以SCA17小鼠系統評估對於polyQ疾病有潛力的HDAC抑制劑

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 以 SCA17 小鼠系統評估對於 polyQ 疾病有潛力的 HDAC 抑制劑 Identification of Potential HDAC Inhibitor Compounds for PolyQ Diseases with SCA17 Mouse System. 研究生：孫定中 Ting-Chung Sun 指導教授：謝秀梅博士 Hsiu-Mei Hsieh. 中華民國 103 年 7 月.

(2) 目錄中文摘要..................................................................................................... 1 英文摘要..................................................................................................... 3 縮寫表......................................................................................................... 5 研究背景..................................................................................................... 7 研究目的................................................................................................... 17 材料與方法............................................................................................... 18 研究結果................................................................................................... 28 討論........................................................................................................... 41 參考文獻................................................................................................... 47 圖表........................................................................................................... 54.

(3) 摘要脊髓小腦萎縮症(Spinocerebellar ataxia, SCA)，是群異質性體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，主要病徵包括共濟失調、癡呆、肌張力障礙及癲癇等，病理特徵主要是小腦萎縮。第 17 型脊髓小腦萎縮症(SCA17)是由於在 TATA-binding protein (TBP)基因上有過度重複擴增的 CAG/CAA 序列重複所引起的一種多麩醯胺酸(polyglutamine, polyQ)疾病，TBP 是三種 RNA 聚合酶轉錄起始的重要轉錄因子，多麩醯胺酸過長造成蛋白質錯誤折疊而堆積，並進而引發細胞損傷及退化，尤其以小腦的 Purkinje cell 特別明顯。組織蛋白去乙醯酶(Histone deacetylase, HDAC)會將組蛋白之乙醯基團移除而讓組蛋白更緊密的與 DNA 結合，抑制基因的轉錄，造成許多疾病，組織蛋白去乙醯酶抑制劑(HDACi)可以改善轉錄的抑制，並在一些神經退化性疾病中扮演神經保護的角色，我們建立 SCA17 小鼠小腦的初級細胞培養和小腦切片培養來篩選 HDACi，並將有潛力的化合物進行動物行為實驗。在 SCA17 小鼠小腦的初級細胞培養中我們發現 NC105 和 NC109 可以增加 Purkinje cell 的神經突生長(neurite length)，在 SCA17 小鼠小腦的體外切片培養也看到 TBP 聚集有明顯的下降，因此用 NC105 和 NC109 進行小量動物行為的預試驗，我們發現 SCA17 小鼠的體重並沒有明顯受到藥物之改變，運動平衡改善上，NC105 和 NC109 組別 1.

(4) 的小鼠在 rotarod 停留的時間有增加的趨勢，病理上我們發現 SCA17 小鼠 Purkinje cell 退化情形有得到改善，同時 Histon H3 與 Histon H4 乙醯化程度有明顯提高，我們也發現給予 NC105 和 NC109 的 SCA17 小鼠 Purkinje cell TBP 聚集的情形有明顯改善，因此我們認為 NC105 和 NC109 能抑制 HDAC 以改善轉錄的異常。進入了大量動物行為實驗之後，NC105 及 NC109 之處理並不影響小鼠體重，也不影響小鼠的焦慮，但改善小鼠的運動協調能力，同時增加 HSP 的表現，NC109 更能有效降低 TBP 不正常聚集，因此我們認為 NC105 和 NC109 是有潛力改善 SCA17 小鼠病徵的 HDACi。. 關鍵字：第 17 型脊髓小腦萎縮症、基因轉殖鼠、小腦初級培養、組織蛋白去乙醯酶抑制劑. 2.

(5) Abstract Spinocerebellar ataxia (SCA) is a group of heterogeneous autosomal dominant neurodegenerative diseases. Clinical symptoms include ataxia, dementia, dystonia, seizures, and significant cerebellum atrophy in pathology. Spinocerebellar ataxia type 17 (SCA17) is one type of SCAs. It is caused by CAA/CAG repeat segment of the TATA-binding protein (TBP) gene. TBP is a crucial transcription factors for all the three RNA polymerase in transcription initiation. The polyglutamine (polyQ)-expanded mutant TBP accumulates as aggregates in the cells and leads to cell degeneration, especially the cerebellar Purkinje neurons. Histone deacetylases (HDAC) make the histones more tightly bind to DNA by removing the acetyl groups from histones, which in turn suppresses the gene transcription and causes many diseases. HDAC inhibitors could alleviate transcription suppression and show neuroprotecive effect in several neurodegenerative diseases. We used the mouse cerebellar primary culture from the SCA17 transgenic mice established in our lab to screen HDAC inhibitors. The potential compounds were further applied for in vivo test. We found two HDAC inhibitors, NC105 and NC109, can increase Purkinje cell total neurite lengthon primary culture and decrease TBP aggregation on slice culture. These two HDAC inhibitors were applied to small-scale SCA17 mice to verify their efficacy in vivo. During the in vivo treatment, mouse body weight was not altered by HDACi treatment. In addition, mouse motor coordination was improved from the rotarod task evaluation. Our preliminary results show these two inhibitors alleviate Purkinje cell 3.

(6) degeneration and increase histone acetylation. NC105 and NC109 treatment can also decrease TBP aggregation. These compounds might alleviate the transcriptional dysfunction of SCA17 through inhibition of HDAC. These two HDAC inhibitors also could significant improved mouse motor coordination from the behavior evaluation for large scale animal test. In sum, NC105 and NC109 show significant effect in vitro and improve motor coordination and reduce neuron degeneration of SCA17 transgenic mice. The result suggests that these two HDACi could be potential HDAC inhibitors for SCA17 treatment.. Key words: SCA17, HDACi, NC105, NC109. 4.

(7) 縮寫表縮寫. 全名. AD. alzheimer’s disease. ADCAs. autosomal dominant cerebellar ataxias. AraC. arabinoside cytosine. BCA. bicinchoninic acid. BDNF. brain-derived neurotrophic factor. CNS. central nervous system. DAB. diaminobenzidine. DMSO. dimethylsulfoxide. DRPLA. dentatorubral pallidoluysian atrophy. FRDA. friedreich’s ataxia. HAT. histone acetyltransferase. HD. huntington’s disease. HDAC. histone deacetylase. HDACi. histone deacetylase inhibitor. HSP. heat shock protein. IVC. individually ventilated cage. PD. parkinson’s disease. pERK. phospho-ERK. polyQ. polyglutamine. SAHA. suberoylanilide hydroxamic acid. SBMA. spinal and bulbar muscular atrophy 5.

(8) SCA. spinocerebellar ataxia. SMA. spinal muscular atrophy. TBP. TATA-box bingding protein. TG. transgenic. VPA. valproic acid. WT. wild type. 6.

(9) 研究背景脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxias) 脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxias; SCAs)，一般稱為小腦萎縮症，是一種體染色顯性遺傳漸進性的神經退化性疾病，因此也被稱作為顯性小腦共濟失調症(Autosomal dominant cerebellar ataxias; ADCAs)，依不同的致病基因，成為不同亞型，基因突變形式有多種，像是不同長度的 CAA/CAG 三核甘酸重複擴增，如 SCA1、SCA2、 SCA3、SCA6、SCA7、SCA8 和 SCA17；移碼突變(frameshift mutation)，如 SCA11 與 SCA27 等；錯義突變(missense mutation)，如 SCA5 與 SCA13 等，或是不明原因的類型，如 SCA4、SCA9 及 SCA16 等，目前已知的 SCA 亞型有三十七種(Serrano-Munuera et al. 2013, Jacobi, Minnerop et al. 2013, Orr, 2012, Matilla-Duenas 2012, Seidel, Siswanto et al. 2012)，由於是顯性遺傳疾病，所以對偶基因(allele)中只要有一條基因發生異常，就會有發病的可能。 SCA 的患者大多在中晚年發病，病患除了會有小腦萎縮的病理現象之外，SCA 的患者也會有 Purkinje cell 萎縮退化的情形發生，而在外顯病徵上則是會有步態不穩(gait instability)、四肢共濟失調 (ataxia)、肌力障礙(dystonia)、吞嚥困難以及認知功能障礙(cognitive deficit)等，而 SCA 的分類方式也有許多種，Harding 將臨床上的症狀 7.

(10) 當作依據，將 ADCA 分為三大類別(Harding, 1982)，第一類(ADCA Type I)最為常見，病徵包括小腦以及中樞神經的異常，這類的 SCA 有 SCA1、SCA2、SCA3、SCA4、SCA8、SCA12 以及 SCA17 等；第二類(ADCA Type II)則是在病徵上會出現視神經的異常退化，最具代表性的為 SCA7；第三類(ADCA Type III)是病徵只與小腦有關，有 SCA5、SCA6、SCA10、SCA11 以及 SCA14 等。. 多麩醯胺酸擴增疾病(Polyglutamine expansion diseases) 多麩醯胺酸擴增疾病(Polyglutamine expansion diseases)是由於在基因序列上轉譯區域有不正常的 CAA/CAG 三核甘酸(trinucleotide)重複擴增所引起的遺傳性神經退化性疾病，CAA/CAG 三核甘酸經由轉錄(transcription)以及轉譯(translation)後，會合成出帶有麩醯胺酸 (glutamine; Q)的蛋白質，帶有多麩醯胺酸(polyglutamine; polyQ)擴增的蛋白質會產生不正常的折疊，並在細胞核內或細胞質間形成聚集 (aggregation)，常會對神經細胞產生毒害，使得神經細胞的功能異常、發生退化甚至是死亡，造成運動行為上的失調(Di Prospero and Fischbeck, 2005)。目前對於許多 polyQ 疾病的機制研究還並未很明確，已知 polyQ 疾病多為神經疾病，主要發生神經功能異常的區域在中樞神經系統 8.

