (individually-ventilated cages, IVC)，實驗動物可自由取食與飲水。一切實驗流程按照實驗動物照護及使用委員會之規範進行。將 Matrigel 稀釋 5 倍後與 6×106 的 Huh7 細胞以 1:1 的比例混和，透過皮下注射將細胞打進實驗動物的腿部外側。細胞注射後，可觀察到實驗動物腿部開始有腫瘤生長，在第 11 天開始給予藥物處理。藥物處理方式亦是透過皮下注射的方式，將 PBS (控制組)或 teroxirone (分別為低濃度 0.9 mg/kg 與高濃度 1.8 mg/kg)打在腫瘤組織附近。總共打藥 4 次，每次給藥時會先測量實驗動物體重與腫瘤直徑，利用公式. (短邊直徑)2 ×(長邊直徑) 2. 換算出腫瘤體積。最後一次藥物處理結束後會. 再觀察 6 天，期間亦會測量實驗動物體重變化與腫瘤大小。最後以乙醚將動物犧牲並取出腫瘤做進一步分析。測量取下腫瘤組織的重量並以相機紀錄影像後，將腫瘤組織保存於-80℃冰箱，待其後組織切片或蛋白質萃取時，再退冰進行實驗。. 26.

(28) 14-1、冷凍切片取出保存於-80℃之腫瘤組織，使其在冰上回溫。切適量大小的腫瘤組織浸泡於 4% 新鮮現配的甲醛 (formaldehyde)，置於 4℃冰箱一天，達到組織固定的目的。將固定好的組織置入蔗糖緩衝液中，並逐次調高緩衝液濃度 (10%、20%與 30%)，避免組織在低溫時產生冰晶。將準備好的腫瘤組織於冷凍切片機 (Cryostat for Frozen Section, LEICA)中以冷凍劑 (O.C.T.)包覆，待冷凍劑凝固後，即可開始將組織切成厚度為 10 m 之切片，取下切片浸於含有 5 %FBS 的 PBS 中，放在 4℃冰箱一晚，即完成免疫螢光染色之事前準備。. 14-2、免疫螢光染色將組織切片取出後放置於 1.5 ml 離心管以 PBS 清洗兩次，加入細胞增生细胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)之一級抗體於 4℃作用 48 小時。用 PBS 清洗 2 次，加入二級抗體 FITC-conjugated goat anti-rabbit 於 4℃冰箱避光作用 24 小時。以 PBS 沖洗 2 次，最後處理 DAPI 避光 10 分鐘後。用 PBS 清洗，以尖頭毛筆挑起組織切片，擺放於載玻片上並封片之。玻片於共軛焦顯微鏡 (ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope)下觀察並紀錄影像，並以 ZEN (blue edition) 2.3 進行影像分析處理。 27.

(29) 14-3、Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) assay 將組織切片置於 24 孔盤中，加入 4%甲醛固定細胞 24 小時，移除甲醛後加入 PBS 清洗兩次，加入新鮮現配的 Permeabilisation solution (0.1% triton X-100 in 0.1% sodium citrate)於冰上作用 10 分鐘。以 PBS 清洗 2 次後，加入 TUNEL 試劑組 (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche, Inc.)中 Enzyme solution 與 Label solution (1:9)混和液 30 l，置於 37℃培養箱中避光作用 90 分鐘。移除混合液後用 PBS 清洗 2 次，加入 30l 的 Converter-POD 一樣於 37℃避光作用 90 分鐘。以 PBS 清洗 2 次，加入 DAPI 避光作用 10 分鐘後，用 PBS 清洗，以毛筆挑起組織切片，擺放於載玻片上並封片之。玻片於共軛焦顯微鏡 (ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope)下觀察並紀錄影像，並以 ZEN (blue edition) 2.3 進行影像分析處理。. 15、蘇木素-伊紅染色（hematoxylin and eosin stain, H&E stain）將存於-80℃的腫瘤組織於冰上回溫，切取適量大小的腫瘤組織浸泡在 4% 甲醛 (paraformaldehyde)後，置於 4℃冰箱，達到組織固定的目的。後續石蠟包埋、切片與染色委由保吉生化學股份有限公司 (BIO-CHECK LABORATORIES LTD.)處理。玻片於共軛焦顯微鏡 28.

(30) (Leica TCS Sp2 confocal spectral microscope)下觀察並紀錄影像。. 29.

(31) 陸、結果 1、Z-DEVD-FMK 處理能降低 teroxirone 抑制 Huh7 細胞生長之效果且下調外源性細胞凋亡相關基因表現利用 MTT assay 檢測 teroxirone 對三株常見肝癌細胞株 Hep3B、 HepG2 與 Huh7 之影響 (圖一 A)，在較低濃度藥物處理僅 Huh7 細胞生長會受到明顯抑制。由西方墨點法結果顯示 (圖一 B)， extrinsic apoptosis pathway 相關蛋白則隨加藥時間延長或濃度上升而上升，訊息傳遞上游的 Fas-associated protein with death domain (FADD)、caspase-8 與 caspase-6 隨加藥濃度上升，表現量上升，到最高濃度時因為已處於凋亡晚期，所以表現量開始下降；下游的 caspase-3 與 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)則有隨著加藥時間或濃度上升而有表現量上升的趨勢，證明 teroxirone 會誘發 Huh7 細胞產生外源性細胞凋亡。 Caspase-3 為細胞凋亡相關蛋白，藉由 caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-FMK 前處理對於 teroxirone 所造成的細胞凋亡與其抑制增生效果是否會影響，就可以間接證明 teroxirone 所誘發的細胞凋亡是否與其抑制增生有關連性，以及確定其細胞凋亡是否透過外源式途徑。比較有無抑制劑 Z-DEVD-FMK 處理的 MTT 結果 (圖二)。發現相同藥物濃度處理下有抑制劑前處理的存活率較高，且 30.

