第三章 材料與方法
第三節 體內動物試驗
一、
紅麴次級代謝產物 MS 與 AK 對高果糖與高油脂誘發高血糖大鼠血糖調控能力之影響
(一) 動物分組與照護
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本 實 驗 大 鼠 購 買 自 樂 斯 科 有 限 公 司 (Taipei, Taiwan) 6 週 齡 大 Sprague-Dawley (SD) 品系雄性大鼠 64 隻進行實驗，其生長環境為恆定室內溫 度 (25 ± 1oC)、相對溼度 70 % 並維持 12 小時循環光照(光照時間為 8 : 00～20：
00) 。大鼠預養一週後正式進行實驗，大鼠實驗飼養共分為 8 組，每組有 8 隻，
實驗進行 10 週，實驗進行期間採用自由攝食，並於每週固定測量其體重、攝食 量與飲水量。
(二) 動物餵食劑量換算
關於添加劑量之算法，依據體重 60 kg 之成人除以試驗物之每日人體建議 攝取量再乘以實驗動物相對於人體之代謝係數。計算式表示如下 (苗，1997)：
大白鼠每公斤體重之攝取劑量＝人體建議攝取量 ÷ 體重 60 kg × 6.25 則可求出大鼠每日每公斤體重之攝取劑量。
(三) 實驗動物分組與誘發
本實驗大鼠預養一週後進行分組實驗，分組主要分成 NOR、HFFD、MF、
RMD、MS-1X、MS-5X、AK-1X 與 AK-5X 等八組，NOR 組採用逆滲透 RO 水 作為飲水，並以一般玉米澱粉 (Louis, MO, USA) 作為飼料，熱量為 3.34 kcal/g，
其餘八組高血糖誘發方式皆參考 Yadav 等人於 2007 年發表之方法稍做修改 (Yadav et al., 2007)，秤取 30 g 之果糖粉末 (熱量為 4 kcal/g) 加入 100 mL reverse osmosis (RO) 水配成含果糖 30 % (w/v) 之飲用水並以含有 73.3 g chew diet #5001 粉末與 26.7 g butter powder 之高熱量飼料 (熱量為 4.85 kcal/g) 進 行高果糖與高油脂誘發。MF 組為投以糖尿病臨床用藥 metformin 純度 98 % 作為實驗正控制組，每人每日建議用量參照使用說明書為 500 mg，RMD 組劑 量則是餵食每人每日食用 1 g 的紅麴發酵山藥， MS 組為餵食紅麴發酵山藥黃 色素 monascin (純度 > 95%) 每人每日餵食 3 mg 作為一倍劑量，AK 組則是紅 麴發酵山藥黃色素 ankaflavin (純度 > 95 %) 每人每日餵食 1.5 mg 作為一倍劑 量，實驗分組方式為表 3-1，高油脂飼料配方如表 3-2，圖 3-1 為實驗日程表。
(四) 試驗物質投與方式
試驗物質每週以體重變化配製。每日以 10 mL 無菌塑膠針筒套上餵食針餵 食各組所需之劑量。不鏽鋼餵食針平時浸泡在 75 % 酒精溶液中消毒，使用前再 以 RO 水清洗。實驗期間各組老鼠每天經口管餵試驗物質直至實驗動物犧牲。
(五) 降血糖效果評估
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表 3-1 實驗大鼠分組與餵食劑量
Table 3-1 The grouping and sample dosage of rat in this study.
NOR, normal control; HFFD, high fat and high fructose diet; MF, metformin; MS, monascin; AK, ankaflavin. RMD contained 3 mg/g of MS and 1.5 mg/g of AK.
Groups High fat + High fructose
diet
Sample Rat Dosage (mg/kg b.w./day)
Adult Dosage (mg/day)
NOR - RO Water - -
HFFD + RO Water - -
MF + Metformin 52.08 500
RMD + Red mold
dioscorea
104.17 1000
MS-1X + Monascin 0.31 3
MS-5X + Monascin 1.56 15
AK-1X + Ankaflavin 0.16 1.5
AK-5X + Ankaflavin 0.78 7.5
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表 3-2 高血糖大鼠高油脂飼料組成
Table 3-2 The composition of high calorie density diet of hyperglycemia rat.
