離子化器：基質輔助雷射脫附游離法（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI）

質譜儀中之離子源，依能量常可分成兩大類：

1.軟離子源 (soft source) — 圖譜中幾乎無碎片離子 (fragment ions)，僅包含分子離子峰及少 數 peak，可得知分析物分子量。

2.硬離子源 (hard source) — 高能量傳遞下所形成的離子，因位處高能階，故斷鍵形成碎片 離子 (fragment ions)，可藉此判斷官能基種類及分子結構，缺點是看不到分子質量。

質譜儀之離子源，若依方法可分成三大類：

1.氣相游離法 (gas phase ionization) — 樣品需先加熱揮發 (vaporize) 成氣相分子 (gas) 再 離子化，缺點為適用沸點 (b.p.) < 500℃以下的熱安定物 (質量範圍小於 1000Da)。

2.脫附游離法 (desorption ionization) — 引入不同形式的能量，使固體或液態樣品直接變成 氣體離子，優點為 (1)適用於非揮發性分子、易熱解分子、分子量大於 1000Da 以上之化合 物，(2)圖譜大為簡化，常只含分子離子峰或質子化的分子離子峰。

3.噴灑游離法 (spray ionization) — 以高電壓將液體噴灑出去並在噴灑過程中將分析物離 子化。也適用於非揮發性易熱解的分子。因為可形成多價離子，所以可分析的質量範圍從 數十到數萬 m/z。

綜合以上對離子化法的分類標準，我們大致可將現今的基質輔助雷射脫附游離法，因 其大部分提供分子離子峰 (M+H

⁺

) 的特性及基質的功用，可視為一種軟性脫附游離法。脫 附游離法又可分為直接雷射脫附法和基質輔助雷射脫附游離法。早期將高能雷射聚焦後，

照到固體分析樣品表面，直接產生脫附游離的現象，稱之為直接雷射脫附法 (direct laser desorption, LD)。因沒有添加基質來扮演能量吸收的角色，其待測樣品本身常需具有吸收雷 射能量的特性。可分析的質量範圍小於 2000Da，大多數為數百 Da 左右的小分子；如果待 測樣品本身無法有效吸收雷射波長，則其能量須藉由探針 (probe) 的金屬基層 (substrate) 來進行吸收傳遞，在有限的吸收能力下以熱傳導方式提供能量給樣品分子。但是雷射波長 範圍內吸收效率及能量傳遞的速度有限，在能量輸入及相轉移的速度小於熱分解的速度的 情況下，常造成高分子分解，產生多種碎片離子而較難得到分子離子峰，直到引入基質之 後，才解決了大分子的氣化裂解的問題。

(1:10-1:50000)，經由溶劑揮發的乾燥過程，使分析物與基質形成晶體 (即共結晶)，當用脈 衝雷射照射晶體時，由於在結晶中，基質分子的數目遠較分析物分子為多，因此雷射能量 主要先由基質分子先吸收後，再將部分能量傳遞給其所環繞的分析物分子，這些受雷射能 量影響區域內的分子，在短時間內 (10^－

¹²

~10^－

¹⁵

秒間) 被雷射能量迅速加熱而由固相直接昇 華形成氣相，在形成的高密度氣體中，據推測至少包括了光解離子反應 (Photoionization)、

光化學反應 (Photochemical ionization) 及 分子-離子反應 (ion-molecular reaction)，並依樣品 的特性產生正離子或負離子，所產生的離子最後被選擇（＋或－）送進飛行時間質譜儀分 離偵測。MALDAI 所產生的質譜圖多為單質子加成的分子離子 (M+H

⁺

)，因而質譜圖中的 離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關係，另外，圖譜中常可觀察到與金屬鈉 M+Na