(32) 在高於 IC50 的濃度兩者有顯著差異，表示抑制 caspase-3 能降低細胞因為藥物作用所導致死亡。由流式細胞儀分析 Huh7 細胞在有無 Z-DEVD-FMK 前處理下細胞週期的差異 (圖三)。在 5 M 藥物處理下，有抑制劑前處理的細胞在象徵細胞凋亡的 sub-G1 較沒有抑制劑處理的細胞有顯著下降，而有抑制劑處理的細胞在 G2/M 的比例則較沒有抑制劑處理的細胞高，但未達顯著差異。表示抑制劑 Z-DEVD-FMK 處理確實會抑制 teroxirone 所引發的細胞凋亡，並讓細胞出現 G2/M arrest 的現象。由上述 MTT 與細胞週期分析證明 teroxirone 是因為誘發 Huh7 產生細胞凋亡，才使得細胞存活率下降。由西方墨點法結果 (圖四)，可以發現外源性細胞凋亡相關蛋白有因為抑制劑 Z-DEVD-FMK 的處理而改變。由上游 FADD 可以看出有加抑制劑 Z-DEVD-FMK 的凋亡進程較緩慢，藥物處理 48 小時後，上游的 FADD 仍隨著藥物處理濃度上升而有增加的趨勢；而沒抑制劑作用細胞於最高濃度藥物處理後已於細胞凋亡晚期，故訊息傳遞上游的 FADD 會開始下降。未處理抑制劑組的 caspase-8 與-6 也與 FADD 有相似趨勢，隨加藥濃度上升表現量上升，到最高濃度因已處於細胞凋亡晚期，故表現量下降；最下游的 caspase-3 與 PARP 則隨加藥濃度上升。而在有加抑制劑的組別， 31.

(33) FADD 下游 caspase-8,-6,-3 與 PARP 都要到最高濃度藥物作用才看到有活性的蛋白表現。由此可看出抑制劑 Z-DEVD-FMK 前處理能降低細胞凋亡程度，上述結果可以間接證明 teroxirone 所誘發的細胞凋亡是透過外源式途徑。. 2、低濃度的 teroxirone 能抑制 Huh7 細胞遷移並降低癌細胞轉移相關基因表現由細胞傷口癒合分析 (Wound healing assay)結果 (圖五 A)，細胞在低於 IC50 的藥物濃度 ( 0.5, 1 及 2 M)作用下，經過 24 小時各濃度細胞刮痕傷口邊界(藍色指標)與細胞傷口癒合邊界(紅色指標)比較，可以看出來細胞刮痕傷口隨加藥濃度上升，傷口癒合程度越不明顯；在 48 小時未加藥的控制組已有部分區域的細胞刮痕傷口快要完全癒合，而有加藥的組別，與低濃度 teroxirone 處理的細胞傷口寬度比較，高濃度藥物處理下細胞刮痕傷口較寬。由統計結果 (圖五 B)顯示 24 小時最高濃度 (2 M)細胞傷口刮痕寬度較未加藥有顯著差異；48 小時 1 M 藥物處理就達顯著差異。反觀 Hep3B 以最高濃度 teroxirone (2 M)處理 (圖五 C)，細胞刮痕傷口仍有明顯癒合現象，表示加藥後不影響細胞遷移，統計結果顯示 Hep3B 與控制組之間無顯著差異，為負控制組。 32.

(34) Huh7 細胞遷移實驗 (transwell migration assay)結果 (圖六 A)，可看出未加藥的控制組，通過 transwell 的細胞明顯較有加藥的組別來的多，而顯微鏡下觀察亦可發現，藥物處理濃度越高，細胞通過 transwell 的數目越少。統計結果顯示隨加藥濃度上升，細胞通過的 transwell 的比例有明顯下降，在 0.5 M 就達到顯著差異。另外 HepG2 加藥 teroxirone 處理的負控制組 (圖六 B)，細胞沒有因為有藥物處理而抑制細胞通過 transwell，統計結果顯示有無藥物處理並無顯著差異。上述實驗結果 (圖五與圖六)，抑制細胞癒合達傷口寬度的一半的濃度與抑制細胞通過 transwell 達 50%的濃度皆在 0.5 M 與 1 M 間，表示 teroxirone 在低濃度就有很好抑制細胞遷移的能力。以細胞侵入實驗 (transwell invasion assay)觀察 Huh7 細胞侵入能力是否受到藥物影響，結果顯示 (圖七 A)不論是 LAS4000 影像紀錄還是顯微鏡下的細胞數量，隨加藥濃度越高，細胞穿越 matrigel 通過 transwell 的比例越低，統計結果在最低濃度的藥物處理下 (0.5 M)，細胞穿越 matrigel 到達下層的數量較控制組達到顯著差異。相較 HepG2 結果 (圖七 B)，在藥物處理後細胞侵入能力不受影響，統計結果加藥組與控制組亦無顯著差異，為負控制組。. 33.

(35) MMP-2 與-9 為重要的癌細胞轉移指標，透過酶譜分析 (zymography)可以看加藥後 MMP-2 與-9 的活性是否有改變 (圖八)，上面的條帶為 MMP-9 分子量為 92 KDa；下面的條帶為 MMP-2 分子量為 62 KDa。由結果 (圖八 A)可以看出 teroxirone 會抑制 Huh7 細胞 MMP-2 與-9 之活性，使得 gelatin 被水解的量變少，導致 MMP-9 與-2 的條帶有隨 teroxirone 濃度上升而下降，統計結果 0.5 M 與控制組間已達到顯著差異；而 HepG2 的結果 (圖八 B)， MMP-2 與-9 皆未因藥物處理而有上升或下降的趨勢，為負控制組。另外藉由西方墨點法(圖九)，可以直接看出 MMP-2 與-9 的蛋白質量有隨 teroxirone 藥物濃度增加而有下降的趨勢。與血管新生相關的 VEGF 也同樣有下降趨勢。反觀負控制組 HepG2 細胞則沒有因為 teroxirone 處理而有下降趨勢。這些結果都說明低濃度的 teroxirone 對於抑制癌細胞轉移有很好的效果。. 3、Teroxirone 抑制 Huh7 肝癌類幹細胞之增生與幹細胞標誌物透過 BrdU staining assay 之螢光強度，來判斷細胞增生程度。螢光強度越強，表示細胞有頻繁的增生，使 BrdU 可大量嵌入新合成的 DNA 中；反之亦然 (圖十 A)。由結果可看出隨加藥濃度上升， Huh7 肝癌類幹細胞的大小有明顯變小，BrdU 螢光強度亦有明顯 34.

