飼養籠內行為分析是一種用來分析小鼠日常行為的監測系統，藉
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由錄影紀錄的方式，再對小鼠的動作進行分析，以觀察是否在行為上 出現異常。我們會先將待分析的小鼠獨自置於鼠籠，放在錄影的環境 中一個晚上，讓小鼠習慣該環境之後，對小鼠進行 12 小時的錄影，
藉由 Home Cage Scan (Clever Sys. Inc.,Reston, VA, USA)系統進行監 測和分析各組小鼠之間的日常行為是否有受到藥物之影響。
小腦切片
將小鼠以 Avertin (0.4 g/kg body weight; Sigma)麻醉後，用 0.9%生 理食鹽水(saline)對小鼠進行灌流(perfusion)，再以 4%PFA 進行灌流固 定，然後將小腦取出，泡在 4% PFA 中進行後固定 4 個小時，再依序 以 10%蔗糖溶液(sucrose)1 小時、20%蔗糖溶液 2 小時和 30%蔗糖溶 液 12-16 小時進行脫水，最後將小腦保存於-80℃。
將小腦置放於-20℃一天後，再用冷凍切片機(LEICA CM3050S, Nussloch, Germany)進行 30 μm 厚度的冷凍切片(cryosections)。
小腦切片免疫螢光染色(Immunoflourescence staining)
首先我們會用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)對腦片進行 3 次 潤洗，並在細胞膜上打洞，接著以含有 10％FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100)於 4℃反應一晚進行阻斷(blocking)，然後用含有 5% FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100)稀釋初級抗體(參考抗
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體列表 1)進行染色，與腦片於 4℃作用一晚，接著用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)對腦片再進行 3 次潤洗，隨後以含有 5%FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100）稀釋螢光二級抗體(參考抗體列表 2) 做組織免疫染色，於 37℃反應 2 小時，並用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)稀釋之 DAPI (1:5000)染細胞核 30 分鐘，最後再以封片膠 (Fluoromount-G, Southern Biotech, Los Angeles, CA, USA)將腦片置於 玻片上，並且蓋上蓋玻片，使用共軛焦顯微鏡系統(Leica TCS SP2 confocal spectral microscope imaging system, Wetzlar, Germany)對螢光 免疫染色後的小腦腦片進行拍攝和分析。
HDAC 活性分析
我們使用 HDAC-Glo™ I/II Assay and Screening System (Promega, Madison, Wisconsin, USA)來對小鼠的小腦進行 HDAC 的活性分析，
在冰上取出 WT 成鼠小腦後，取出其小腦中的蛋白質，進行定量，以 PBS 序列稀釋為 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125 ng/l 當作 protein source，將 HDAC-Glo™ I/II Substrate 用 10 ml HDAC-Glo™ I/II Buffer 回溶，靜置 10 分鐘，再以 1：1000 加入 Developer Reagent，
當作 HDAC substrate solution，最後以 20 l protein source 加上 20 l HDAC substrate solution 以及 10 l ddH2O 混合，使用 Microplate
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Spectrophotometer (BioTek Quant™, Winooski, Vermont, USA)在 470 nm 波長下進行冷光讀值，求出在 80％ HDAC 活性之蛋白質濃度，