(11) (central nervous system; CNS)，不同的 polyQ 蛋白質，會導致不同的疾病，目前已知的 polyQ 疾病有十種，包括齒狀紅核蒼白球肌萎縮症 (Dentatorubral pallidoluysian atrophy; DRPLA)、亨丁頓舞蹈症 (Huntington’s disease; HD)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bulbar muscular atrophy; SBMA)以及七種脊髓小腦運動失調症 (Spinocerebellar ataxia; SCA)，包括 SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、 SCA8 和 SCA17 (Ingram, Orr et al. 2012, Jacobi, Minnerop et al. 2013)，隨著 polyQ 的重複擴增次數越多，患者會越早發病，且 polyQ 擴增的數目會有子代比親代越來越多的情形，稱為期望效應(anticipation) (Figiel et al., 2012, Switonski et al., 2012, Maltecca, Filla et al. 2003, Jacobi, Minnerop et al. 2013)。. 第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17) 第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17)是 SCA 的一種亞型，其發病是由於在 TBP 基因上的 CAA/CAG 三核甘酸過度重複擴增所引起 (Koide et al., 1999, Nakamura et al., 2001)，TBP 基因位於體染色體 6q27 的位置，一般正常的 CAA/CAG 三核甘酸重複數目約在 25 到 42 左右，當數目達到 43 或是以上時，就有可能會有發病的機會，重複擴增的次數越多，發病的時間一般也越早(Rolfs et al., 2003)。 TBP 是一個重要的轉錄起始因子，細胞在轉錄合成 RNA 時都需 9.

(12) 要 TBP 的參與才能夠執行。當基因要進行轉錄時，TBP 蛋白的 C 端會辨認啟動子上的 TATA box 並與 DNA 結合，而 CAA/CAG 三核甘酸重複的位置發生在 TBP 蛋白的 N 端，也是與其他轉錄因子以及 RNA 聚合酶結合的重要位置(Seipel et al., 1994, Hochheimer and Tjian, 2003)，因此 TBP 蛋白的 polyQ 不正常擴增可能影響細胞的轉錄，造成神經細胞的退化和病變，而清除 TBP 中的不正常聚集也成為許多研究治療 SCA17 的方向。 SCA17 在臨床症狀上有共濟失調、肌力障礙(dystonia)、癲癇 (seizures)以及癡呆(dementia)等(Rolfs et al., 2003)，並伴隨著小腦萎縮，尤其是 Purkinje cell 的退化，而我們也將 Purkinje cell 當作是研究 SCA17 的重要指標。. Purkinje cell Purkinje cell 是在小腦中特有的一種神經細胞，存在於小腦的分子層(molecular layer)以及顆粒層(granular layer)之間，在小腦中負責將輸入的感覺以及運動訊息加以整合，輸出形成動作的協調，一般被認為是小腦中的訊息處理中心，同時也是小腦中唯一將訊息輸出小腦皮質的神經細胞(Apps and Garwicz, 2005)。 Purkinje cell 雖然在小腦中扮演重要的角色，但 Purkinje cell 的數目卻不多，約只佔小腦總細胞數目的 0.1%(Altman and Bayer, 1996)， 10.

(13) 在許多 SCA 的疾病中都會看到 Purkinje cell 退化死亡的情形，所以 Purkinje cell 退化被認為是 SCA 指標性的病徵之一。小鼠小腦中的 Purkinje cell 約在胚胎時期的第 11 至第 13 天 (E11~E13)開始出現，並且在小鼠出生(P0)之後開始明顯移動(migrate) 並發育，Purkinje cell 的發育可分為三個階段，第一個階段(P1~P9) 細胞本體會快速生長，第一階段後期開始出現樹突(dendritic)，第二個階段(P9~P18)時樹突開始快速生長，第三階段(P18~P90)，樹突漸漸生長至成熟，此時細胞也開始發揮功能(Hendelman and Aggerwal, 1980, McKay and Turner, 2005, Tanaka et al., 2006)，利用專一表現在 Purkinje cell 中的蛋白 Purkinje cell protein 2 (pcp2/L7)啟動子 (promoter)所建立的基因轉殖小鼠(Zhang et al., 2001)，是許多人建立 SCA 動物模式研究之方式，而我們實驗室先前也利用 pcp2/L7 promoter 建立基因轉殖小鼠來對 SCA17 的病理做研究分析。. 初級細胞培養(Primary culture) 十九世紀之前，生物學的研究多用活體來進行實驗，雖然能夠直接反應出在活體上的效果，但卻因為個體太過於複雜，許多器官和組織交互的影響以及個體上的差異，造成每次實驗上的結果不同，難以直接得到較具體之結論，加上個體成本較高，所以漸漸開始出現了體 11.

(14) 外培養的相關研究，從器官的體外培養到組織的體外培養(tissue culture)，後來也出現了細胞的體外培養(cell culture)。初級細胞培養 (primary culture)是指將器官以及組織中的細胞直接從活體中分離出來，直接進行培養的一種技術，此種培養的細胞有一定的壽命，而且相較於一般細胞株而言，培養較為不易，但是卻有其優勢，因為培養的細胞是直接從器官或組織上取下來，所以能以最為接近在活體內的情況培養，也能容易的對細胞生存的環境做統一的管理，不易有其他因素來影響實驗的結果。我們將出生 0 到 1 天(P0~P1)的小鼠小腦取出，將小腦細胞進行初級細胞培養，並用此模式來進行初步篩藥，看藥物對於 Purkinje cell 是否有促進型態發展，以判斷藥物是否是對於 SCA17 有療效，篩藥的範圍主要為化學合成藥物(Chemical compound)，其中包括組織蛋白去乙醯酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor; HDACi)。. 組織蛋白去乙醯酶抑制劑(HDACi) 在 DNA 進行轉錄時，會受到基因修飾因子之影響，其中組織蛋白乙醯化酶(Histone acetyltransferase; HAT)會讓組蛋白乙醯化，使得染色體和組蛋白之間的結合較為鬆散，此時較易於進行轉錄，因此基因的活性(activity)會提高，相反的，組織蛋白去乙醯酶(Histone 12.

(15) deacetylase; HDAC)會讓組蛋白去乙醯化，使得染色體和組蛋白之間變得緊密，此時較不易進行轉錄，基因的活性便會降低，而組織蛋白去乙醯酶抑制劑(HDACi)會抑制組織蛋白去乙醯酶活性，讓染色體和組蛋白之間維持在較為鬆散的狀態，使得轉錄容易進行，提高基因活性(Marks et al., 2001)。哺乳類總共有 18 種 HDAC，依據結構的不同被區分為 4 型(class)，第 I 型(class I)包括 HDAC1、2、3 以及 8；HDAC4、5、6、7、9 以及 10 屬於第 II 型(class II)；HDAC11 屬於第 IV 型(class IV)，其餘屬於第 III 型(class III)，這 4 種型又被分為兩大類(family)，其中第 I 型、第 II 型和第 IV 型屬於第一類，這一類的轉錄調節有鋅參與作用(Zn2+ dependent)，第 III 型屬於第二類，轉錄調節有 NAD＋參與作用。在細胞中，不同的 HDAC 存在於不同的位置，第 I 型的 HDAC 存在於細胞核中，第 II 型與第 IV 型的 HDAC 存在於細胞及細胞質之中，而在不同的組織中各個 HDAC 的含量也有所不同，第 I 型的 HDAC 普遍表現在各個組織，第 II 型的 HDAC 在大腦、心臟、胎盤、胰臟及骨骼肌等組織，而第 IV 型的 HDAC 則主要存在於大腦、心臟、腎臟及骨骼肌(Simoes-Pires et al., 2013)。不同的 HDAC 發生突變可能引發不同的疾病，而針對不同的 HDAC 給予抑制，則可以對不同的疾病和病徵加以緩解治療，也有研 13.

(16) 究指出 HDAC 可以作用在非組蛋白的目標受質，像是 p53，調節細胞週期和細胞凋亡(apoptosis)，以抑制癌細胞的形成(Liu et al., 2014)，或是熱休克蛋白(Heat shock proteins; HSP) Hsp70，防止蛋白質的不正常聚集，以及核轉錄因子. -kappaB)，調節發炎反. 應(Inflammation)，進而影響癌細胞的形成過程等(Kim and Bae, 2011)，所以使用不同種類的 HDACi 是治療疾病需要考量之處。 HDACi 也可以依照結構和抑制的 HDAC 加以分類，醯基羥胺 (hydroxamic acids)，如 suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)、 belinostat、panobinostat (LBH589)等，可以抑制 HDAC I 和 II；短鏈脂肪酸(short chain fatty acids)，如 valproic acid (VPA)、sodium butyrate，能抑制 HDAC I 和 IIa；苯甲醯胺(Benzamide)，如 SNDX-275、entinostat，可以抑制 HDAC I，以及環形胜肽(cyclic peptide)，如 entinostat、apicidin，能抑制 HDAC I (Spiegel, Milstien et al. 2012, Gottesfeld, Rusche et al. 2013, Groselj, Sharma et al. 2013, Mohseni, Zabidi-Hussin et al. 2013)，已有的研究中指出，HDACi 對於一些癌症有療效，也能改善許多神經退化性疾病的病徵。已有許多 HDACi 治療神經退化性疾病的報導，像是用 SAHA 可以治療亨丁頓舞蹈症等(Hockly, Richon et al. 2003)；Sodium butyrate 可以治療阿茲海默症(Alzheimer’s disease; AD) (Govindarajan et al., 14.

(17) 2011)和帕金森氏症(St Laurent et al., 2013)；2-aminobenzamide 可以治療弗裏德賴希共濟失調(Friedreich’s ataxia; FRDA) (Gottesfeld, Rusche et al. 2013)。. M344 M344 全名為 4-(dimethylamino)-N-[7-(hydroxyamino)-7oxoheptyl]-benzamide，是苯甲醯胺(benzamide)化合物，同時也是一種 HDACi，能夠選擇性的抑制 HDAC1 和 HDAC6，其中，M344 抑制 HDAC6 的效率是 HDAC1 的 3 倍(Heltweg et al., 2004)，並且能夠提高組蛋白 H4 (histone H4)的乙醯化(acetylation)，在一些癌症以及神經退化性的疾病中都可以看到 M344 能夠有改善的效果，在癌症方面， M344 能阻止細胞的分化(differentiation)，並且讓癌細胞死亡(Jung et al., 1999)，在神經退化性疾病方面，在 AD 的病徵中會有不正常的 tau 蛋白堆積，而在細胞模式下，M344 可以有效抑制 HDAC6，並藉由抑制 HDAC6 來調控 Hsp70 及 Hsp90 以降解 tau 蛋白，有效減少 tau 蛋白的不正常堆積(Cook et al., 2012)，也有研究指出，在脊髓性肌肉萎縮症(Spinal muscular atrophy; SMA)的細胞模式中，M344 可以提高 SMN2 蛋白質的表現量(Riessland et al., 2006)。. 15.