(36) 下降。證明 teroxirone 處理後，會抑制 Huh7 肝癌類幹細胞增生，導致 BrdU 併入新合成 DNA 的量變少。利用免疫螢光染色觀察藥物處理後 Huh7 肝癌幹細胞之幹細胞標誌物的螢光變化 (圖十 B、C 與 D)。幹細胞表面標誌物 CD133 在藥物處理下，Huh7 肝癌幹細胞螢光強度有明顯降低的趨勢，且隨加藥濃度越高螢光強度越弱 (圖十 B)，對照西方墨點法的結果 (圖十一)，亦可看出藥濃度上升，CD133 蛋白質表現量隨之下降，最高濃度處理下，CD133 蛋白質量下降至約 70%。Huh7 肝癌幹細胞之幹細胞標誌物 ALDH1A1 也是隨著藥物處理濃度提高，螢光強度越弱 (圖十 C)，螢光染色結果亦與西方墨點法之結果一致 (圖十一)，藥物處理後 ALDH1A1 的蛋白表現量出現下降趨勢。最後一個幹細胞標誌物 NANOG 免疫螢光染色結果 (圖十 D)與上述 CD133、ALDH1A 之結果相似，在 30 M 的 teroxirone 處理後， Huh7 肝癌類幹細胞 NANOG 螢光強度跟 control 相比有明顯下降趨勢，比對西方墨點法結果 (圖十一)，最高濃度 30 M 的 teroxirone 處理後，NANOG 蛋白表現量下降高達約 50%。實驗證明 teroxirone 處理具有抑制 Huh7 肝癌幹細胞的細胞標誌物 CD133、ALDH1A1 與 NANOG 的能力。. 35.

(37) 4、Teroxirone 抑制 Huh7 細胞於裸鼠形成之腫瘤生長由實驗期間測量腫瘤體積的統計結果 (圖十二 A)，沒有藥物處理 (圖示為圓形中空)的腫瘤大小有逐漸變大的趨勢，且在開始打藥後 20 天觀察到腫瘤變大的幅度加劇；低濃度藥物處理 (0.9 mg/kg，圖示為三角形中空)腫瘤大小雖仍在變大，但整體看來程度較控制組輕微，且沒有變大幅度急劇變化的狀況；高濃度藥物處理 (1.8 mg/kg，圖示為方形中空)腫瘤大小變化幅度最輕微，表示在活體中，teroxirone 有很好抑制腫瘤生長的效果。實驗期間觀察裸鼠體重結果 (圖十二 B)，裸鼠體重並沒有因為藥物處理以及藥物濃度而受影響。裸鼠犧牲後取下腿部的腫瘤觀察 (圖十二 C)，可以發現 Huh7 異體移植的腫瘤顏色為深紅偏黑，且在濃度為 1.8 mg/kg 的 teroxirone 處理下，腫瘤的大小有明顯的變小，腫瘤重量也有明顯減輕 (圖十二 D)。腫瘤組織切片以 PCNA 為一抗進行免疫螢光染色，於共軛焦顯微鏡下觀察 (圖十三)，在沒有藥物處理的控制組，多數細胞的細胞核之位置，都有偵測到 PCNA 的綠色螢光，表示多數細胞處於細胞增生的狀態；反觀有加藥的實驗組，代表 PCNA 的綠色螢光與控制組相比，有明顯下降，且隨加藥濃度上升，下降的幅度越大，證明 teroxirone 的確具有抑制癌細胞生長的效果。由 H&E 染色結果 (圖十四)可以發現，經過藥物處理的 36.

(38) 組織切片與控制組相比，細胞排列較為鬆散。並可以透過觀察細胞型態發現，部分細胞開始凋亡，出現細胞凋亡的細胞特徵 (圖十四黑色箭頭所指出之細胞)，這些特徵包括：細胞開始皺縮，使之脫離周圍細胞、細胞核變成類似新月狀緊貼於細胞膜、部分細胞核開始裂解成數個小核等。進一步利用 TUNEL 分析腫瘤組織切片中是否有產生細胞凋亡 (圖十五)，未加藥的控制組，細胞核皆未偵測到 TUNEL 的綠色螢光；而有藥物處理的實驗組，部分細胞有偵測到 TUNEL 的綠色螢光，且隨藥物處理濃度上升，有綠色螢光強度越強，表示 teroxirone 會使癌細胞產生細胞凋亡。最後，初步的西方墨點法結果 (圖十六)顯示，執行細胞凋亡反應的 caspase-3 在低濃度 0.9 mg/kg 藥物濃度處理下有上升趨勢；其下游 PARP 在有加藥的組別中亦被水解成 89 KDa 的片段，teroxirone 處理後細胞凋亡相關蛋白開始表現，再次證明 teroxirone 確實會使癌細胞產生細胞凋亡。. 37.

(39) 柒、討論肝癌為國人常見的癌症死因之一 [2]，且近年來全球肝癌發生率有所增加，但肝癌患者卻沒有受到更好的病情控制 [40]。肝癌初期主要的治療方式，包括手術切除與肝臟移植；若不能手術切除則常採用局部區域治療與化療等方式處理，但這往往都有很差的預後 [3]。因此本研究探討新興三環藥物 teroxirone 對於肝癌細胞生長機制的影響。過去已有文獻指出 teroxirone 具有抑制非小型肺癌細胞株生長的效果 [12]，而實驗室也根據 MTT 與西方墨點法之結果(圖一 A 與 B)，初步證實 teroxirone 能抑制肝癌細胞株 Huh7 增生，並誘導產生外源性細胞凋亡途徑。本篇利用 caspase-3 的抑制劑 Z-DEVD-FMK 前處理後，透過 MTT、細胞流式儀與西方墨點法來驗證 teroxirone 對於 Huh7 細胞的影響。選用 Z-DEVD-FMK 是因為有文獻指出，該抑制劑不僅僅對 caspase-3 有抑制效果，對其上游 caspase-8 亦有抑制效果 [30,41]，故適用於本篇探討外源性細胞凋亡途徑。MTT 的結果證明 Z-DEVD-FMK 前處理後，能回復細胞存活率 (圖二)，表示 teroxirone 對 Huh7 細胞造成的細胞存活率下降與細胞凋亡有直接關係。流式細胞儀分析細胞各週期分布，也發現 10 M 的 teroxirone 處理前若有 38.