隨後再以此濃度配置 protein source，以 20 l protein source 加上 20 l HDAC substrate solution 以及 10 l 待測藥物混合，求出在該藥物濃 度下小鼠小腦中的 HDAC 活性。
西方墨點法(Western blot)
將小鼠的小腦取出，並加入五倍體積的 RIPA 緩衝液(RIPA lysis buffer)[5 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% DOS, 1% NP40]、1%蛋白酶抑制劑(protease inhibitor, #78425, Thermo)以及 1%磷酸水解酶抑制劑(phosphatase inhibitor, #P2850, Sigma)後，利用均質機(Next Advance, NY, USA)，速度 3，3 分鐘將小 腦打碎，冰上靜置 30 分鐘後，以 14000 g 離心 30 分鐘，抽取上清液 蛋白質，之後再用二羧基二喹啉(bicinchoninic acid; BCA, Pierce, Rockford, USA)對蛋白質進行定量。
將 25 g 的蛋白質以聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-page)分離，並且轉漬到聚氟化 二乙烯膜(polyvinylidene fluoride member; PVDF member, Millipore)上，
接著用 ddH2O 配置 5%的奶粉在室溫 blocking 2 個小時，再用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)稀釋初級抗體(參考抗體列表 1)，4℃反應
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一個晚上，隨後用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)潤洗 3 次，每次 15 分鐘，再用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)稀釋二級抗體(參考 抗體列表 2)，室溫反應 2 小時，最後再潤洗 3 次，接著以 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, MA, USA )反 應，最後用 LAS-4000 chemiluminescence detection system (Fujifilm, Tokyo, Japan)進行拍照和分析。
統計和分析
細胞培養和動物行為測驗中的比較都是用單因子變異數分析
(One-way ANOVA test)進行(SPSS version 20; SPSS INC, Illinois, USA)，
所有實驗數值以 Mean±S.E.M 表示，當 P < 0.05 時代表統計上有顯著 差異。
28 DIV18 進行細胞免疫螢光染色(ICC)。我們使用 IP3R1 抗體來偵測 Purkinje cell，觀察 Purkinje cell 的型態。
由染色結果發現 WT 和 TG 小鼠間的 Purkinje cell 在型態上有所 不同(圖 1B)，TG 小鼠 Purkinje cell 的神經突伸展(neurite length)比 WT 小鼠為短，此結果說明 SCA17 的 TG 小鼠 Purkinje cell 生長較差，因 此我們利用 SCA17 小鼠的小腦初級細胞培養模式測試藥物的效果，
希望以此模式初步篩選出可能對於 SCA17 小鼠的病徵有改善潛力的 藥物。
篩選可以提升 SCA17 小腦 Purkinje cell neurite length 之化合物 在藥物測試的過程中，我們在初級細胞培養 DIV5 時將培養液換 成添加藥物的培養液，除了 neurite length 之外，我們也以 Purkinje cell 的數目作為藥物毒性粗略判斷的依據。
我們所使用的藥物包含由國立台灣師範大學化學系姚清發教授 (Dr. Ching-Fa Yao, Chemistry Department of National Taiwan Normal
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University)所合成提供的 NC038、NC039、NC002 系列、NC004 系列、
NC005 系列化合物以及購買自 Enamine 及 Exclusive Chemistry 的 HDACi 化合物(NC100 系列)。我們以 0.1 nM、1 nM 以及 10 nM 藥物 濃度進行初步的測試。