(18) Droxinostat Droxinostat 全名為 4-(4-Chloro-2-methylphenoxy)-Nhydroxybutanamide，也是一種 HDACi，能夠選擇性的抑制 HDAC3, 6 以及 8，並且能提高組蛋白 H3 (histone H3)的乙醯化，由於抑制 HDAC3, 6 以及 8 能夠促進癌細胞死亡(Wood et al., 2010)，因此 Droxinostat 主要被用在癌症領域上的相關研究和實驗，研究指出， Droxinostat 可以使前列腺癌細胞(PPC-1 cell)發生凋亡作用(Mawji et al., 2007)，也可以降低乳癌細胞(MCF-7 cell)的存活率 (Bijangi-Vishehsaraei et al., 2010)，也有研究指出，Droxinostat 可以減緩帶有 PPC-1 cell 小鼠的腫瘤形成(Wood et al., 2010)，不過在癌症的領域中 Droxinostat 的作用機制還未被研究徹底，然而 Droxinostat 雖然有被運用在癌症的領域上，但是在神經退化性的疾病上目前還沒有 Droxinostat 的相關研究。. 16.

(19) 研究目的雖然已經知道 SCA17 是由於 TBP 基因不正常的 CAG 三核甘酸重複擴增所造成，以及 Purkinje cell 退化導致共濟失調的現象，但是對於 SCA17 的許多致病原因和機制並未被研究清楚，而且目前並無有效的治療的方法，因此我們致力於篩選有潛力改善 SCA17 病徵的藥物。本研究的第一個階段是利用 SCA17 基因轉殖小鼠小腦進行細胞初級培養，並以此模式進行 HDACi 以及化學合成藥物的評估，以細胞的層面去檢視 Purkinje cell 是否會因為給予藥物而有更好的型態，以此模式找出有潛力藥物。第二個階段是以較有潛力的藥物進入 SCA17 基因轉殖小鼠的動物實驗，我們用腹腔注射的方式將藥物打入小鼠體中，觀察小鼠的平衡和步態等行為，分析藥物對於 SCA17 小鼠的運動行為和病徵是否有改善的作用，並將小 SCA17 小鼠的小腦做切片染色，進行病理分析。希望藉此平台發現對 SCA17 可能具有潛力之小分子化合物。. 17.

(20) 材料與方法 SCA17 基因轉殖小鼠我們實驗室先前已經建立完成 FVB 品系的 SCA17 基因轉殖小鼠，由 pcp2/L7 啟動子帶 109 poly-glutamine (109Q)的 human TBP (hTBP) 基因(Chang et al., 2011)。FVB 的野生型母鼠(wildtype female mice)購買自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center, Taipei, Taiwan)與 SCA17 公鼠配種維持異型合子(heterozygous)的基因轉殖小鼠。基因轉殖小鼠約在出生 4 週後慢慢開始出現病徵，包括共濟失調、肌力障礙以及癲癇等(Chang et al., 2011)，隨著小鼠年紀增長，病徵會越來越明顯。我們將小鼠養在獨立換氣飼育系統(Individually Ventilated Cage; IVC)中，並將環境控制在 12 小時光照和 12 小時黑暗的循環下，所有的動物實驗過程及執行都是根據國立台灣師範大學實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of National Taiwan Normal University, Taipei, Taiwan)的規則運作。. DNA 萃取(DNA extraction)與聚合酶連鎖反應(PCR)及基因型分析 (Genotyping) 我們取下小鼠的小部分組織到 0.2 ml 的微量離心管(eppendorf)中，並添加 Direct-PCR reagent (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA)以 18.

(21) 及 0.5 mg/ml 的 proteinase K (Bionovas, ON, Canada)以 55℃反應 5.5 個小時，再以 85℃，45 分鐘反應來停止 proteinase K 的活性，最後將此 DNA 樣品放至-20℃保存，並以此樣品進行基因型分析。我們使用兩對引子(primer)來進行聚合酶連鎖反應作基因型分析，其中 pl-7 的正向引子(5' - TAT GGT GAG AGC AGA GAT GG - 3')和 TBP3R 的反向引子(5'- CTGCT GGGAC GTTGA CTGCT G -3')，用以進行 SCA17 的基因型分析；SRY 的正向引子(5' - AGA GAT CAG CAA GCA GCT GG - 3')和 SRY 的反向引子(5' - TCT TGC CTG TAT GTG ATG GC - 3')則作為小鼠性別的鑑定。 PCR 聚合反應器(PC-818A, ASTEC, Fukuka, Japan)的反應條件為 95℃1 分鐘使 DNA 雙股裂解(denature)，65℃1 分鐘以進行引子黏合 (annealing)，此步驟每經一個循環會降低 0.1℃，最後以 72℃進行延長(elongation)，總共進行 25 個循環，反應完成後之產物以 2％的瓊脂膠體(agarose, Genetek Biosciences, Maharashtra, India)進行 DNA 電泳， pl-7/TBP3R 片段的大小為 769 個鹼基對(base pair)，SRY 的片段大小為 294 個鹼基對。. 小腦初級細胞培養(Cerebellar primary culture) 我們根據幾篇文獻建立出小腦初級細胞培養的實驗流程(Gruol and Franklin, 1987, Furuya et al., 1998, Gimenez-Cassina et al., 2007, 19.

(22) Tanaka et al., 2009)，將出生 0 到 1 天(P0~P1)的小鼠犧牲後將小腦分離出來，剪成碎塊後置於 200 l 培養液中，其中含有 0.05%的胰蛋白酶(trypsin/EDTA, GIBCO, Auckland, New Zealand)和 20 U/ml 去氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease I; DNase-1, Worthington, Vassar Avenue, Lakewood, New Jersey, USA)，於 37℃反應 15 分鐘，離心(100 g, 5 分鐘; Thermo 75002411, Langenselbold, Germany) 除去上清液，加入含有 10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, Invitrogen, New York, Grand Island, USA)及 20 U/ml DNase-1 的 200 l 培養液，來停止蛋白降解反應，並將細胞以 200 μl 微量吸管(pipet)打散，經離心除去上清液後，以 200 l 無血清的培養液潤洗，再離心除去上清液後，用含有 1% FBS 的培養液 500 l 打散細胞，最後將 100 l 的細胞(細胞數約 1 x 106/ml)置入以 100 μg/ml 多聚離胺酸(poly-L-lysine, Sigma, St. Louis, MO, USA)塗佈過的 96 孔細胞盤中。我們所使用的細胞培養液是以 NEUROBASAL® medium ( GIBCO, Carlsbad, CA, USA)，加上 2% B-27 (GIBCO)、1 mM adenine (Sigma)、2 mM GlutaMax-I (GIBCO)、3 mM KCl (Sigma)、5μg/ml Gentamicin (GIBCO)、100 U/ml Penicillin 和 100 g/ml Streptomycin (GIBCO)。. 20.

(23) 初級細胞培養的藥物處理方式在細胞培養隔天(DIV1)將培養液換成無血清的培養液，到了培養的第 5 天(DIV5)以藥物處理，第 10 天(DIV10)以及第 15 天(DIV15)將一半的培養液更換成含有相同濃度的藥物的新鮮培養液，到了易於觀察 TBP 不正常聚集的第 18 天(DIV18)時將細胞進行固定染色，對照組則只加入溶解藥物之溶劑二甲基亞碸(dimethylsulfoxide; DMSO, Sigma)進行處理。. 小鼠的給藥方式依照小鼠的平均體重給予藥物劑量，M344 為 9.22 mg/kg， Droxinostat 為 12.57 mg/kg，藥物溶於 DMSO 中，採用腹腔注射 (intraperitoneal injection)的方式將藥物打入小鼠體內，打藥位置以左右側腹部輪流進行。. 細胞免疫化學染色(Immunocytochemistry) 初級細胞培養到 DIV18 時，我們以 4℃的 4%多聚甲醛 (paraformaldehyde; PFA, Sigma)固定細胞，隨後用 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100)進行 3 次潤洗，在細胞膜上打洞，接著以含有 10% FBS 的 PBST 進行阻斷(blocking)，反應溫度為 37℃，2 小時，再以含有 5%FBS 的 PBST 稀釋初級抗體(primary antibody) (參考抗體列表 1) 21.

(24) 進行染色，於 4℃反應一個晚上，隔天用 PBST 進行 3 次潤洗，隨後以含有 5% FBS 的 PBST 稀釋螢光二級抗體(secondary antibody) (參考抗體列表 2) ，於 37℃反應 1 小時，並用 PBST 稀釋 4',6-二脒基-2苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole; DAPI, 1:5000, Sigma)染細胞核 10 分鐘，最後用高通量顯微影像擷取系統(High throughput scanning system, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)進行觀察，並用 MetaXpress application software (Molecular Devices)分析。. 行為測驗(Behavioral test) A.滾輪測試(Rotarod task) 小鼠的滾輪測試用以評估小鼠運動協調和平衡，根據小鼠可以持續在滾輪上所跑動的時間，我們得以知道小鼠的協調能力情形，我們所使用的儀器是 5 條走道的同軸滾輪(Mouse ROTA-ROD, UGO BASILE, Italy)，當小鼠從滾輪上掉下時，便會壓到下方的踏板，停止計時，我們每 2 週會進行 1 次的滾輪測試，在開始測驗前，我們會先對小鼠進行 2 天的手部適應處理(handling)，讓小鼠待在手上並計時 2 分鐘，每隻要進行滾輪測試的小鼠都須進行此步驟，1 天 1 次，總共 2 天，之後進行 1 天預先的訓練(training)，我們會先將小鼠放在機器上靜置 1 分鐘，接著以 4 rpm 的轉速進行 1 分鐘，總共 3 次，每一次的間隔為 10 分鐘，然後進入 2 天的正式測驗，正式測驗時一次 22.

(25) 進行 10 分鐘，前 5 分鐘時，滾輪的轉速會從 4 rpm 以等加速度的方式加速到 30 rpm，之後的 5 分鐘轉速維持在 30 rpm，每一天進行 3 次，2 天一共 6 次，每 1 次的間隔為 15 分鐘。. B.步態分析(footprint) 藉由小鼠的步態規律和步伐的參數以觀察小鼠的平衡能力是否有改善，每次實驗前我們會先用步態分析系統(CatWalk® XT system, Noldus, Wageningen, The Netherlands)自動偵測並設定小鼠步伐的敏感度，隨後進行正式的測驗，以抓著小鼠尾巴的方式將小鼠由儀器偵測走道的一端放入，讓小鼠在走道中穿梭，並且由 CatWalk® software (Noldus)辨識小鼠的腳印，並進行分析和統計。. C.運動能力分析(locomoter) 將小鼠放進一個黑色的無上蓋正方形箱子中(30 x 30 x 30 公分)，讓小鼠在裡面自由行走 10 分鐘，並於上方以攝影系統紀錄小鼠之活動軌跡再以 EthoVision® XT software (Noldus)對小鼠的移動距離 (distance)、移動速度(velocity)以及處在代表低焦慮感的中間區域 (center)和高焦慮感的周圍區域(peripheral)的時間進行統計分析。. D. 飼養籠內行為分析(Homecage) 飼養籠內行為分析是一種用來分析小鼠日常行為的監測系統，藉 23.