(40) Z-DEVD-FMK 前處理，與細胞凋亡相關的 sub-G1 有顯著下降，而 G2/M 週期細胞比例有上升 (圖三)，證實抑制劑的確有發揮作用，抑制 Huh7 細胞因為 teroxirone 所導致的細胞凋亡，並且使 Huh7 細胞出現 G2/M arrest 的現象。此外，由 MTT 與細胞流式儀分析的控制組可以發現，經過 Z-DEVD-FMK 處理後並不會影響細胞存活與改變細胞週期。利用西方墨點法分析與外源性細胞凋亡相關蛋白，有抑制劑處理的組別蛋白表現量都明顯下降，除了最上游的 FADD，因為 Z-DEVD-FMK 主要是抑制其下游的 caspase-8 與 -3，故最上游的 FADD 仍維持上升趨勢。抑制劑會影響整個細胞凋亡進程，使得 FADD 蛋白表現量不像沒有抑制劑處理時在最高濃度時有下降趨勢，而是維持上升。在沒有抑制劑處理時，外源性細胞凋亡途徑上游的 FADD、caspase-8 與 -6 在最高濃度時都有下降的趨勢，過去也有文獻有相似情況 [42,43]，可能原因是細胞凋亡反應已經進入後期，才會導致上游的表現量開始下降。肝癌預後較差主要原因在於肝癌細胞對侵入血管與轉移有高度潛能，因此可以控制肝癌轉移復發對於發展肝癌治療藥物至關重要 [44]。本篇觀察低濃度 teroxirone 是否會抑制 Huh7 細胞之遷移與侵入。實驗中 teroxirone 用低於 IC50 的濃度是為了避免實驗 39.

(41) 進行過程中，細胞因為細胞凋亡導致誤判細胞遷移與侵入。實驗先用細胞傷口癒合分析 (wound healing assay)來檢測低濃度 teroxirone 處理下，是否會影響 Huh7 細胞的遷移能力。因為進行細胞傷口癒合實驗時，並沒有額外加入細胞增生的抑制劑，只有降低細胞培養時的血清含量，藉此達到抑制細胞生長的目的。然而 HepG2 因細胞特性的關係，細胞傾向聚集堆疊，不適合用於細胞傷口癒合分析之負控制組，故此實驗選用 Hep3B 作為負控制組。由細胞傷口癒合分析發現不論在 24 小時還是 48 小時都能觀察到細胞傷口癒合能力隨 teroxirone 處理濃度越增加而有明顯下降 (圖五)。除此之外，還做了細胞遷移實驗 (transwell migration assay)來驗證細胞癒合分析的實驗結果，實驗結果亦為加藥濃度越高，細胞移動過 transwell 的能力降低 (圖六)。上述兩個實驗的統計結果可以看出，抑制細胞癒合達傷口寬度的一半 (48 小時)的濃度與抑制細胞通過 transwell 達 50%的濃度皆在 0.5 M 與 1 M 間，表示 teroxirone 在低濃度就有很好抑制細胞遷移的能力。進一步使用 matrigel 覆蓋 transwell 進行細胞侵入實驗 (transwell invasion assay)，matrigel 扮演細胞外基質 (ECM)的角色，而癌細胞會釋出 MMP-2 與 MMP-9 兩種基質金屬蛋白酶來降解 ECM，藉此達到侵入組織的目的。結果顯示經濃度低於 IC50 之 teroxirone 處理後，Huh7 40.

(42) 細胞穿越 matrigel 侵入下層的細胞數明顯降低 (圖七)。表示低濃度的 teroxirone 處理就可以抑制 Huh7 細胞的侵入能力。 MMP-2 與-9 分別為 gelatinase A 與 gelatinase B，同屬於Ⅳ型膠原酶。MMP-2 與-9 是細胞降解 ECM 的主要酵素，且癌症患者體內 MMP-2 與-9 的蛋白濃度遠高於正常細胞 [7]，故可以視為癌症轉移的重要指標。使用 gelatin zymography 來分析低濃度的 teroxirone 是否會影響 MMP-2 與-9 的活性。因為 MMP-2 與-9 會被細胞釋出至胞外，水解 ECM，故實驗是收集細胞的培養液進行分析。為了提高培養液內蛋白質的濃度，會利用 Vivaspin 2 透過離心的方式，去除多餘液體，由於濃縮管透析膜是 10 KDa MWCO 故小於 30 KDa 的蛋白也會被去除，藉此達到濃縮蛋白的目的。實驗結果顯示，經過低濃度 teroxirone 處理，Huh7 細胞 MMP-2 與-9 活性會受到抑制，且其活性隨藥物處理濃度上升而降低 (圖八)。新增的血管不僅提供不斷增生的腫瘤所需的營養，同時也為腫瘤的播散和轉移提供潛在路線。故血管新生是維持癌細胞生長與促進轉移的一個不可或缺的角色 [15]。血管內皮生長因子 (VEGF)在胚胎時期血管生成扮演重要角色，同時也與腫瘤，眼內新血管疾病和其他病症相關的病理性血管新生息息相關。以西方墨點法分析低濃度 teroxirone 處理下 MMP-2、MMP-9 與 VEGF 之變化，發現三者表現 41.