⁺

、 金屬鉀 M+K

⁺

所形成的加成物 (adduct) 分子離子峰和二聚物 (dimer) 離子峰。

一般 MALDI 採用的鐳射波長通常為 337nm (N

₂

鐳射，脈衝時間 1～5ns)、1064nm (Nd:YAG 雷射) 和 10.6nm (二氧化碳 CO

2

氣體雷射)，鐳射功率通常為 5- 20W，每單位面積 上有效的雷射能量範圍限制在 10

⁶

～10

⁷

W/cm

²

，但僅有 10~4W 的能量用於樣品的脫附和離 子化 (Desorption and ionization)，所以樣品的分解機率減小。

圖 2. MALDI 離子化過程

MALDI 的優點：

1 圖譜簡單：背景雜訊低、不存在分析物離子的碎裂片段。

2 靈敏度高：極少量的樣品。

3 效率高：分析速度快。

5 可溶性: 可溶於樣品溶液中。

6 低的反應活性: 不與分析物反應，使質譜圖不複雜化。

許多具有共軛結構的芳香化合物很容易滿足以上 6 點的要求，如 2，5-二羥基苯甲酸

（DHB, 2,5-Dihydroxybenzoic acid,常用於肽 (peptide)、蛋白質 (protein)、碳水化合物 (carbohydrates) 分析）、芥子酸（SA, sinapinic acid,常用於 peptide、protein 分析）、 α-CN-4-OH-肉桂酸(HCCA, α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid 常用於 protein、carbohydrates 分析)等。

表一. 常用 MALDI 之 matrix(基質)

基質 簡寫 分子式 分子量 分子結構

3-Hydroxypicolinic acid 3-HPA C

6

H

5

NO

3

139.11

N O

HO HO

3-Hydroxypicolinic acid

2,4,6 - Trihydroxyacetophenone 2,4,6-THAP C

₈

H

₈

O

₄

168.15 ^C

HO

OH OH O

CH3

Sinapinic acid

(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy- cinnamic acid)

SA C

11

H

12

O

5

224.22

O

HO OH

O O

3,5-Dimethoxy-4-hydroxy- cinnamic acid

2,5-Dihydroxybenzoic acid 2,5-DHB C

₇

H

₆

O

₄

154.12

O OH HO

OH

2,5-Dihydroxybenzoic acid

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid α-CHCA (α-HCCA)

C

10

H

7

NO

3

189.17

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

OH N O OH

SDHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid /2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid)

super DHB

2,5-Dihydroxybe nzoic acid

C

₇

H

₆

O

₄

2-Hydroxy-5-me thoxybenzoic acid

C

₈

H

₈

O

₄

154.03

168.04

O OH HO

2,5-Dihydroxybenzoic acid

OH

O HO

O HO

2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid methyl ester

CNME

2.3 質量分析器-- 飛行時間質量分析器（Time-of-Flight, TOF mass analyzer）

飛行時間質量分析器，如其名稱所示，乃是根據離子由離子源離子化器飛行到偵測 器之時間來決定其質荷比。

3)，藉此來分別出不同質荷比的離子。由於記錄的是飛行時間，所以 TOF 分析器可分析分 子的質量數理論上是沒有上限的，因此適於質量動態範圍大的樣品，如蛋白質、多肽、核 酸和多醣體等生物大分子的研究。

除了上述的優點，飛行時間分析器也具有先天的缺陷，即其質量解析度會因為離子生 成時的時間分佈 (temporal distribution)、空間位置分佈及初始動能分佈的影響而變差。（1）

時間分佈的影響--因離子在離子源產生時，生成時間不同所致，若在質量、帶電荷、生成位 置及動能皆相同的情況下，則各離子將以其生成的時差到達偵測器，造成質量解析度降低；

一般而言，解決此誤差的方法為降低加速電壓或增加無場飛行管的長度來改善，或利用脈 衝式雷射來縮短生成時間，進而減少誤差。（2）空間位置分佈 (spatial distribution) 的影響 --由於某些離子的生成位置離加速電場出口較近，因加速距離較短，所獲得的動能相對較 小，容易造成到達偵測器的時間落後於其他相同質量同電荷但生成位置離加速電場出口較 遠的離子，欲改善這種情形可利用兩階段推出法 (two-stage extraction)，第一段先利用較低 的加速電壓聚焦，第二段才用較大的加速電壓將離子推出，以提高解析度。（3）起始動能 分佈 (initial kinetic energy distribution) 的影響--當相同質量及電荷值的離子，因起始動能分 佈的方向或大小不同，而具不同的總動能或飛行速度時會造成訊號峰變寬、解析度下降。