(26) 由錄影紀錄的方式，再對小鼠的動作進行分析，以觀察是否在行為上出現異常。我們會先將待分析的小鼠獨自置於鼠籠，放在錄影的環境中一個晚上，讓小鼠習慣該環境之後，對小鼠進行 12 小時的錄影，藉由 Home Cage Scan (Clever Sys. Inc., Reston, VA, USA)系統進行監測和分析各組小鼠之間的日常行為是否有受到藥物之影響。. 小腦切片將小鼠以 Avertin (0.4 g/kg body weight; Sigma)麻醉後，用 0.9%生理食鹽水(saline)對小鼠進行灌流(perfusion)，再以 4%PFA 進行灌流固定，然後將小腦取出，泡在 4% PFA 中進行後固定 4 個小時，再依序以 10%蔗糖溶液(sucrose)1 小時、20%蔗糖溶液 2 小時和 30%蔗糖溶液 12-16 小時進行脫水，最後將小腦保存於-80℃。將小腦置放於-20℃一天後，再用冷凍切片機(LEICA CM3050S, Nussloch, Germany)進行 30 μm 厚度的冷凍切片(cryosections)。. 小腦切片免疫螢光染色(Immunoflourescence staining) 首先我們會用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)對腦片進行 3 次潤洗，並在細胞膜上打洞，接著以含有 10％FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100)於 4℃反應一晚進行阻斷(blocking)，然後用含有 5% FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100)稀釋初級抗體(參考抗 24.

(27) 體列表 1)進行染色，與腦片於 4℃作用一晚，接著用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)對腦片再進行 3 次潤洗，隨後以含有 5%FBS 的 PBST (PBS 含有 0.2% Triton X-100）稀釋螢光二級抗體(參考抗體列表 2) 做組織免疫染色，於 37℃反應 2 小時，並用 PBST (PBS 含有 1% Triton X-100)稀釋之 DAPI (1:5000)染細胞核 30 分鐘，最後再以封片膠 (Fluoromount-G, Southern Biotech, Los Angeles, CA, USA)將腦片置於玻片上，並且蓋上蓋玻片，使用共軛焦顯微鏡系統(Leica TCS SP2 confocal spectral microscope imaging system, Wetzlar, Germany)對螢光免疫染色後的小腦腦片進行拍攝和分析。. HDAC 活性分析我們使用 HDAC-Glo™ I/II Assay and Screening System (Promega, Madison, Wisconsin, USA)來對小鼠的小腦進行 HDAC 的活性分析，在冰上取出 WT 成鼠小腦後，取出其小腦中的蛋白質，進行定量，以 PBS 序列稀釋為 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125 ng/l 當作 protein source，將 HDAC-Glo™ I/II Substrate 用 10 ml HDAC-Glo™ I/II Buffer 回溶，靜置 10 分鐘，再以 1：1000 加入 Developer Reagent，當作 HDAC substrate solution，最後以 20 l protein source 加上 20 l HDAC substrate solution 以及 10 l ddH2O 混合，使用 Microplate 25.

(28) Spectrophotometer (BioTek Quant™, Winooski, Vermont, USA)在 470 nm 波長下進行冷光讀值，求出在 80％ HDAC 活性之蛋白質濃度，隨後再以此濃度配置 protein source，以 20 l protein source 加上 20 l HDAC substrate solution 以及 10 l 待測藥物混合，求出在該藥物濃度下小鼠小腦中的 HDAC 活性。. 西方墨點法(Western blot) 將小鼠的小腦取出，並加入五倍體積的 RIPA 緩衝液(RIPA lysis buffer)[5 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% DOS, 1% NP40]、1%蛋白酶抑制劑(protease inhibitor, #78425, Thermo)以及 1%磷酸水解酶抑制劑(phosphatase inhibitor, #P2850, Sigma)後，利用均質機(Next Advance, NY, USA)，速度 3，3 分鐘將小腦打碎，冰上靜置 30 分鐘後，以 14000 g 離心 30 分鐘，抽取上清液蛋白質，之後再用二羧基二喹啉(bicinchoninic acid; BCA, Pierce, Rockford, USA)對蛋白質進行定量。將 25 g 的蛋白質以聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-page)分離，並且轉漬到聚氟化二乙烯膜(polyvinylidene fluoride member; PVDF member, Millipore)上，接著用 ddH2O 配置 5%的奶粉在室溫 blocking 2 個小時，再用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)稀釋初級抗體(參考抗體列表 1)，4℃反應 26.

(29) 一個晚上，隨後用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)潤洗 3 次，每次 15 分鐘，再用 TBST (TBS 含有 0.05% Tween-20)稀釋二級抗體(參考抗體列表 2)，室溫反應 2 小時，最後再潤洗 3 次，接著以 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, MA, USA )反應，最後用 LAS-4000 chemiluminescence detection system (Fujifilm, Tokyo, Japan)進行拍照和分析。. 統計和分析細胞培養和動物行為測驗中的比較都是用單因子變異數分析 (One-way ANOVA test)進行(SPSS version 20; SPSS INC, Illinois, USA)，所有實驗數值以 Mean±S.E.M 表示，當 P < 0.05 時代表統計上有顯著差異。. 27.

(30) 研究結果建立 SCA17 的 TG 小鼠初級細胞培養作為篩藥初步系統我們將出生後 0 到 1 天(P0~P1)的 WT 以及 SCA17 TG 小鼠小腦取出來做初級細胞培養，流程圖如圖 1A，培養一天後(DIV1)換成無血清的培養液，之後會於 DIV5、DIV10 級 DIV15 更換培養液，於 DIV18 進行細胞免疫螢光染色(ICC)。我們使用 IP3R1 抗體來偵測 Purkinje cell，觀察 Purkinje cell 的型態。由染色結果發現 WT 和 TG 小鼠間的 Purkinje cell 在型態上有所不同(圖 1B)，TG 小鼠 Purkinje cell 的神經突伸展(neurite length)比 WT 小鼠為短，此結果說明 SCA17 的 TG 小鼠 Purkinje cell 生長較差，因此我們利用 SCA17 小鼠的小腦初級細胞培養模式測試藥物的效果，希望以此模式初步篩選出可能對於 SCA17 小鼠的病徵有改善潛力的藥物。. 篩選可以提升 SCA17 小腦 Purkinje cell neurite length 之化合物在藥物測試的過程中，我們在初級細胞培養 DIV5 時將培養液換成添加藥物的培養液，除了 neurite length 之外，我們也以 Purkinje cell 的數目作為藥物毒性粗略判斷的依據。我們所使用的藥物包含由國立台灣師範大學化學系姚清發教授 (Dr. Ching-Fa Yao, Chemistry Department of National Taiwan Normal 28.

(31) University)所合成提供的 NC038、NC039、NC002 系列、NC004 系列、 NC005 系列化合物以及購買自 Enamine 及 Exclusive Chemistry 的 HDACi 化合物(NC100 系列)。我們以 0.1 nM、1 nM 以及 10 nM 藥物濃度進行初步的測試。由染色結果看到給予 NC038 (10 nM)及 NC039 (10 nM)處理後， Purkinje cell 之 neurite length 長度有稍微被提升(圖 2)，而且 Purkinje cell 的數目並沒有隨著藥物濃度上升而減少，代表所使用藥物濃度並不會對 Purkinje cell 造成太高毒性。 NC004 系列的篩藥結果如圖 3 所示，隨著 NC004-1 濃度的增加， neurite length 有稍微上升的趨勢，但是並沒有達到顯著的差異，而在 Purkinje cell 數目上並沒有太大的變化，NC004-6 在 10 nM 的濃度下 neurite length 同樣有上升，而 Purkinje cell 數目則是上升達顯著差異，表示在 10 nM 的濃度下不會對 Purkinje cell 造成毒性，對於 Purkinje cell 的生長可能具有潛力。 NC005 系列的篩藥結果如圖 4，Purkinje cell 的 neurite length 以及細胞數均無明顯的差異。 HDACi 化合物之處理結果如圖 5，以 10 nM NC105 處理細胞後， Purkinje cell 的 neurite length 有顯著性的上升，Purkinje cell 數目也稍微提升。以 10 nM NC106 處理細胞後，Purkinje cell 的 neurite length 29.

(32) 有顯著性的上升，而 Purkinje cell 數目有稍微下降，10 nM 之 NC106 可能對 Purkinje cell 有些毒性。以 10 nM NC112 處理培養的小腦細胞後，neurite length 有上升的趨勢(圖 5)，但是並未達顯差。由以上結果看來，NC105 以及 NC106 可能對於 SCA17 小鼠 Purkinje cell 退化有改善的潛力。在我們的另外一套篩藥模式 SCA17 的小腦組織切片培養(Slice culture)中，NC105 (M344)以及 NC109 (Droxinostat)均能夠顯著的改善 TBP 聚集(陶, 2013)，因此我們針對 NC105 (M344)與 NC109 (Droxinostat)作進一步研究。. M344 及 Droxinostat 抑制成鼠小腦的 HDAC 活性我們將成鼠小腦的蛋白萃取出來，進行 HDAC 的活性測試，以 TSA 作為正控制組，分別分析 M344 及 Droxinostat 對於小腦組織 HDAC 活性的抑制效果。結果顯示，M344 及 Droxinostat 皆可有效抑制成鼠小腦中的 HDAC，M344 之 IC50 為 1.26 nM，Droxinostat 之 IC50 為 1.92 M，所以 M344 的抑制能力應較 Droxinostat 強(圖 6)。. M344 及 Droxinostat 對 SCA17 小鼠體重增加並無影響我們先將 HDACi 化合物 M344 及 Droxinostat 進行小量動物的預試驗(圖 7A)，以腹腔注射的方式將藥物打入 SCA17 TG 小鼠，M344 注射劑量為 9.22 mg/kg，Droxinostat 注射的劑量為 12.57 mg/kg，從小 30.