(43) 量皆有隨加藥濃度增加而有下降趨勢 (圖九)。由西方墨點法與酶譜分析結果可看出 teroxirone 對於 MMP-9 的影響較對 MMP-2 的影響更為顯著。過去研究指出癌症的高轉移風險與癌症幹細胞有著密不可分的關係 [36]，癌症幹細胞有轉型分化 (trans-differentiate)的能力，能分化成與原生腫瘤細胞完全不同的細胞型態，故癌症幹細胞有能力轉型分化成血管內皮細胞 (vascular endothelial cells)，以利腫瘤生長與轉移 [45]，故本篇論文亦探討 teroxirone 對 Huh7 肝癌類幹細胞之增生與幹細胞表面標誌物的影響。實驗使用的 Huh7 肝癌類幹細胞是將貼附型細胞在特殊培養環境下培養出來的 tumor sphere，並透過免疫螢光染色 (圖十)與西方墨點法 (圖十一)來證明這些球狀細胞的確有表現幹細胞表面標誌物，且這些標誌物在 tumor sphere 的蛋白量明顯高於貼附型細胞，間接證明 tumor sphere 較貼附性細胞有更強的幹細胞特性。免疫螢光染色結果發現 teroxirone 處理後 Huh7 肝癌幹細胞增生受到抑制，且幹細胞標誌物 CD133、ALDH1A1、NANOG 螢光強度與蛋白質皆有下降。其中 CD133 透過調控 c-myc 等基因的表現，進而控制腫瘤形成 (tumorigenicity)、形成癌幹細胞型態(sphere formation)與抗藥性 [46]； ALDH1A1 則是參與 retinoic acid 之代謝反應，在成熟幹細胞中能促 42.

(44) 使其分化，而在未成熟幹細胞則有相反作用，會增強幹細胞之自我再生 [47]；NANOG 則與 Oct4 來調控幹細胞之多能性和自我更新 [48]。動物實驗則進一步驗證了 teroxirone 對於 HCC 的治療潛力，藥物處理後並不會使實驗動物的體重產生明顯的變化 (圖十二 B)，間接證明 teroxirone 不會對一般細胞造成毒性。取下的腫瘤顏色深紅偏黑 (圖十二 C)，與文獻中異體移植 Huh7 腫瘤外觀一致 [49]，可以應證腫瘤是由 Huh7 細胞發展而來。增生細胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 在細胞核內合成，並存在於細胞核內，其功能為 DNA 聚合酵素 delta (DNA polymerase-δ)和 epsilon 的輔助蛋白，當靜止細胞受生長因子刺激進入細胞週期時，增生細胞核抗原 mRNA 的層級會上升，並於 G1/S 期間達到最高點。PCNA 除了參與 DNA 合成，也被證實參與在核酸切除修復 (nucleotide excision repair)之 DNA 修復機制中 [50-52]。故由腫瘤體積、重量與 PCNA 螢光染色結果 (圖十二與十三)，皆顯示 teroxirone 能有效抑制腫瘤組織中癌細胞之增生。當細胞走向細胞凋亡時，其形態會有所改變，包括細胞膜突起 (plasma membrane ruffling)、細胞剝離 (cell detachment)、細胞萎縮 (cell shrinkage)、染色質凝聚 (nuclear condensation)，伴隨核酸內切酶 43.

(45) 作用，使 DNA 斷裂成 180 bp~200 bp 大小的片段 (DNA fragmentation)、細胞膜內陷將細胞分割成數個有膜包覆的凋亡小體 [53,54]。透過 H&E 染色結果 (圖十四)，可以在有加藥的組別中看到各種細胞凋亡的細胞型態，包括細胞開始皺縮，使之脫離周圍細胞、細胞核變成類似新月狀緊貼於細胞膜、部分細胞核開始裂解成數個小核。TUNEL 則是透過末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)催化，將有標定的 dUTP 接上 DNA 片段化所產生之 3’-OH，再與帶有螢光標定的抗體結合，從而可透過螢光顯微鏡觀察螢光分布 [55]。TUNEL 染色結果 (圖十五)可以發現藥物處理開始有細胞可以偵測到綠色螢光，且隨濃度上升，綠色螢光強度越強，表示 teroxirone 會使 DNA 片段化產生，意即 teroxirone 會使腫瘤組織中細胞產生細胞凋亡。而 DNA 片段化發生在細胞核內，故圖十五中綠色螢光皆出現在細胞核內。總結，抑制劑 Z-DEVD-FMK 處理可以回復 teroxirone 所造成的 Huh7 細胞存活率下降，證明 Huh7 細胞存活率下降與細胞凋亡有關。此外 Z-DEVD-FMK 處理會降低 Huh7 細胞對 teroxirone 所產生 sub-G1 週期細胞比例，且外源性細胞凋亡相關蛋白也受到抑制，證實抑制劑的確有抑制細胞凋亡反應，且 teroxirone 所誘導的細胞凋亡是經由外源性途徑。另外低濃度 teroxirone 處理能有效抑制 Huh7 細胞遷移與 44.

(46) 侵入能力，並抑制 MMP-2 與-9 活性和表現量，亦會影響血管新生相關因子 VEGF。在 Huh7 肝癌類幹細胞中，teroxirone 可以抑制其增生與幹細胞表面標誌物之表現，以及藥物有能力抑制異體移植腫瘤之生長，並使其產生細胞凋亡。綜合以上結果 teroxirone 在未來肝癌治療具有極大潛力。. 45.

(47) 捌、參考文獻 1. Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, et al. (2015) Global cancer statistics, 2012. Ca-A Cancer Journal for Clinicians 65: 87-108.. 2. Fan JY, Huang TJ, Jane SW, Chen MY (2015) Prevention of Liver Cancer Through the Early Detection of Risk-related Behavior Among Hepatitis B or C Carriers. Cancer Nursing 2014/05/20 ed. pp. 169-176.. 3. Gopalan B, Narayanan K, Ke Z, Lu T, Zhang Y, et al. (2014) Therapeutic effect of a multi-targeted imidazolium compound in hepatocellular carcinoma. Biomaterials 35: 7479-7487.. 4. Mokdad AA, Singal AG, Yopp AC (2015) JAMA PATIENT PAGE. Liver Cancer. Jama 314: 2701.. 5. Lee DC, Kang YK, Kim WH, Jang YJ, Kim DJ, et al. (2008) Functional and clinical evidence for NDRG2 as a candidate suppressor of liver cancer metastasis. Cancer Research 68: 4210-4220.. 6. Truant S, Sequier C, Leteurtre E, Boleslawski E, Elamrani M, et al. 46.