由染色結果看到給予 NC038 (10 nM)及 NC039 (10 nM)處理後，
Purkinje cell 之 neurite length 長度有稍微被提升(圖 2)，而且 Purkinje cell 的數目並沒有隨著藥物濃度上升而減少，代表所使用藥物濃度並 不會對 Purkinje cell 造成太高毒性。
NC004 系列的篩藥結果如圖 3 所示，隨著 NC004-1 濃度的增加，
neurite length 有稍微上升的趨勢，但是並沒有達到顯著的差異，而在 Purkinje cell 數目上並沒有太大的變化，NC004-6 在 10 nM 的濃度下 neurite length 同樣有上升，而 Purkinje cell 數目則是上升達顯著差異，
表示在 10 nM 的濃度下不會對 Purkinje cell 造成毒性，對於 Purkinje cell 的生長可能具有潛力。
NC005 系列的篩藥結果如圖 4，Purkinje cell 的 neurite length 以 及細胞數均無明顯的差異。
HDACi 化合物之處理結果如圖 5，以 10 nM NC105 處理細胞後，
Purkinje cell 的 neurite length 有顯著性的上升，Purkinje cell 數目也稍 微提升。以 10 nM NC106 處理細胞後，Purkinje cell 的 neurite length
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有顯著性的上升，而 Purkinje cell 數目有稍微下降，10 nM 之 NC106 可能對 Purkinje cell 有些毒性。以 10 nM NC112 處理培養的小腦細胞 後，neurite length 有上升的趨勢(圖 5)，但是並未達顯差。由以上結 果看來，NC105 以及 NC106 可能對於 SCA17 小鼠 Purkinje cell 退化 有改善的潛力。在我們的另外一套篩藥模式 SCA17 的小腦組織切片 培養(Slice culture)中，NC105 (M344)以及 NC109 (Droxinostat)均能夠 顯著的改善 TBP 聚集(陶, 2013)，因此我們針對 NC105 (M344)與 NC109 (Droxinostat)作進一步研究。
M344 及 Droxinostat 抑制成鼠小腦的 HDAC 活性
我們將成鼠小腦的蛋白萃取出來，進行 HDAC 的活性測試，以 TSA 作為正控制組，分別分析 M344 及 Droxinostat 對於小腦組織 HDAC 活性的抑制效果。結果顯示，M344 及 Droxinostat 皆可有效抑 制成鼠小腦中的 HDAC，M344 之 IC50為 1.26 nM，Droxinostat 之 IC50
為 1.92 M，所以 M344 的抑制能力應較 Droxinostat 強(圖 6)。
M344 及 Droxinostat 對 SCA17 小鼠體重增加並無影響
我們先將 HDACi 化合物 M344 及 Droxinostat 進行小量動物的預 試驗(圖 7A)，以腹腔注射的方式將藥物打入 SCA17 TG 小鼠，M344 注射劑量為 9.22 mg/kg，Droxinostat 注射的劑量為 12.57 mg/kg，從小
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鼠三週大時開始每隔一天注射一次，並每週測量小鼠的體重。
從 3~9 週期間測量體重的結果我們發現給予 M344 或 Droxinostat 小鼠的體重與 vehicle 組別並無差異(圖 7B)，因此初步推論這兩個化 合物可能對小鼠不致造成明顯的傷害。
M344 以及 Droxinostat 處理可增加 SCA17 小鼠之活動協調性
我們用 rotarod 試驗來評估小鼠的運動協調及平衡能力，由於 SCA 的小鼠平衡能力較差，可以停留在 rotarod 之時間較短(Chang et al., 2011)，藉由給藥後小鼠停留在 rotarod 上面的時間長短，我們可以 評估藥物對於小鼠運動失調的效果。
根據我們每兩週測試一次的結果，給予 M344 以及 Droxinostat 的 SCA17 小鼠雖然與 vehicle 的小鼠在 rotarod 上的時間並沒有顯著 的差異，但是 M344 以及 Droxinostat 處理組別的 SCA17 小鼠隨著年 紀增加停留在 rotarod 上的時間有增長(圖 7C)，我們初步認為 M344 以及 Droxinostat 有潛力改善 SCA17 的小鼠運動協調能力。