(33) 鼠三週大時開始每隔一天注射一次，並每週測量小鼠的體重。從 3~9 週期間測量體重的結果我們發現給予 M344 或 Droxinostat 小鼠的體重與 vehicle 組別並無差異(圖 7B)，因此初步推論這兩個化合物可能對小鼠不致造成明顯的傷害。. M344 以及 Droxinostat 處理可增加 SCA17 小鼠之活動協調性我們用 rotarod 試驗來評估小鼠的運動協調及平衡能力，由於 SCA 的小鼠平衡能力較差，可以停留在 rotarod 之時間較短(Chang et al., 2011)，藉由給藥後小鼠停留在 rotarod 上面的時間長短，我們可以評估藥物對於小鼠運動失調的效果。根據我們每兩週測試一次的結果，給予 M344 以及 Droxinostat 的 SCA17 小鼠雖然與 vehicle 的小鼠在 rotarod 上的時間並沒有顯著的差異，但是 M344 以及 Droxinostat 處理組別的 SCA17 小鼠隨著年紀增加停留在 rotarod 上的時間有增長(圖 7C)，我們初步認為 M344 以及 Droxinostat 有潛力改善 SCA17 的小鼠運動協調能力。. M344 以及 Droxinostat 對 SCA17 小鼠過動以及焦慮行為的影響 SCA17 的小鼠有過動(hyperactivity)的現象，在 locomotor 的行為試驗中會有移動距離較長的情形(Chang et al., 2011)，因此我們對小鼠做了 locomotor 的分析以了解給藥之後是否能對其過動的病徵有所改 31.

(34) 善。實驗的結果顯示，分別給予 M344 以及 Droxinostat 之處理後， SCA17 小鼠的移動距離並沒有明顯改變(圖 7D)。我們也以 locomotor 對小鼠的焦慮行為做了分析，根據先前的文獻指出，在 locomotor 這項測驗中，若是小鼠跑動在周邊區域的時間較長，代表小鼠較為焦慮，反之跑動在中間區域的時間較短，代表較沒有焦慮反應(El Idrissi et al., 2009)，我們用這項測驗來觀察藥物是否增加小鼠的焦慮感，以便了解藥物是否對小鼠有不良反應。測驗的結果顯示，給予 M344 以及 Droxinostat 組別的 SCA17 小鼠與控制組在周圍區域以及中間區域的時間並沒有差異(圖 7D)，代表小鼠的焦慮感並沒有因為藥物處理而提高。. M344 及 Droxinostat 改善 SCA17 小鼠 Purkinje cell 型態，降低 TBP 聚集，並提高組蛋白乙醯化程度行為分析結束後我們將小鼠犧牲，對小腦進行冷凍切片與後續的免疫螢光染色，分析藥物對病理之影響。給予 M344 以及 Droxinostat 的組別在 Purkinje cell 的排列上皆比 vehicle 組整齊，分子層(molecular layer)也比 vehicle 組有較茂密之 neurite，而在 TBP 聚集的部分，給藥組的螢光強度也較 vehicle 組弱，統計的結果可以看到藥物對 TBP 聚集有顯著的改善(圖 8A)，已知 32.

(35) SCA17 的小鼠會有膠細胞增生(gliosis)的情形發生(Chang et al., 2011)，所以我們也對此做了染色觀察，結果顯示，M344 以及 Droxinostat 能明顯的改善膠細胞增生的情形(圖 8B)，我們也進行了組蛋白乙醯化分析，結果顯示 M344 以及 Droxinostat 均能夠提高組蛋白乙醯化程度，其中又以 Droxinostat 的作用較為明顯(圖 9)。. M344 及 Droxinostat 在大量試驗中並不影響小鼠的體重和小腦腦重由小量動物預試驗我們認為 M344 及 Droxinostat 對於 SCA17 小鼠的病徵有改善的潛力，因此我們將 M344 和 Droxinostat 使用於較大量之動物實驗(圖 10A)，同樣以腹腔注射的方式將藥物打入小鼠體中，並以 WT 和 SCA17 TG 小鼠同時進行實驗，M344 注射劑量同樣為 9.22 mg/kg，Droxinostat 注射的劑量為 12.57 mg/kg，從小鼠四週大時開始注射，由於小量預試驗時我們認為用藥的劑量不會造成過多毒性，為了提升藥物的效果，改為每天注射一次，並每週測量小鼠的體重。由體重的結果看到，TG 的小鼠體重皆比 WT 小鼠要輕，不過並沒有達到顯著差異，而施打 M344 和 Droxinostat 之後並不會影響小鼠的體重，所以這兩支 HDACi 對小鼠應不會造成明顯的傷害(圖 10B)。小鼠的小腦腦重測量結果證實 TG 小鼠小腦明顯輕於 WT 小鼠 (Chang et al., 2011)，施打 M344 和 Droxinostat 可稍微提升小腦重，但並未達顯差(圖 10C)。 33.

(36) 施打 M344 以及 Droxinostat 可增加 SCA17 小鼠之活動協調性施打 M344 和 Droxinostat 的 WT 及 TG 小鼠每兩週進行一次 rotarod 測驗，由結果可以發現，從第六週開始，TG 小鼠在 rotarod 上跑動的時間明顯少於 WT 小鼠，從第十週開始，施打 Droxinostat 的 TG 小鼠在 rotarod 上跑動的時間明顯高於 TG vehicle 組的小鼠，到了第十四週時雖然在 rotarod 上跑動的時間有減少，但還是明顯多於 TG vehicle 組的小鼠，而施打 M344 的 TG 小鼠則是有越跑越好的趨勢，到了第十四週即顯著高於 TG vehicle 組的小鼠(圖 10D)，因此我們認為 M344 和 Droxinostat 能夠改善 SCA17 的小鼠運動協調能力。. M344 以及 Droxinostat 並未影響小鼠的過動、焦慮以及步態我們在第九週時對小鼠進行 homecage，第十一週時進行 locomotor，以觀察 M344 和 Droxinostat 是否影響小鼠的日常行為、過動及焦慮，在 homecage 的實驗中，吃飼料及伸展身體的次數各個組別的小鼠並沒有看到明顯的差異(圖 11A)，而在 locomotor 的測驗中的路徑圖可以看到，TG 小鼠在周圍區域行走的比例較多(圖 11B)，而統計的結果發現 TG 的小鼠由於會有過動的現象，在相同時間內行走的距離明顯比 WT 小鼠要長，而給予 M344 和 Droxinostat 之後並不影響小鼠的行走距離和速度，TG 小鼠在中間區域行走的時間比起 34.

(37) WT 小鼠明顯要少，施打 M344 和 Droxinostat 之後 TG 小鼠在中間區域待的時間有得到提升(圖 11C)，但 M344 組並未達顯差，由這部分的結果說明，M344 和 Droxinostat 並不會影響小鼠的過動現象，同時 Droxinostat 也降低了小鼠的焦慮感。我們在第十二週時對小鼠進行了 footprinting 步態分析，結果顯示給予 TG vehicle 小鼠由於步態不穩，後腳步寬明顯長於 WT vehicle 小鼠，施打 M344 和 Droxinostat 之後並未改善這種狀況，卻發現 WT 組之步寬下降，與 WT vehicle 組出現顯差，而在步伐規律程度的結果看到，WT 與 TG 之間並沒有明顯的不同，TG 給藥的組別和 TG vehicle 組別之間也沒有明顯的差異(圖 11D)，所以我們認為 M344 和 Droxinostat 並不會影響到小鼠的步態。. Droxinostat 及 M344 對小鼠小腦病徵之影響進行完小鼠行為分析後，我們將十四週大之小鼠犧牲，以小腦切片進行免疫螢光染色分析，calbindin 染色結果發現 WT 小鼠的 Purkinje cell 型態較 TG 小鼠飽滿健康，分子層也較厚，排列較緊密，施打 M344 及 Droxinostat 後，TG 小鼠分子層生長比起 vehicle 組更為茂密，同時也看到施打 Droxinostat 後 TG 小鼠的 Purkinje cell 排列比 vehicle 組整齊。在 WT 小鼠的腦片中並沒有看到 TBP 聚集的訊號，在 TG vehicle 組的腦片中則可以看到明顯的 TBP 聚集在 Purkinje cell， 35.

(38) 施打 M344 之後 TBP 聚集的情況看起來與 TG vehicle 組別並沒有太大的差異，而施打 Droxinostat 之後的 TBP 的訊號明顯變弱(圖 12A)，對 TBP 聚集的比例進行定量之後，我們發現 Droxinostat 能夠顯著的降低 TBP 的聚集(圖 12B)。 GFAP 的螢光染色部分則可以看到 TG 小鼠明顯高於 WT 小鼠，但給予 M344 和 Droxinostat 之後所造成的影響並不明顯(圖 12C)。進行 western blot 分析可以看到，TG vehicle 的小鼠 calbindin 的表現量明顯低於 WT vehicle 小鼠，表示 TG 小鼠的 Purkinje cell 確實有退化的情形，而施打 M344 和 Droxinostat 之後 TG 小鼠的 calbindin 並無明顯提升(圖 12D)，此結果與圖 11 之螢光圖結果並不相符，有可能是 Purkinje cell 的改善不夠明顯，未達統計上的顯著差異。 GFAP 的 western blot 分析結果顯示 TG vehicle 的小鼠蛋白質表現量明顯高於 WT vehicle 小鼠，雖然施打 Droxinostat 之後並無改善 TG 小鼠 gliosis 的情況，但是施打 M344 後 TG 小鼠的 GFAP 蛋白質表現量有顯著下降(圖 12D)，因此我們認為 M344 可以稍微改善 SCA17 TG 小鼠的 gliosis。. M344 以及 Droxinostat 並不改變小鼠小腦的 H3 與 H4 之乙醯化程度此外，WT vehicle 和 TG vehicle 小鼠的 AcH3 表現量並無明顯的不同，而給予 M344 以及 Droxinostat 之後看起來也沒有明顯的提升 36.