(48) (2015) Tumour biology of colorectal liver metastasis is a more important factor in survival than surgical margin clearance in the era of modern chemotherapy regimens. The Official Journal of the International Hepato Pancreato Biliary Association 17: 176-184.. 7. Deryugina EI, Quigley JP (2006) Matrix metalloproteinases and tumor metastasis. Cancer and Metastasis Reviews 25: 9-34.. 8. Papetti M, Herman IM (2002) Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis. American Journal of Physiology: Cell Physiology 282: C947-970.. 9. Zetter BR (1998) Angiogenesis and tumor metastasis. Annual Review of Medicine 49: 407-424.. 10. Wu H, Zhao W, Liu S, Zheng J, Ji G, et al. (2015) Pure transcatheter arterial chemoembolization therapy for intrahepatic tumors causes a shrink in pulmonary metastases of hepatocellular carcinoma. International Journal of Clinical and Experimental Medicine 8: 1035-1042.. 11. Tang ZY (2001) Hepatocellular carcinoma--cause, treatment and metastasis. World Journal of Gastroenterology 7: 445-454.. 47.

(49) 12. Yakkundi A, Bennett R, Hernandez-Negrete I, Delalande JM, Hanna M, et al. (2015) FKBPL is a critical antiangiogenic regulator of developmental and pathological angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 35: 845-854.. 13. Folkman J, Kalluri R (2004) Cancer without disease. Nature 427: 787.. 14. Saharinen P, Eklund L, Pulkki K, Bono P, Alitalo K (2011) VEGF and angiopoietin signaling in tumor angiogenesis and metastasis. Trends in Molecular Medicine 17: 347-362.. 15. Zheng H, Takahashi H, Murai Y, Cui Z, Nomoto K, et al. (2006) Expressions of MMP-2, MMP-9 and VEGF are closely linked to growth, invasion, metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma. Anticancer Research 26: 3579-3583.. 16. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J (2003) The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine 9: 669-676.. 17. Adams RH, Alitalo K (2007) Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology 8: 464-478.. 48.

(50) 18. Maatta M, Soini Y, Liakka A, Autio-Harmainen H (2000) Differential expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, and membrane type 1-MMP in hepatocellular and pancreatic adenocarcinoma: implications for tumor progression and clinical prognosis. Clinical Cancer Research 6: 2726-2734.. 19. Chetty C, Lakka SS, Bhoopathi P, Rao JS (2010) MMP-2 alters VEGF expression via alphaVbeta3 integrin-mediated PI3K/AKT signaling in A549 lung cancer cells. International Journal of Cancer 127: 1081-1095.. 20. Shamon LA, Pezzuto JM, Graves JM, Mehta RR, Wangcharoentrakul S, et al. (1997) Evaluation of the mutagenic, cytotoxic, and antitumor potential of triptolide, a highly oxygenated diterpene isolated from Tripterygium wilfordii. Cancer Letters 112: 113-117.. 21. Ames MM, Kovach JS, Rubin J (1984) Pharmacological characterization of teroxirone, a triepoxide antitumor agent, in rats, rabbits, and humans. Cancer Research 44: 4151-4156.. 22. Neidhart JA, Derocher D, Grever MR, Kraut EH, Malspeis L (1984) Phase I trial of teroxirone. Cancer Treatment Reports 68: 1115-1119.. 49.

(51) 23. Atassi G, Spreafico F, Dumont P, Nayer P, Klastersky J (1980) Antitumoral effect in mice of a new triepoxyde derivative: 1, 3, 5-triglycidyl-s-triazinetrione (NSC 296934). European Journal of Cancer 16: 1561-1567.. 24. Wang JP, Lin KH, Liu CY, Yu YC, Wu PT, et al. (2013) Teroxirone inhibited growth of human non-small cell lung cancer cells by activating p53. Toxicology and Applied Pharmacology 273: 110-120.. 25. Elmore S (2007) Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology 35: 495-516.. 26. Zhao X, Liu X, Su L (2014) Parthenolide induces apoptosis via TNFRSF10B and PMAIP1 pathways in human lung cancer cells. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 33: 3.. 27. DiPietrantonio AM, Hsieh T, Wu JM (1999) Activation of caspase 3 in HL-60 cells exposed to hydrogen peroxide. Biochemical and Biophysical Research Communications 255: 477-482.. 28. Hara H, Friedlander RM, Gagliardini V, Ayata C, Fink K, et al. (1997) Inhibition of interleukin 1beta converting enzyme family proteases reduces ischemic and excitotoxic neuronal damage. Proceedings of 50.

(52) the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 2007-2012.. 29. Nicholson DW, Ali A, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Ding CK, et al. (1995) Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 376: 37-43.. 30. Longthorne VL, Williams GT (1997) Caspase activity is required for commitment to Fas-mediated apoptosis. EMBO Journal 16: 3805-3812.. 31. Boldin MP, Goncharov TM, Goltsev YV, Wallach D (1996) Involvement of MACH, a novel MORT1/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptor-induced cell death. Cell 85: 803-815.. 32. Knoblich JA (2008) Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell 132: 583-597.. 33. Bishop AE, Buttery LD, Polak JM (2002) Embryonic stem cells. The Journal of Pathology 197: 424-429.. 34. Yu Z, Pestell TG, Lisanti MP, Pestell RG (2012) Cancer stem cells. 51.

(53) International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44: 2144-2151.. 35. Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, et al. (1994) A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367: 645-648.. 36. Li F, Tiede B, Massague J, Kang Y (2007) Beyond tumorigenesis: cancer stem cells in metastasis. Cell Research 17: 3-14.. 37. Dean M, Fojo T, Bates S (2005) Tumour stem cells and drug resistance. Nature Reviews Cancer 5: 275-284.. 38. Nakabayashi H, Taketa K, Miyano K, Yamane T, Sato J (1982) Growth of human hepatoma cells lines with differentiated functions in chemically defined medium. Cell Research 42: 3858-3863.. 39. Knowles BB, Howe CC, Aden DP (1980) Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science 209: 497-499.. 40. Han MS, Barrett T, Brehm MA, Davis RJ (2016) Inflammation Mediated by JNK in Myeloid Cells Promotes the Development of 52.