M344 以及 Droxinostat 對 SCA17 小鼠過動以及焦慮行為的影響
SCA17 的小鼠有過動(hyperactivity)的現象，在 locomotor 的行為 試驗中會有移動距離較長的情形(Chang et al., 2011)，因此我們對小鼠 做了 locomotor 的分析以了解給藥之後是否能對其過動的病徵有所改
32 沒有焦慮反應(El Idrissi et al., 2009)，我們用這項測驗來觀察藥物是否 增加小鼠的焦慮感，以便了解藥物是否對小鼠有不良反應。
測驗的結果顯示，給予 M344 以及 Droxinostat 組別的 SCA17 小 鼠與控制組在周圍區域以及中間區域的時間並沒有差異(圖 7D)，代表 小鼠的焦慮感並沒有因為藥物處理而提高。
M344 及 Droxinostat 改善 SCA17 小鼠 Purkinje cell 型態，降低 TBP
聚集，並提高組蛋白乙醯化程度
行為分析結束後我們將小鼠犧牲，對小腦進行冷凍切片與後續的 免疫螢光染色，分析藥物對病理之影響。
給予 M344 以及 Droxinostat 的組別在 Purkinje cell 的排列上皆比 vehicle 組整齊，分子層(molecular layer)也比 vehicle 組有較茂密之 neurite，而在 TBP 聚集的部分，給藥組的螢光強度也較 vehicle 組弱，
統計的結果可以看到藥物對 TBP 聚集有顯著的改善(圖 8A)，已知
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SCA17 的小鼠會有膠細胞增生(gliosis)的情形發生(Chang et al., 2011)，
所以我們也對此做了染色觀察，結果顯示，M344 以及 Droxinostat 能 明顯的改善膠細胞增生的情形(圖 8B)，我們也進行了組蛋白乙醯化分 析，結果顯示 M344 以及 Droxinostat 均能夠提高組蛋白乙醯化程度，
其中又以 Droxinostat 的作用較為明顯(圖 9)。
M344 及 Droxinostat 在大量試驗中並不影響小鼠的體重和小腦腦重
由小量動物預試驗我們認為 M344 及 Droxinostat 對於 SCA17 小 鼠的病徵有改善的潛力，因此我們將 M344 和 Droxinostat 使用於較大 量之動物實驗(圖 10A)，同樣以腹腔注射的方式將藥物打入小鼠體中，
並以 WT 和 SCA17 TG 小鼠同時進行實驗，M344 注射劑量同樣為 9.22 mg/kg，Droxinostat 注射的劑量為 12.57 mg/kg，從小鼠四週大時開始 注射，由於小量預試驗時我們認為用藥的劑量不會造成過多毒性，為 了提升藥物的效果，改為每天注射一次，並每週測量小鼠的體重。
由體重的結果看到，TG 的小鼠體重皆比 WT 小鼠要輕，不過並 沒有達到顯著差異，而施打 M344 和 Droxinostat 之後並不會影響小鼠 的體重，所以這兩支 HDACi 對小鼠應不會造成明顯的傷害(圖 10B)。
小鼠的小腦腦重測量結果證實 TG 小鼠小腦明顯輕於 WT 小鼠 (Chang et al., 2011)，施打 M344 和 Droxinostat 可稍微提升小腦重，但 並未達顯差(圖 10C)。
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施打 M344 以及 Droxinostat 可增加 SCA17 小鼠之活動協調性 施打 M344 和 Droxinostat 的 WT 及 TG 小鼠每兩週進行一次 rotarod 測驗，由結果可以發現，從第六週開始，TG 小鼠在 rotarod 上跑動的時間明顯少於 WT 小鼠，從第十週開始，施打 Droxinostat 的 TG 小鼠在 rotarod 上跑動的時間明顯高於 TG vehicle 組的小鼠，
M344 以及 Droxinostat 並未影響小鼠的過動、焦慮以及步態
我們在第九週時對小鼠進行 homecage，第十一週時進行
locomotor，以觀察 M344 和 Droxinostat 是否影響小鼠的日常行為、
過動及焦慮，在 homecage 的實驗中，吃飼料及伸展身體的次數各個 組別的小鼠並沒有看到明顯的差異(圖 11A)，而在 locomotor 的測驗 中的路徑圖可以看到，TG 小鼠在周圍區域行走的比例較多(圖 11B)，
過動及焦慮，在 homecage 的實驗中，吃飼料及伸展身體的次數各個 組別的小鼠並沒有看到明顯的差異(圖 11A)，而在 locomotor 的測驗 中的路徑圖可以看到，TG 小鼠在周圍區域行走的比例較多(圖 11B)，