(39) AcH3 (圖 13-A)。 AcH4 的螢光染色結果與 AcH3 相似，WT 和 TG 之間並無明顯的差異，而給予 M344 以及 Droxinostat 之後並沒出現小量預試驗時觀察到的的提升現象(圖 13-B)。我們也用 western blot 分析小鼠小腦中的 AcH3 和 AcH4 蛋白質表現量，由實驗的結果得到 WT 和 TG 小鼠之間的 AcH3 和 AcH4 蛋白質表現量並沒有明顯的差異，而不管是 WT 或是 SCA17 的 TG 小鼠在給予 M344 和 Droxinostat 之後，小腦中的 AcH3 和 AcH4 表現量皆沒有得到預期之提升(圖 13C). 施打 M344 以及 Droxinostat 降低小腦 pERK 的表現量 pERK 在細胞存活途徑中扮演重要的角色，有神經保護的作用 (Chen and Sidhu, 2005)，在先前的文獻中我們發現 SAC17 的 TG 小鼠會有 S100以及 pERK 明顯升高的現象(Chang et al., 2011)，我們認為有可能是神經受損引發了 pERK 的反應，同時也有文獻指出 S100會促進神經細胞的存活，在神經細胞受損時會有增加的現象，同時藉由磷酸化 ERK 以達到保護神經的效果(Donato, 2001, Villarreal et al., 2014)。我們之螢光染色的結果也可以看到 TG vehicle 組的小鼠比 WT vehicle 組的小鼠 S100以及 pERK 的螢光強度都有較強的現象，施打 M344 以及 Droxinostat 之後 S100有下降的趨勢(圖 14A)，而施打 37.

(40) M344 後 pERK 有稍微的下降，施打 Droxinostat 之後 pERK 下降的趨勢較為明顯(圖 14A)。用 western 觀察小鼠小腦中的 pERK 表現量，證實 SCA17 的 TG 小鼠比起 WT 的小鼠其 pERK 有顯著提高的現象，施打 M344 之後， TG 小鼠 pERK 的情況並沒有改變，但是在施打 Droxinostat 之後我們發現 pERK 有顯著性的下降(圖 14B)，結果與免疫螢光分析結果一致。. 施打 M344 以及 Droxinostat 並不影響小鼠小腦的 BDNF 表現量 BDNF (brain-derived neurotrophic factor)是一種重要的神經生長因子，在小腦中 BDNF 能夠保護神經細胞，同時能促進 Purkinje cell 的生長(Dieni and Rees, 2002, Ohira et al., 2004)，也有研究指出增加 BDNF 能夠改善 SCA 的病徵(Chuang et al., 2009, Hourez et al., 2011)。我們也對 BDNF 進行了染色分析，TG 小鼠的 BDNF 訊號較 WT 低，而施打 M344 之後 TG 小鼠的 BDNF 螢光強度有稍增強，但並不明顯，而施打 Droxinostat 之後 TG 小鼠的 BDNF 螢光強度和 vehicle 組並沒有差異(圖 15)。. 38.

(41) 在大量試驗中施打 M344 能提高小鼠小腦 HSP70 及 HSP90 的蛋白質表現量先前的文獻中指出，熱休克蛋白 HSP40 與 HSP110 能夠幫助蛋白質的正常折疊(Kuo et al., 2013)，如果提高 HSP40 以及 HSP110 可以改善神經退化性疾病的病徵(Kalia et al., 2010, Popiel et al., 2012, Kuo et al., 2013, Torrente and Shorter, 2014)，也有文獻指出 HSP70 能夠協助蛋白質正常摺疊，抑制神經毒性並有神經保護的作用(Witt, 2010, Shukla et al., 2014)，也有研究指出，在 AD 的細胞模式下，給予 M344 能夠藉由調節 HSP90 以降低 tau 的不正常堆積，達到改善的效果(Cook et al., 2012)，因此我們也分析 M344 和 Droxinostat 對 HSP40、HSP70、 HSP90 以及 HSP110 的蛋白質表現量是否有所影響。由 western blot 分析的結果可以看到，TG 小鼠 HSP40、HSP90 以及 HSP110 均比起 WT 小鼠顯著的下降，TG 小鼠的 HSP70 亦較 WT 低，而給予 M344 以及 Droxinostat 之後，TG 小鼠的 HSP40 以及 HSP110 並沒有明顯改變，但是在 TG 施打 M344 的組別之 HSP70 以及 HSP90 有顯著性的提高(圖 16)。. 施打 M344 以及 Droxinostat 能提高-tubulin 的乙醯化程度微管(microtubule)是存在於細胞中的一種細胞骨架，其構型是由 微管蛋白(-tubulin)及微管蛋白(tubulin)形成二聚體蛋白後，再螺 39.

(42) 旋盤繞所形成，為一長管狀的胞器結構，有維持細胞型態和協助細胞內運輸等功能，並且參與紡錘體、纖毛、鞭毛及中心粒的形成過程 (Weisenberg, 1972, Yang et al., 2010, Li et al., 2012, Romaniello et al., 2014)。 HAT 以及 HDAC 也會作用在 non-histone 的蛋白質上，像是 HSP70、 HSP90 以及-tubulin 上，在先前的研究中指出，HDAC6 與-tubulin 的乙醯化息息相關，在細胞模式下，給予 HDAC6 的抑制劑 TSA 之後，能夠顯著的提升-tubulin 的乙醯化程度(Hubbert et al., 2002, Haggarty et al., 2003)，有研究指出 HD 會有微管受損以致於造成神經毒性的現象，藉由提高-tubulin 的乙醯化之後，可以讓神經細胞受到保護(Dompierre et al., 2007)，也有研究指出，在細胞以及果蠅的模式中，增加-tubulin 的乙醯化可以減緩多巴胺神經元(dopaminergic neurons)的受損(Outeiro et al., 2007)，藉由以 HDACi 增加-tubulin 的乙醯化能夠提供神經保護的效果，改善神經受損的情形，因此我們也對-tubulin 的乙醯化程度進行了 western blot 的觀察。 Western blot 結果我們發現，在施打 M344 和 Droxinostat 之後， WT 小鼠-tubulin 乙醯化程度與 vehicle 組沒有明顯差異，而 TG 小鼠的-tubulin 有明顯的被乙醯化的現象，與 vehicle 組出現顯著差異(圖 17)。. 40.

(43) 討論我們以 SCA17 的小鼠建立出 SCA17 小鼠小腦的初級細胞培養模式，用這套模式系統以觀察小鼠小腦中特有的神經細胞 Purkinje cell，並篩選能改善 Purkinje cell 退化的藥物。將各種化合物施用於 SCA17 小鼠小腦的初級細胞培養，我們發現 NC105 及 NC106 HDACi 能夠明顯的增加 Purkinje cell neurite length，而 NC038、NC004-1、NC004-6 以及 NC112 雖然沒有顯著差異，但看起來都有上升的趨勢，在初級細胞培養的系統中這些藥物看起來都是有潛力的，其中 NC004-6 在 10 nM 的濃度下 Purkinje cell 數目有顯著的增加，由於神經細胞不會增生，因此我們認為 NC004-6 能夠減少 Purkinje cell 在 primary culture 過程中的死亡，有著保護 Purkinje cell 的潛力，由於 Purkinje cell 的數量是我們判斷藥物毒性的依據，在 Purkinje cell 不致大量減少的濃度範圍中，提高藥物的濃度或許可以更明顯的增加 Purkinje cell neurite length，而尋求藥物有效的濃度範圍。我們實驗室用 SCA17 的小鼠建立了另外一套小腦組織切片培養，我們也用這套模式來進行 SCA17 潛力藥物篩選，在 SCA17 的小腦組織切片培養中我們發現到 NC105 以及 NC109 HDACi 能夠有效的降低 SCA17 小鼠小腦中的 TBP 聚集(實驗結果未呈現)，經由兩套篩藥模 41.

(44) 式以及評估，我們決定選用 M344 和 Droxinostat 這兩種 HDACi 進入小量小鼠的預試驗。 HDACi 近幾年成為許多人研究的方向，尤其以癌症和神經退化性疾病最為廣泛，在癌症方面，HDACi 可以調節細胞週期和細胞凋亡，以抑制癌細胞形成；而在神經退化性疾病方面，HDACi 可以藉由 HSP 協助蛋白質正確折疊，也可透過調節轉錄，提高基因的活性 (Kim and Bae, 2011)，也因此我們想了解 M344 和 Droxinostat 是否可以改善 SCA17 小鼠的病徵。在預試驗中我們以小腦的組織切片培養用藥濃度來當作對小鼠用藥劑量的參考，實驗的結果雖然沒有看到施打 M344 和 Droxinostat 之後能夠顯著的增加小鼠在 rotarod 上跑步的時間，不過看到了稍微上升的趨勢，加上小鼠小腦切片的免疫螢光染色結果我們看到 TBP 聚集的情況有改善，H3 和 H4 有顯著的增加，也有改善 glosis 的潛力，所以我們決定選用 M344 和 Droxinostat 進入大量的動物行為實驗，由於藥物看起來並沒有對小鼠造成額外的傷害，所以我們也決定提高給予藥物的頻率，從隔天改成每天腹腔注射藥物，看這樣的改變是否能夠更明顯的讓 SCA17 小鼠的病徵得以改善。大量動物實驗的結果我們看到，給予 M344 和 Droxinostat 之後 TG 小鼠在 rotarod 上待的時間分別從第十四週和第十二週開始明顯高 42.

(45) 於 TG vehicle 的小鼠，這部分實驗的結果顯示施打 M344 和 Droxinostat 之後能夠改善小鼠的運動以及協調能力，而在體重和 locomotor 的結果我們認為這樣的藥物劑量並不會對小鼠造成不良反應，然而在 footprinting 的實驗中，施打 M344 和 Droxinostat 並沒有得到明顯的改善小鼠之步態，先前的研究指出，步態不穩的小鼠會有後腳步寬較寬、步長較短以及步伐規律性較低等等的現象(Cendelin et al., 2010)，我們實驗的結果 WT 和 TG 之間在步伐規律性和跨步時間等等數據皆沒有看到明顯的差異，在後腳之間有看到 TG 小鼠較寬的現象，但給藥之後並沒有得到改善，而步長在 WT 和 TG 也沒看到明顯的不同，我們認為施打 M344 和 Droxinostat 對 footprinting 並沒有改善，而我們也認為 footprinting 相較於 rotarod 對於小鼠來說算是比較細微的行為，可能要病徵很明顯時才能看出差異，我們的 SCA17 TG 小鼠和 WT 在許多參數看來並無差異應該是小鼠的年紀還不夠大，發病病徵還不夠明顯以看出步態上的差異。在 SCA17 小鼠的小腦螢光免疫染色結果我們看到施打 Droxinostat 後 TBP 的聚集有明顯的改善，但是施打 M344 並沒有明顯的改善 TBP 的聚集，與之前小量的預試驗結果不同，而 GFAP 增加的 gliosis 現象在給予此兩種 HDACi 之後皆沒有如小量預試驗時那樣明顯的改善，就連 AcH3 和 AcH4 的部分也沒有先前預試驗時明顯 43.