(54) Hepatitis and Hepatocellular Carcinoma. Cell Reports 15: 19-26.. 41. Muzio M, Stockwell BR, Stennicke HR, Salvesen GS, Dixit VM (1998) An induced proximity model for caspase-8 activation. Journal of Biological Chemistry 273: 2926-2930.. 42. LaVallee TM, Zhan XH, Johnson MS, Herbstritt CJ, Swartz G, et al. (2003) 2-methoxyestradiol up-regulates death receptor 5 and induces apoptosis through activation of the extrinsic pathway. Cancer Research 63: 468-475.. 43. Elrod HA, Lin YD, Yue P, Wang X, Lonial S, et al. (2007) The alkylphospholipid perifosine induces apoptosis of human lung cancer cells requiring inhibition of Akt and activation of the extrinsic apoptotic pathway. Molecular Cancer Therapeutics 6: 2029-2038.. 44. Li Q, Liu Z, Xu M, Xue Y, Yao B, et al. (2016) PCAF inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by inhibition of epithelial-mesenchymal transition by targeting Gli-1. Cancer Letters 375: 190-198.. 45. Xu LB, Liu C (2014) Role of liver stem cells in hepatocarcinogenesis. World journal of stem cells 6: 579-590. 53.

(55) 46. Yamashita T, Wang XW (2013) Cancer stem cells in the development of liver cancer. Journal of Clinical Investigation 123: 1911-1918.. 47. Douville J, Beaulieu R, Balicki D (2009) ALDH1 as a functional marker of cancer stem and progenitor cells. Stem Cells and Development 18: 17-25.. 48. Loh YH, Wu Q, Chew JL, Vega VB, Zhang W, et al. (2006) The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nature Genetics 38: 431-440.. 49. Ku CY, Wang YR, Lin HY, Lu SC, Lin JY (2015) Corosolic Acid Inhibits Hepatocellular Carcinoma Cell Migration by Targeting the VEGFR2/Src/FAK Pathway. PLoS One 10: e0126725.. 50. Shivji MK, Podust VN, Hubscher U, Wood RD (1995) Nucleotide excision repair DNA synthesis by DNA polymerase epsilon in the presence of PCNA, RFC, and RPA. Biochemistry 34: 5011-5017.. 51. Kurki P, Vanderlaan M, Dolbeare F, Gray J, Tan EM (1986) Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)/cyclin during the cell cycle. Experimental Cell Research 166: 209-219.. 52. Bravo R, Frank R, Blundell PA, Macdonald-Bravo H (1987) 54.

(56) Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta. Nature 326: 515-517.. 53. Nagata S (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Experimental Cell Research 256: 12-18.. 54. Ihara T, Yamamoto T, Sugamata M, Okumura H, Ueno Y (1998) The process of ultrastructural changes from nuclei to apoptotic body. MedSci Entry for Virchows Archiv 433: 443-447.. 55. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992) Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. Journal of Cell Biology 119: 493-501.. 55.

(57) 玖、圖 (A). (B). 56.

(58) 圖一、 (A) Teroxirone 可以降低 Huh7 的細胞存活率。三株常用的肝癌細胞在不同濃度 (2、5 與 20 M)的 teroxirone 處理 48 小時後，利用 MTT 測細胞存活率，發現 teroxirone 對於 HepG2 細胞株的細胞存活率並沒有太大影響；Hep3B 細胞在較高濃度藥物處理有較好的抑制其增生的效果，IC50 約為 13.3 M；而對於 Huh7 細胞在低濃度藥物就有很好的抑制效果，IC50 約為 4.8 M。D 代表 DMSO。 (N=3，以 DMSO 處理做為 100%的標準值，用 paired t-test 計算 P 值。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001)。 (B)Huh7 細胞在不同濃度 (2、5 與 10 M)處理 24 與 48 小時後，萃取蛋白進行西方墨點法分析。結果顯示 teroxirone 可以誘導 Huh7 細胞產生外源性細胞凋亡 (實驗數據由金承勳學長提供)。. 57.

(59) 圖二、 Z-DEVD-FMK 前處理可以減緩 teroxirone 抑制細胞增生的效果。 (深色) Huh7 細胞先經過 20 M Z-DEVD-FMK 前處理 24 小時後，再以不同濃度 (0.5、1、2、5、10 與 20 M)的 teroxirone 處理 48 小時； (淺色) Huh7 細胞在不同濃度的 teroxirone 處理 48 小時。D 代表 DMSO。 (N=3，以 DMSO 處理做為 100%的標準值，用 paired t-test 計算 P 值。* P < 0.05)。. 58.

(60) (A). (B). (C). (D). 圖三、 Z-DEVD-FMK 前處理可以回復 teroxirone 所造成的細胞凋亡。 (深色)代表沒有抑制劑處理； (淺色 )表示有 20 M 抑制劑前處理 24 小時，藥物處理濃度分別是 (A)控制組 DMSO、 (B)2 M、 (C)M 與 (D)10 M 之 teroxirone，藥物處理時間為 48 小時。收集細胞進行 PI 染色，用細胞流式儀分析細胞週期，並以 FlowJo 分析。 (N=3，用 paired t-test 計算 P 值。* P < 0.05)。 59.

(61) 圖四、 Z-DEVD-FMK 前處理可以減緩 teroxirone 所導致外源性細胞凋亡。 ( + )表示 Huh7 細胞先經過 20 M Z-DEVD-FMK 前處理 24 小時後，再以不同濃度 (2、5 與 10 M)的 teroxirone 處理 48 小時後萃取蛋白進行實驗； ( - )表示 Huh7 細胞未經抑制劑處理，直接以不同濃度的 teroxirone 處理 48 小時後進行蛋白質分析。 D 代表 DMSO。 GAPDH 為 loading control，以 Multi Gauge V2.1 進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。 60.

(62) (A). (B). 61.

(63) (C). 圖五、 (A) 由細胞傷口癒合分析 (Wound healing assay) 證明低濃度 teroxirone 有抑制細胞遷移的效果。 Huh7 細胞以濃度 0.5、1 與 2 M 的 teroxirone 處理，分別於 0、24 與 48 小時觀察之。 D 代表 DMSO。 (B)左圖為 teroxirone 處理後細胞傷口癒合分析統計結果，統計是將每個時間點各濃度取三處刮痕傷口寬度進行測量，並以 0 小時細胞刮痕寬度做為 100%的標準值。 (N=3，用 paired t-test 計算 P 值。 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001)。 (C)為 Hep3B 細胞僅以最高濃度 2 M 之 teroxirone 處理。藍色標示為製造細胞刮痕傷口的邊界；紅色標示為刮痕傷口癒合的邊界，觀察 0、24 與 48 小時之結果。右圖為 Hep3 藥物處理後之統計結果，以每個時間點各濃度取三處刮痕傷口寬度進行測量，並用 0 小時細胞刮痕寬度做為 100%的標準值。 (N=3，用 paired t-test 計算 P 值 )。 62.