改善的方式除了上述數種方法（脈衝式的間歇性雷射光、兩階段推出法、增加飄移管長度(D)）

外，主要乃是利用遲滯聚焦 (delayed extraction) 來改善，即離子於離子源生成後並不立刻 施加推出電場來刻意延遲一段適當時間，使各離子能以其初始動能沿著飛行管軸線向離子 源出口端遠離或靠近，則離子生成時的初始動能分佈會轉變成空間位置分佈，如此再經由 兩段式推出法將其送入飛行管中，即可得到最佳解析度。另外還有一種改善方法為使用 reflector mode TOF (反射型，見圖三)，使帶有不同能量但相同質量 m 及電荷 z 的離子，因 撞擊反射電場 (reflectron) 的深度不同，能量較大者 (速度較快) 但其質荷相同者撞擊較 深、而較晚脫離出反射面，且飄移長度同時較長，因此恰好抵銷能量散佈，而使相同 m/z 值的離子聚集使得帶寬變窄。另外，利用 reflector mode TOF (反射型) 偵測 PSD (post source decay) 則是調整反射處 (reflectron) 的電壓，改變彼此之間能量差異微小的 PSD 離子之加 速度，使其在穿越 TOF 的時間剛剛好能得到分離微小 m/z 差異的最佳解析度，常能得到關 於結構訊息的質譜。

以本實驗所用的 MALDI-TOF/MS 來講，離子飛行模式可分為直線式和反射式兩種 (如 圖三所示），直線式的質量解析能力 (mass resolution, m/ m)△ 最高可超過 4000，而反射式 則可達 18000。不過對於大質量的分子離子(質量超過 8000)，一般多在直線模式下操作，因 為反射電場無法反射太大的離子。

圖 3. TOF 示意圖 (a)linear mode 直線型，(b)reflector mode 反射型。

註：離子 (質量 m 電荷 z) 的飛行時間 t 為其在加速場(長度 d)和飛行管(長度 D)中的 飛行時間之和： t=d(2m/zeV)

^1/2

+D(m/2zeV)

^1/2

……..(1)

或 (m/z)

^1/2

=at+b…….………...(2) 即 m/z 值愈大，時間愈長。

TOF（time of flight）mass analyzer 飛行時間質量分析器的特性：

1 質量分析範圍沒有限制 2 離子源易獲得

3 靈敏度高

4 掃描時簡短(μs) 5 構造簡單而耐用

Mode 優點： 缺點：

質量分析範圍大 解析度(力)差 Linear TOF(直線型)

靈敏度高

解析度(力)高 質量分析範圍小 Reflector TOF(反射型)

靈敏度差

(1) 極高的偵測質量範圍 可分析分子量高達百萬的分析物。

(2) 極高質量精確性(mass accuracy) 離子接近真實狀況。

(3) 極高的靈敏度(sensitivity) 最高可分析到 femtomoles (10

^-15

) 甚至 attomole (10

^-18

) 濃度的分析物。

(4) 極高的解析度(力)(resolution) 常可高達M/ΔM>10,000以上。

(5) 偵測時間極短 掃描時間μs，一天便可分析上百件樣品。

(6) 操作非常簡便 操作介面人性化，使用者易上手。

(7) 較低能量消耗 相對上優於須高溫加熱的 TS (熱噴灑離子化) 或 GC/MS。

(8) 低實驗花費 使用上分析溶劑體積大大地減少。

由於以上之特點，使 MALDI 短時間內就被商品化，並廣泛地使用於大分子樣品之分 析。

在文檔中 玖、附錄 第一子計劃：生化分析領域教學與品質提昇計畫。 (頁 59-64)