(46) 的增加，我們認為有可能是因為大量小鼠實驗時小鼠的年紀較大，比起先前小量預試驗時 SCA17 的病徵更為嚴重，而這兩支 HDACi 增加 AcH3 及 AcH4 的能力有可能在小鼠發病早期才有明顯的效果，因為大量試驗時並沒有觀察早期發病時年紀較輕的小鼠，所以不能確定是否有影響，而 HDACi 也有可能作用在 non-histone 的蛋白質上，像是 HSP70 及 HSP90 等，所以在 TBP、AcH3 及 AcH4 上並沒有看到如先前預試驗般明顯的改善。 pERK 對於神經退化性疾病的影響一直沒有明確的定論，有研究指出 pERK 在細胞存活途徑中扮演重要的角色，並有神經保護的作用 (Chen and Sidhu, 2005)，但在我們的 SCA17 TG 小鼠中卻有看到明顯增加的現象，有可能是因為神經受到損傷引發了 pERK 的表現量，而我們的螢光圖也看到 TG 小鼠的腦片在 S100的位置上有明顯較亮的現象，而施打 Droxinostat 之後這樣得到改善，在 western 的部分也得到相同的結果，我們認為 Droxinostat 能降低 pERK，因此有神經保護的作用，但這部分的研究還需要繼續探討。有許多研究都指出 HSP 對於協助蛋白質的正常摺疊扮演著重要的角色，藉由提高 HSP 就能改善神經退化性疾病的相關病徵(Kim and Bae, 2011, Kuo et al., 2013, Witt, 2010, Shukla et al., 2014)，然而我們給予 M344 和 Droxinostat 之後，western 分析 HSP40 和 HSP110 均沒有 44.

(47) 看到明顯的改善，而給予 M344 後在 HSP70 以及 HSP90 的部分則有看到顯著的提升，我們認為 M344 可以藉由提高 HSP70 及 HSP90 來降低 TBP 不正常聚集，藉以改善小鼠的運動能力，增加小鼠在 rotarod 上跑動的時間。研究指出，在 PD 以及 HD 的模式下，會有微管受損的情形發生，藉由，藉由 HDACi 去抑制 HDAC6 後，能夠提高-tubulin 的乙醯化程度，藉此提供神經保護的效果(Chuang et al., 2009, Dompierre et al., 2007, Outeiro et al., 2007)，而 M344 及 Droxinostat 皆為 HDAC6 的抑制劑，因此我們也對此進行了觀察，結果顯示 M344 及 Droxinostat 接能夠顯著的提升-tubulin 的乙醯化程度，因此我們認為 M344 及 Droxinostat 能夠藉由提升-tubulin 的乙醯化來達到神經保護的效果。我們的實驗結果在小量預試驗的病理層面時，看到施打 M344 和 Droxinostat 後，SCA17 小鼠的病徵改善較為明顯，然而到了大量動物實驗時，施打 M344 和 Droxinostat 後，rotarod 有明顯改善，但是病理層面並沒有先前預試驗時明顯(表 3)，首先我們認為有可能是預試驗時小鼠較少，個體差異較大，所以得到的結果準確性不如大量動物實驗，也因此在小量預試驗時沒有看到 TG vehicle 小鼠的 rotarod 有下降趨勢，第二個可能的原因是小鼠的年紀不同，隨著小鼠的年紀 45.

(48) 增加，SCA17 的病徵會越來越明顯，rotarod 在第十四週 TG 組別跑動時間出現明顯下降可以得知這樣的結果，也因此 M344 和 Droxinostat 施打的劑量可能已經不足以讓 SCA17 小鼠的病徵得到改善，若是增加劑量，可能會得到更有效的結果，在實驗的流程中，小量預試驗是從第三週開始進行並施打藥物，大量動物試驗時則是從第四周開始施打藥物，開始施打藥物的時間也可能影響了最後實驗的結果。雖然我們施打 M344 和 Droxinostat 的結果不如預期中那樣有效的改善 SCA17 的分子層面病理特徵，但在 rotarod 行為實驗上還是看到了顯著的改善，代表 M344 和 Droxinostat 對於 SCA17 小鼠的運動和協調能力依舊有著改善的潛力，對於這兩支 HDACi 的影響我們依舊不是很清楚，是否是直接穿過血腦屏障(blood–brain barrier)影響小腦，改善小鼠的行為能力，或透過周邊的影響進而改善運動能力，是藉由什麼途徑改善小鼠的運動能力需要繼續研究和探討。我們的實驗結果看到了 SCA17 部分的指標，知道了 WT 和 SCA17 TG 之間的差異，像是 Calbindin、GFAP、pERK 和 HSP 等，也看到了 M344 和 Droxinostat 對於 SCA17 病徵改善的潛力，都給之後研究提供了一些方向和目標。. 46.

(49) 參考文獻 Altman J, Bayer SA (1996) Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. Boca Raton: CRC Press. Apps R, Garwicz M (2005) Anatomical and physiological foundations of cerebellar information processing. Nature reviews Neuroscience 6:297-311. Bijangi-Vishehsaraei K, Saadatzadeh MR, Huang S, Murphy MP, Safa AR (2010) 4-(4-Chloro-2-methylphenoxy)-N-hydroxybutanamide (CMH) targets mRNA of the c-FLIP variants and induces apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells. Molecular and cellular biochemistry 342:133-142. Cook C, Gendron TF, Scheffel K, Carlomagno Y, Dunmore J, DeTure M, Petrucelli L (2012) Loss of HDAC6, a novel CHIP substrate, alleviates abnormal tau accumulation. Human molecular genetics 21:2936-2945. Cendelin J, Voller J, Vozeh F (2010) Ataxic gait analysis in a mouse model of the olivocerebellar degeneration. Behavioural brain research 210:8-15. Chang YC, Lin CY, Hsu CM, Lin HC, Chen YH, Lee-Chen GJ, Su MT, Ro LS, Chen CM, Hsieh-Li HM (2011) Neuroprotective effects of granulocyte-colony stimulating factor in a novel transgenic mouse model of SCA17. Journal of neurochemistry 118:288-303. Chen J, Sidhu A (2005) The role of D1 dopamine receptors and phospho-ERK in mediating cytotoxicity. Commentary. Neurotoxicity research 7:179-181. Chuang DM, Leng Y, Marinova Z, Kim HJ, Chiu CT (2009) Multiple roles of HDAC inhibition in neurodegenerative conditions. Trends in neurosciences 32:591-601. Dieni S, Rees S (2002) Distribution of brain-derived neurotrophic factor and TrkB receptor proteins in the fetal and postnatal hippocampus and cerebellum of the guinea pig. The Journal of comparative neurology 454:229-240. Di Prospero NA, Fischbeck KH (2005) Therapeutics development for triplet repeat expansion diseases. Nature reviews Genetics 6:756-765. Dompierre JP, Godin JD, Charrin BC, Cordelieres FP, King SJ, Humbert 47.

(50) S, Saudou F (2007) Histone deacetylase 6 inhibition compensates for the transport deficit in Huntington's disease by increasing tubulin acetylation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 27:3571-3583. Donato R (2001) S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles. The international journal of biochemistry & cell biology 33:637-668. El Idrissi A, Boukarrou L, Heany W, Malliaros G, Sangdee C, Neuwirth L (2009) Effects of taurine on anxiety-like and locomotor behavior of mice. Advances in experimental medicine and biology 643:207-215. Figiel M, Szlachcic WJ, Switonski PM, Gabka A, Krzyzosiak WJ (2012) Mouse models of polyglutamine diseases: review and data table. Part I. Molecular neurobiology 46:393-429. Furuya S, Makino A, Hirabayashi Y (1998) An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research Brain research protocols 3:192-198. Gimenez-Cassina A, Lim F, Diaz-Nido J (2007) Gene transfer into Purkinje cells using herpesviral amplicon vectors in cerebellar cultures. Neurochemistry international 50:181-188. Gottesfeld JM, Rusche JR, Pandolfo M (2013) Increasing frataxin gene expression with histone deacetylase inhibitors as a therapeutic approach for Friedreich's ataxia. Journal of neurochemistry 126 Suppl 1:147-154. Govindarajan N, Agis-Balboa RC, Walter J, Sananbenesi F, Fischer A (2011) Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's disease : JAD 26:187-197. Groselj B, Sharma NL, Hamdy FC, Kerr M, Kiltie AE (2013) Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers: effects on DNA damage signalling and repair. British journal of cancer 108:748-754. Gruol DL, Franklin CL (1987) Morphological and physiological differentiation of Purkinje neurons in cultures of rat cerebellum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 7:1271-1293. 48.

(51) Haggarty SJ, Koeller KM, Wong JC, Grozinger CM, Schreiber SL (2003) Domain-selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:4389-4394. Harding AE (1982) The clinical features and classification of the late onset autosomal dominant cerebellar ataxias. A study of 11 families, including descendants of the 'the Drew family of Walworth'. Brain : a journal of neurology 105:1-28. Heltweg B, Dequiedt F, Marshall BL, Brauch C, Yoshida M, Nishino N, Verdin E, Jung M (2004) Subtype selective substrates for histone deacetylases. Journal of medicinal chemistry 47:5235-5243. Hendelman WJ, Aggerwal AS (1980) The Purkinje neuron: I. A Golgi study of its development in the mouse and in culture. The Journal of comparative neurology 193:1063-1079. Hochheimer A, Tjian R (2003) Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes & development 17:1309-1320. Hockly E, Richon VM, Woodman B, Smith DL, Zhou X, Rosa E, Sathasivam K, Ghazi-Noori S, Mahal A, Lowden PA, Steffan JS, Marsh JL, Thompson LM, Lewis CM, Marks PA, Bates GP (2003) Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:2041-2046. Hourez R, Servais L, Orduz D, Gall D, Millard I, de Kerchove d'Exaerde A, Cheron G, Orr HT, Pandolfo M, Schiffmann SN (2011) Aminopyridines correct early dysfunction and delay neurodegeneration in a mouse model of spinocerebellar ataxia type 1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 31:11795-11807. Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, Yoshida M, Wang XF, Yao TP (2002) HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. Nature 417:455-458. Ingram MA, Orr HT, Clark HB (2012) Genetically engineered mouse models of the trinucleotide-repeat spinocerebellar ataxias. Brain research bulletin 88:33-42. Jacobi H, Minnerop M, Klockgether T (2013) [The genetics of 49.