(Chen et al., 2008) Percentage (%) Calorie density (kcal/g)
Chew diet #5001 73.30 3.34
Butter powder 26.70 9
Total 100 4.85
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圖 3-1 試驗物質改善 HFFD 誘發高血糖大鼠之日程表
Fig 3-1. The experiment schedule of test substance for improving hyperglycemia rat induced by high fructose and high fat diet
HFFD induced for 10 weeks
Administration with test substance
0 th 8 th 10 th week
Blood glucose regulation effect evaluation
1. Fasting blood glucose 2. Insulin resistance 3. Glucose tolerance test 4. Fructosamine
Sacrifice
1.Blood biochemical analysis
(1) TC, TG
(2) AST, ALT, creatinine
2. Hepatic risk factor analysis
(1) Glucokinase activity (2) ROS
(3) IRS-1, GLUT-2
(4) Histalogical examination
3. Adipocyte risk factor analysis
(1) ROS
(2) GLUT-4, adiponectin, HIF-1α (3) TNF-α, IL-6, IL-1β
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第八週測定降血糖效果評估前先禁食 12 hr ，禁食期間移除飼料，果糖水 則替換為 RO 水，實驗進行時先以氣體麻醉機進行大鼠麻醉後，再以毛細管進 行大鼠眼眶採血，當血液流出毛細管另一側流出數滴後測定空腹血糖值與口服糖 耐量，並且將採血之血液以 2 mL eppendorf tube 接取並靜置，待 5 min 後以 10000 x g 轉速進行離心並抽取血清並保存於 -80oC 待日後測定胰島素與果糖 胺含量之測定。
1. 空腹血糖測定
空腹血糖以市售血糖機 (OneTouch UltraEasy, Johnson & Johnson, Taiwan) 進行測定，其測定原理為血液中葡萄糖經葡萄糖氧化酶產生出微量電流透過血糖 機偵測後以正比之方式顯示 (Matthews et al., 1985)。
2. 口服糖耐量試驗 (Oral glucose tolerance test)
禁食後測定第 0 min 之血糖值，測定後以口服 (2 g/kg) 方式給予實驗動物 葡萄糖液，然後分別在餵食後的 30、60 和 90 min，觀察血糖濃度恢復到基礎 線情形 (Gniuli et al., 2008)。
3. 胰島素含量測定
離心後抽取之血清以 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) insulin kit (Mercodia AB, Uppsala, Sweden) 分析，測定血清胰島素含量，測定方式參照使用 說明，於孔盤中每格加入 10 μL 的標準液或樣品，加入 100 μL 的 enzyme conjugate solution (enzyme conjugate 11 X 與 enzyme conjugate buffer 以 1:10 混 合) 於室溫下振盪反應 2 hr 後，倒掉反應液，加入 350 μL wash buffer (Wash Buffer 21 X 與 RO 水以 1:20 混合)，清洗倒掉，並重覆五次，完成後加入 200 μL 的 substrate TMB (需避光) 於室溫下反應 15 min ，加入 50 μL 的 stop solution 震盪 5 sec 後測定 450 nm 波長，結果代入標準液推算血清胰島素濃度。
4. 胰島素阻抗測定
胰島素阻抗計算公式係以 1985 年由等人 (Matthews et al., 1985) 所提出 Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR) = insulin (μU/mL)
× glucose (mmol/L) / 22.5 而推算。
5. 果糖胺含量測定
果糖胺含量是以 fructosamine assay kit (Fortress Diagnostics Limited, Antrim ,
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United Kingdom) 測定，其原理為 Colorimetric assay 法，透過 ketoamines 將 nitrotetrazolium-blue (NB) 還原為 formazan，並在波長 546 nm 下測定 1 min 內 還原 NB 速率，並且與標準品比較後推算出果糖胺濃度 (Islam and Indrajit, 2012)。
(六) 動物犧牲與樣本製備
犧牲前禁食 12 hr ，犧牲時以二氧化碳窒息犧牲。確定無心跳後進行抽血、
取臟器。本實驗以針筒自鼠體腹腔大靜脈抽血，採血完畢後針頭從血管中緩慢抽 出並放 2 mL eppendorf tube 中靜置，待 5 min 後以 10000 x g 轉速進行離心 10 min 後靜置，待當日實驗動物犧牲完畢後取其上層血清分裝入 eppendorf tube，
於 – 20oC 冰箱冷凍儲存，待日後送檢分析。然而，臟器主要以肝臟、胰臟、脂 肪與腎臟等血糖調控相關器官為主；犧牲中取下肝臟先秤其重量後便以濃度 0.5