(64) (A). (B). 63.

(65) 圖六、由細胞遷移實驗 (transwell migration assay)證明低濃度 teroxirone 有抑制細胞遷移的效果。 (A)為 Huh7 細胞 (B) HepG2 加藥組為負控制組。 upper chamber 加入有不同濃度藥物 (Huh7 細胞以濃度 0.5、1 與 2 M 的 teroxirone 處理； HepG2 細胞僅以最高濃度 2 M 之 teroxirone 處理 )且不含血清的培養液；而 bottom chamber 內加入有不同濃度藥物處理且含 10% FBS 的培養液。藥物作用 48 小時後，固定與染色，並由 LAS4000 與顯微鏡攝影紀錄影像。右圖為細胞遷移實驗統計結果，以 LAS4000 拍攝的影像進行量化後統計， (A)右圖為 Huh7 統計結果； (B)右圖為 HepG2 統計結果。D 代表 DMSO。 (N=3，以 DMSO 處理做為 100% 的標準值，用 paired t-test 計算 P 值。 * P < 0.05, ** P < 0.01)。. 64.

(66) (A). (B). 65.

(67) 圖七、 (A) 由細胞侵入實驗 (transwell invasion assay) 證明低濃度 teroxirone 有抑制細胞侵入細胞外基質的效果。將 matrigel coating 於 transwell 後，加入有不同濃度藥物 (0.5、1 與 2 M) 處理但不含血清的培養液；而 bottom chamber 內加入有不同濃度藥物處理且含 10% FBS 的培養液。藥物作用 48 小時後，固定與染色，並由 LAS4000 與顯微鏡攝影紀錄影像。右圖為細胞侵入實驗統計結果，以 LAS4000 拍攝的影像進行量化後統計。D 代表 DMSO。 (N=3，以 DMSO 處理做為 100%的標準值，用 paired t-test 計算 P 值。* P < 0.05,. ** P < 0.01)。. (B)為 HepG2 以 2. M 藥物處理之實驗結果，細胞不因藥物處理而影響其侵入能力，為負控制組。右圖為以 LAS4000 拍攝的影像之量化結果。D 代表 DMSO。 (N=3，以 DMSO 處理做為 100%的標準值，用 paired t-test 計算 P 值 )。. 66.

(68) (A). (B). 67.

(69) 圖八、透過酶譜分析 (zymography)證明低濃度 teroxirone 處理使 MMP-2 與-9 的活性下降。 (A)Huh7 細胞經濃度 0.5、1 與 2 M 處理後，收集細胞培養液濃縮後分析結果。D 為 DMSO。右圖是利用 Multi Gauge V2.1 之統計結果。 (N=3， *為加藥組 MMP-9 與 MMP-9 控制組比較結果，用 paired t-test 計算 P 值。 * P < 0.05, ** P < 0.01；#為加藥組 MMP-2 與 MMP-2 控制組比較結果，用 paired t-test 計算 P 值。# P < 0.05, ## P < 0.01)。 (B) 為 HepG2 以最高濃度 2 M 之 teroxirone 處理之結果，右圖為 Multi Gauge V2.1 統計結果。. 68.

(70) 圖九、低濃度 teroxirone 處理使癌細胞轉移相關基因表現下降。Huh7 細胞以藥物濃度 0.5、1 與 2 M 處理 48 小時，HepG2 細胞以濃度 2 M 處理 48 小時，進行蛋白質分析。結果顯示 Huh7 加藥後 MMP-9 與 -2 與 VEGF 的蛋白質有下降趨勢。 D 表示 DMSO。 GAPDH 為 loading control，以 Multi Gauge V2.1 進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。 69.

(71) (A). (B). (C). (D). 70.

(72) 圖十、利用免疫螢光染色觀察teroxirone對Huh7肝癌類幹細胞之增生與幹細胞標示物之影響。 (A)Huh7細胞濃度10、20與30 M 之teroxirone處理48小時後，進行BrdU增生試驗，以活細胞顯微鏡紀錄影像，分析螢光強度之變化。 (B) (C) (D)分別為CD133、 ALDH1A1與NANOG之螢光染色結果，Huh7細胞以濃度10、20與 30 M之teroxirone處理48小時，以幹細胞標誌物之一級抗體，及帶有FITC的二級抗體作用，利用活細胞顯微鏡偵測螢光強度之變化，並紀錄影像。藍色螢光為DAPI，綠色螢光為幹細胞標誌物 (CD133、ALDH1A1與NANOG)。. 71.

(73) 圖十一、利用西方墨點法確定幹細胞標示物在貼附型細胞與肝癌類幹細胞中蛋白質表現之差異。貼附性細胞以 2、5 與 10 M 之 teroxirone 處理 48 小時；球狀細胞以藥物濃度為 10、20 與 30 M 藥物處理 48 小時。結果顯示不論是貼附型細胞還是肝癌類幹細胞，幹細胞表面標示物之蛋白表現皆有下降。D 表示 DMSO。 GAPDH 為 loading control，以 Multi Gauge V2.1 進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。. 72.

(74) (A). (B). (C). (D). 73.

(75) 圖十二、 Teroxirone 處理能抑制 Huh7 細胞異體移植之腫瘤生長。 (A)實驗期間測量之腫瘤體積，於接種細胞後第 10 天開始給予不同濃度的藥物 (分別為 0.9 mg/kg 與 1.8 mg/kg)，並開始測量腫瘤體積。圖上黑色箭頭表示該次測量有給予藥物。 (B)實驗期間測量之裸鼠體重，體重並沒有因為藥物處理而有明顯差異。 (C)自裸鼠腿部取下腫瘤之外觀，觀察腫瘤大小變化。 (D)取出腫瘤之重量。. 74.