(52) spinocerebellar ataxias]. Der Nervenarzt 84:137-142. Jung M, Brosch G, Kolle D, Scherf H, Gerhauser C, Loidl P (1999) Amide analogues of trichostatin A as inhibitors of histone deacetylase and inducers of terminal cell differentiation. Journal of medicinal chemistry 42:4669-4679. Kalia SK, Kalia LV, McLean PJ (2010) Molecular chaperones as rational drug targets for Parkinson's disease therapeutics. CNS & neurological disorders drug targets 9:741-753. Kim HJ, Bae SC (2011) Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American journal of translational research 3:166-179. Koide R, Kobayashi S, Shimohata T, Ikeuchi T, Maruyama M, Saito M, Yamada M, Takahashi H, Tsuji S (1999) A neurological disease caused by an expanded CAG trinucleotide repeat in the TATA-binding protein gene: a new polyglutamine disease? Human molecular genetics 8:2047-2053. Kuo Y, Ren S, Lao U, Edgar BA, Wang T (2013) Suppression of polyglutamine protein toxicity by co-expression of a heat-shock protein 40 and a heat-shock protein 110. Cell death & disease 4:e833. Li J, Shariff A, Wiking M, Lundberg E, Rohde GK, Murphy RF (2012) Estimating microtubule distributions from 2D immunofluorescence microscopy images reveals differences among human cultured cell lines. PloS one 7:e50292. Liu J, Edagawa M, Goshima H, Inoue M, Yagita H, Liu Z, Kitajima S (2014) Role of ATF3 in synergistic cancer cell killing by a combination of HDAC inhibitors and agonistic anti-DR5 antibody through ER stress in human colon cancer cells. Biochemical and biophysical research communications 445:320-326. Maltecca F, Filla A, Castaldo I, Coppola G, Fragassi NA, Carella M, Bruni A, Cocozza S, Casari G, Servadio A, De Michele G (2003) Intergenerational instability and marked anticipation in SCA-17. Neurology 61:1441-1443. Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK (2001) Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nature reviews Cancer 1:194-202. Matilla-Duenas A (2012) The ever expanding spinocerebellar ataxias. Editorial. Cerebellum 11:821-827. 50.

(53) Mawji IA, Simpson CD, Hurren R, Gronda M, Williams MA, Filmus J, Jonkman J, Da Costa RS, Wilson BC, Thomas MP, Reed JC, Glinsky GV, Schimmer AD (2007) Critical role for Fas-associated death domain-like interleukin-1-converting enzyme-like inhibitory protein in anoikis resistance and distant tumor formation. Journal of the National Cancer Institute 99:811-822. McKay BE, Turner RW (2005) Physiological and morphological development of the rat cerebellar Purkinje cell. The Journal of physiology 567:829-850. Mohseni J, Zabidi-Hussin ZA, Sasongko TH (2013) Histone deacetylase inhibitors as potential treatment for spinal muscular atrophy. Genetics and molecular biology 36:299-307. Nakamura K, Jeong SY, Uchihara T, Anno M, Nagashima K, Nagashima T, Ikeda S, Tsuji S, Kanazawa I (2001) SCA17, a novel autosomal dominant cerebellar ataxia caused by an expanded polyglutamine in TATA-binding protein. Human molecular genetics 10:1441-1448. Nuutinen T, Suuronen T, Kyrylenko S, Huuskonen J, Salminen A (2005) Induction of clusterin/apoJ expression by histone deacetylase inhibitors in neural cells. Neurochemistry international 47:528-538. Ohira K, Funatsu N, Nakamura S, Hayashi M (2004) Expression of BDNF and TrkB receptor subtypes in the postnatal developing Purkinje cells of monkey cerebellum. Gene expression patterns : GEP 4:257-261. Orr HT (2012) Cell biology of spinocerebellar ataxia. The Journal of cell biology 197:167-177. Outeiro TF, Kontopoulos E, Altmann SM, Kufareva I, Strathearn KE, Amore AM, Volk CB, Maxwell MM, Rochet JC, McLean PJ, Young AB, Abagyan R, Feany MB, Hyman BT, Kazantsev AG (2007) Sirtuin 2 inhibitors rescue alpha-synuclein-mediated toxicity in models of Parkinson's disease. Science 317:516-519. Popiel HA, Takeuchi T, Fujita H, Yamamoto K, Ito C, Yamane H, Muramatsu S, Toda T, Wada K, Nagai Y (2012) Hsp40 gene therapy exerts therapeutic effects on polyglutamine disease mice via a non-cell autonomous mechanism. PloS one 7:e51069. Riessland M, Brichta L, Hahnen E, Wirth B (2006) The benzamide M344, a novel histone deacetylase inhibitor, significantly increases SMN2 RNA/protein levels in spinal muscular atrophy cells. Human 51.

(54) genetics 120:101-110. Rolfs A, Koeppen AH, Bauer I, Bauer P, Buhlmann S, Topka H, Schols L, Riess O (2003) Clinical features and neuropathology of autosomal dominant spinocerebellar ataxia (SCA17). Annals of neurology 54:367-375. Romaniello R, Arrigoni F, Bassi MT, Borgatti R (2014) Mutations in alpha- and beta-tubulin encoding genes: Implications in brain malformations. Brain & development. Seidel K, Siswanto S, Brunt ER, den Dunnen W, Korf HW, Rub U (2012) Brain pathology of spinocerebellar ataxias. Acta neuropathologica 124:1-21. Seipel K, Georgiev O, Gerber HP, Schaffner W (1994) Basal components of the transcription apparatus (RNA polymerase II, TATA-binding protein) contain activation domains: is the repetitive C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II a "portable enhancer domain"? Molecular reproduction and development 39:215-225. Serrano-Munuera C, Corral-Juan M, Stevanin G, San Nicolas H, Roig C, Corral J, Campos B, de Jorge L, Morcillo-Suarez C, Navarro A, Forlani S, Durr A, Kulisevsky J, Brice A, Sanchez I, Volpini V, Matilla-Duenas A (2013) New subtype of spinocerebellar ataxia with altered vertical eye movements mapping to chromosome 1p32. JAMA neurology 70:764-771. Sharma NL, Groselj B, Hamdy FC, Kiltie AE (2013) The emerging role of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in urological cancers. BJU international 111:537-542. Shukla AK, Pragya P, Chaouhan HS, Tiwari AK, Patel DK, Abdin MZ, Chowdhuri DK (2014) Heat Shock Protein-70 (Hsp-70) Suppresses Paraquat-Induced Neurodegeneration by Inhibiting JNK and Caspase-3 Activation in Drosophila Model of Parkinson's Disease. PloS one 9:e98886. Simoes-Pires C, Zwick V, Nurisso A, Schenker E, Carrupt PA, Cuendet M (2013) HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Molecular neurodegeneration 8:7. Spiegel S, Milstien S, Grant S (2012) Endogenous modulators and pharmacological inhibitors of histone deacetylases in cancer therapy. Oncogene 31:537-551. St Laurent R, O'Brien LM, Ahmad ST (2013) Sodium butyrate improves 52.

(55) locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience 246:382-390. Switonski PM, Szlachcic WJ, Gabka A, Krzyzosiak WJ, Figiel M (2012) Mouse models of polyglutamine diseases in therapeutic approaches: review and data table. Part II. Molecular neurobiology 46:430-466. Tanaka M, Yanagawa Y, Hirashima N (2009) Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of neuroscience methods 178:80-86. Tanaka M, Yanagawa Y, Obata K, Marunouchi T (2006) Dendritic morphogenesis of cerebellar Purkinje cells through extension and retraction revealed by long-term tracking of living cells in vitro. Neuroscience 141:663-674. Torrente MP, Shorter J (2014) The metazoan protein disaggregase and amyloid depolymerase system: Hsp110, Hsp70, Hsp40, and small heat shock proteins. Prion 7. Villarreal A, Seoane R, Torres AG, Rosciszewski G, Angelo MF, Rossi A, Barker PA, Ramos AJ (2014) S100B protein activates a RAGE-dependent autocrine loop in astrocytes: Implications for its role in the propagation of reactive gliosis. Journal of neurochemistry. Weisenberg RC (1972) Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science 177:1104-1105. Witt SN (2010) Hsp70 molecular chaperones and Parkinson's disease. Biopolymers 93:218-228. Wood TE, Dalili S, Simpson CD, Sukhai MA, Hurren R, Anyiwe K, Mao X, Suarez Saiz F, Gronda M, Eberhard Y, MacLean N, Ketela T, Reed JC, Moffat J, Minden MD, Batey RA, Schimmer AD (2010) Selective inhibition of histone deacetylases sensitizes malignant cells to death receptor ligands. Molecular cancer therapeutics 9:246-256. Yang H, Ganguly A, Cabral F (2010) Inhibition of cell migration and cell division correlates with distinct effects of microtubule inhibiting drugs. The Journal of biological chemistry 285:32242-32250. Zhang X, Baader SL, Bian F, Muller W, Oberdick J (2001) High level Purkinje cell specific expression of green fluorescent protein in transgenic mice. Histochemistry and cell biology 115:455-464. 53.

(56) 表 1、本論文中所使用的初級抗體名稱. 偵測標的. 生產物種. 使用濃度. 廠商. IP3R1. Purkinje cell. goat. 1:1000. Santa Cruz. 1TBP18. TBP aggregation. mouse. 1:30000. QED. Calbindin. Purkinje cell. goat. 1:100. Santa Cruz. GFAP. Gila cell. mouse. 1:1000. Millipore. AcH3. Acetyl-Histone H3. rabbit. 1:1000. Cell signaling. AcH4. Acetyl-Histone H4. rabbit. 1:1000. Cell signaling. BDNF. Brain-derived neurotrophic factor. rabbit. 1:500. Millipore. S100. Bergmann glia. mouse. 1:1000. Millipore. pERK. Phospho-ERK. rabbit. 1:1000. Cell signaling. -Actin. Actin. mouse. 1:1000. Millipore. rabbit. 1:5000. Abcam. Rabbit. 1:1000. Cell signaling. Mouse. 1:1000. Santa Cruz. Mouse. 1:1000. Santa Cruz. Mouse. 1:5000. Sigma. Mouse. 1:1000. Santa Cruz. Ac -tubulin. Heat shock 40 Heat shock 70 Heat shock 90 Heat shock 110 Acetylated -tubulin. -tubulin. -tubulin. HSP40 HSP70 HSP90 HSP110. protein protein protein protein. 54.