% (w/v) 生理食鹽水進行沖洗，待沖洗完畢後切下一小塊放入卡匣中；脂肪組織 則是取下副睪周圍體脂肪與腎周圍體脂肪墊進行秤重；腎臟則秤其重量後統一切 下大鼠右側腎臟放入卡匣中。待犧牲完畢後將裝有臟器的卡匣浸泡於 10 % 福馬
林溶液一週後進行切片染色。剩餘之肝臟與脂肪組織則保存於 -80oC 冰箱以便
日後分析血糖相關因子表現。
(七) 血液安全性指標評估 1. TG 之測定
血液中脂質濃度之檢測項目 TG 之含量，委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman -700, Fullerton, CA, USA) 測定。
【TG 測定原理】
Triglycerides + 3 H2O glycerol + 3 RCOOH
glycerol + ATP glycerol-3-phosphate + ADP
glycerol-3-phosphate + O2 dihydroxyacetone + phosphate + H2O2
H2O2 + 4-aminophenazone + 4-chlorophenol quinoneimine + HCl + 4 H2O
lipase
GK
GPO
POD
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2. TC 之測定
血液中脂質濃度之檢測項目 TC 之含量，為委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman -700, Fullerton, CA, USA) 測定。
【TC 測定原理】
cholesterol esters + H2O cholesterol + RCOOH
cholesterol + O2 cholest-4-en-3-one + H2O2
2 H2O2 + 4-aminophenazone + phenol 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone + 4 H2O
3. AST 之測定
血液中肝功能之檢測項目 AST 之含量，為委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman -700, Fullerton, CA, USA) 測定。
【AST 測定原理】
α-ketoglutarate + L-aspartate L-glutamate + oxaloacetate
oxaloacetate + NADH + H+ L-malate + NAD+
4. ALT 之測定
血液中肝功能之檢測項目 ALT 之含量，為委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman -700, Fullerton, CA, USA) 測定。
【ALT 測定原理】
α-ketoglutarate + L-alanine L-glutamate + pyruvate
pyruvate + NADH + H+ L-lactate + NAD+
5. Creatinine 之測定
peroxidase
cholesterol esterase
oxidase cholesterol
AST MDH
ALT
LDH
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血液中腎功能之檢測項目 creatinine 之含量，為委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman -700, Fullerton, CA, USA) 測定。
【Creatinine 測定原理】
creatinine + picric acid creatinine-picric acid complex
(八) 生理生化分析 1. 肝臟蛋白萃取
秤取犧牲完畢之大鼠肝臟 0.5 g 後加入 1 mL 之 lysis buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris，pH 7.5；100 mM NaCl、40 mM NaF、0.2% SDS、0.5%
deoxycholate、1 mM EDTA、1 mM EGTA 及 1 mM Na3VO4) 進行均質後離心 (15000 x g，30 min，4 oC)，待離心完畢後抽取上清液保存於 -80 oC 備用；另外，
同樣秤取犧牲後之大鼠肝臟 0.5 g 後加入 1 mL 之 25 mM PBS 進行均質後離 心 (15000 x g，30 min，4 oC)，待離心完畢後抽取上清液保存於 -80 oC 以測定 glucokinase activity (GK) 酵素之活性。
(1) 蛋白質定量
以 bicinchoninic acid (BCA) reagent kit (23225, Pierce, Box, PO, USA) 進行分 析，BCA 法是利用蛋白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原，所生成的 Cu2+ 可以 BCA 專一性地呈色而定量，先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻 混合，並取 25 μL 樣品加入 200 μL 上述之混合液靜置 37oC 反應 30 min。以 ELISA reader 測 595 nm 吸光測定其濃度。
(2) ROS 含量測定
ROS 測定採用 NBT 法；將 lysis buffer 定量完畢之萃取液以 10 mg/mL NBT 於 37 oC 環境下反應 2 hr ，待反應完畢後以波長 500 nm 進行測定 (Bellomo et al., 1987)。
(3) 葡萄糖激酶活性測定 (Glucokinase activity assay)
葡萄糖激酶活性 (GK activity) 測定方法與肝組織蛋白質萃取方法同是參考 Davidson 和 Arion (1987) 等人的方法再經修飾而成 (Davidson and Arion, 1987)。
葡萄糖激酶酵素活性測定所使用的緩衝液內含100 μL 50 mM Hepes pH 7.4、100 μL 100 mM KCl、7.5 μL 7.5 mM MgCl2、10 μL 2.5 mM DTT、100 μL 0.5 mM NAD+、 100 μL 1％ BSA、200 μL 0.5 mM glucose 及 200 μL 100 mM glucose 與 279.1 μL
alkaline solution
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滅菌水，測定時加入 50 μL 肝臟均質蛋白質萃出液、50 μL 5 mM ATP 與 3.4 μL 3.4 U/mL G-6-PDH 於中，並混合均勻。每個測定試管中，先取 950 μL 緩衝液
加入，於測定前才加入肝臟蛋白質萃出液，快速混合，並於恆溫 30oC 及吸光值
為 340 nm 下測定，總反應時間設定為 600 sec，且 30 sec 測定讀取數值一次。
葡萄糖激酶活性測定原理是利用葡萄糖磷酸化偶合反應 (coupled reaction) ， 如下列方程式所示，在恆溫狀態 (30℃) 下，不同濃度的葡萄糖受質 (0.5 mM 及 100 mM)，經肝臟組織粗蛋白所含的激酶催化後，利用 hexokinase (HK) 及 GK 對不同葡萄糖濃度親和性特性，由單位時間內所還原的 NADPH 總量 (在波長 340 nm 測量吸光值），來推算各組處理的葡萄糖激酶比活性 (specific activity) 。
葡萄糖激酶活性以比活性 (specific activity) 方式計算，即：
比活性 = 單位數 (U) / mg 蛋白質
當葡萄糖濃度在 100 mmol/L (Total Activity = GK+HK) 減去 0.5 mmol/L HK 而 得。
2. 脂肪蛋白萃取
秤取犧牲完畢之大鼠脂肪組織 0.5 g 後加入 1 mL 之 lysis buffer 進行均質 後離心 (15000 x g，30 min，4 oC)，待離心完畢後抽取上清液保存於 -80 oC 備 用。
(1) 蛋白質定量
以 bicinchoninic acid (BCA) reagent kit (23225, Pierce, Box, PO, USA) 進行 分析。
(2) ROS 含量測定
ROS 測定採用 NBT 法；將 lysis buffer 定量完畢之萃取液以 10 mg/mL NBT 於 37 oC 環境下反應 2 hr ，待反應完畢後以波長 500 nm 進行測定 (Bellomo et al., 1986 )。
3. 西方式墨點法
將 sample buffer 與 sample 1:1 混合後以 90oC 以上加熱 10 min，冷卻後取 20 μL 加入 10% 十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 置於電泳緩衝液 (18 mM Tris-HCl buffer pH8.4, 0.5 mM EDTA·2Na, 16 mM Boric acid and 0.7 mM SDS per liter) 中，並以 80 V 至跑
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完 stacking gel，再以 120 V 跑完 running gel ；進行蛋白質轉漬時，先裁剪與 膠片相同大小之 10 片濾紙及 1 片硝化纖維膜並先以 methanol 潤濕硝化纖維 膜後放入 transfer buffer (48mM Tris, 39mM glycine, 20% methanol and 0.0375%
SDS per liter) shaking 5 min，並將濾紙以 transfer buffer 潤濕放入半乾式轉印槽，
將 SDS-PAGE 從 running buffer 中拿出並截去 stacking gel 後依正極至負極：
5 張濾紙、浸泡後硝化纖維膜、SDS-PAGE、5 張濾紙組合後，以 400 mA 通電 2 hr；待轉漬完畢後將 PVDF 膜放入 Urea-TBST 進行清洗後再以 TBST 清洗 10 min 並重覆 3 次，之後於 blocking buffer (含 3% 脫脂奶粉) 中 shaking 1 hr 再加入稀釋後之一次抗體 (表 3-3) 反應 4oC 隔夜後，以 TBST (0.026 M NaCl, 0.002 M Tris and 0.01% Tween 20 per liter) 清洗 10 min 並重覆 3 次加入二次抗 體 shaking 1hr ，結束後以 TBST 清洗 10 min 並重覆 3 次；壓片前加入 HRP 冷光呈色劑反應 5 min，待硝化纖維膜呈色後進行壓片；待壓片完成後將底片以
5 張濾紙、浸泡後硝化纖維膜、SDS-PAGE、5 張濾紙組合後，以 400 mA 通電 2 hr；待轉漬完畢後將 PVDF 膜放入 Urea-TBST 進行清洗後再以 TBST 清洗 10 min 並重覆 3 次，之後於 blocking buffer (含 3% 脫脂奶粉) 中 shaking 1 hr 再加入稀釋後之一次抗體 (表 3-3) 反應 4oC 隔夜後，以 TBST (0.026 M NaCl, 0.002 M Tris and 0.01% Tween 20 per liter) 清洗 10 min 並重覆 3 次加入二次抗 體 shaking 1hr ，結束後以 TBST 清洗 10 min 並重覆 3 次；壓片前加入 HRP 冷光呈色劑反應 5 min，待硝化纖維膜呈色後進行壓片；待壓片完成後將底片以