將低黏性(hypo-mucoid)與高黏性(hyper-mucoid)基因相似度 cluster
hypo-mucoid hyper-mucoid Paired KP:
高達 98 % 成對的 KP，分別以菌量 1×104 cfu 感染正常與糖尿病 小鼠，於 20 或 40 小時將其犧牲。將小鼠右肺進行支氣管灌流術 (bronchoalveolar lavage)，將肺泡巨噬細胞(AM)沖出，探討 KP 入侵肺部後引起 AM 的凋亡(apoptosis)與吞噬(phagocytosis)情 形；為了解 KP 在肺部清除的情形，將小鼠左肺均質，培養細菌；
同時收集小鼠心臟血液，進行細菌培養，可知 KP 是否自肺部散 佈至血液中。以此比較黏性特質與糖尿病的致病作用。
第 二 節 體 外 試 驗 (in vitro)
雖然 KP 被視為胞外菌，但有研究指出 KP 可以入侵肺部上 皮細胞內並引發其凋亡(Oelschlaeger et al., 1997；Cortés et al., 2002) 。因此將低黏性(hypo-mucoid)與高黏性(hyper-mucoid)基因 相似度高達 98 % 成對的 KP，分別以 MOI (multiplicity of infection；1 或 10) 感染老鼠巨噬細胞株(RAW 264.7 cell lines)，
比較 KP 對巨噬細胞的存活力(viability)與凋亡 (apoptosis)之影 響，同時也比較 KP 對巨噬細胞的附著(adhesion)與 KP 在巨噬細 胞內的存活量(macrophage-associated KP)。探討黏性特質是否具 細胞毒性，以及黏性特質是否會影響 KP 對巨噬細胞的附著與 KP 在巨噬細胞內的存活量。
另外，有實驗提出，莢膜多糖體(CPS)厚度會阻礙 KP 對上
皮細胞的附著與入侵(Sahly et al., 2000)，但有些學者持不同看 法，認為莢膜多糖體(CPS)是最早與宿主細胞互動的細菌成分，
也和 KP 群體間之聚集有關(Sabine et al., 1999)；因此，為探討莢 膜多糖體(CPS)黏性特質對細菌與巨噬細胞的黏附、在巨噬細胞 內 的 存 活 是 否 重 要 ， 利 用 轉 移 子 突 變 (miniTn10 transposon mutagenesis)的方式將 hyper-mucoid KP (KP1112)黏性特質去除，
將野生型(wild type)與突變型(mutant type) KP 分別感染老鼠巨噬 細胞株，比較兩者對巨噬細胞的附著與在巨噬細胞內的存活量。
貳 、 研 究 方 法
第一節 體 內 試 驗 (in vivo) 一 、 糖 尿 病 動 物 模 型 的 建 立
＊ 材料：
檸檬酸鹽 (citric acid; C6H5Na3O7; USB)、微量天平、二次水 (ddH2O)、1N & 12N 氫氧化鈉 (NaOH)、1N & 12N 鹽酸 (HCl)、
50 ml 離心管(5 ml centrifuge tube )、塑膠滴管(dropper)、小燒杯、
拭淨紙(wipes)、酸鹼側定儀(PH Vision, Jenco, Electronic; LTD)、
pH4、pH6.8 校正液，試管震盪器(vortex mixer)、PE 飼養盒、木 屑墊料、鼠用飼料、餵水用水瓶、一次水、磅秤、streptozotocin (N-(Methylnitrosocarbamoyl)-o-glucosamine; Sigma) 、 0.05 Ｍ ，
pH4.5， 4℃的檬酸緩衝溶液 (citrate buffer)、 吸 管 唧 筒 (pipette pump)、微量吸管套(blue tip)、1 ml 注射用針(1ml syringe)、5 ml 試管、葡萄糖分析儀(Model 1500 sidekick glucose analyzer; YSI)、
校正液(YSI 2747 standa rd；YSI)、25μl 鈍針加樣器(YSI 151;
YSI)、膠帶、報紙、透明小塑膠袋、麻醉用玻璃鐘罩、麻醉用小 罩杯、乾棉球、止血小夾、70％酒精棉、水、小燒杯、乙醚(ethyl ether)、解剖台、解剖用剪刀。
＊ 步驟：
1-1. 實驗動物之品管
1.動物品系：C57BL/6J male mice
2.動物來源：國家科學委員會－國家實驗動物繁殖及研究中心 3.動物週? ：5 週
4.動物分組：將 5 週大的 mice 分為對照組與糖尿病組
5.飼養環境：恆溫 22℃、空調房間，相對溼度 55％、12 小時照 明
1-2. 0.05M, pH 4.5 檸檬酸鹽緩衝溶液(citrate buffer)的配製
加入 10ml dd H2O，加入 2.5 mmole citric acid、vortex 均勻，
加入 ddH2O 至 30 ml，vortex 均勻，先後以 pH4、pH6.8 校正酸鹼 測定儀，以 ddH2O 清洗探針，以鏡紙擦乾探針，測量 sodium citrate
buffer 的 PH 值，以 NaOH、 HCl 滴定之，直到 pH4.5，酸鹼互 換間，須以 ddH2O 清洗探針，以拭鏡紙擦乾探針，最後加入 ddH2O 至 50 ml，其 pH 應為 4.5。
1-3. 糖尿病的誘發
將 PE 盒底部鋪滿墊料，蓋子上放置飼料及裝水小瓶，把小 鼠放在 PE 盒中飼養 1 week，任其自由進食飲水，將 6 週大的小 鼠 秤 重 ， 糖 尿 病 組 依 小 鼠 的 體 重 酌 取 0.055 mg/ml/g 的 streptozotocin (STZ)的量，注射先將 streptozotcin 溶於 0.2 ml 的 citrate buffer，稀釋後至少 2 分鐘後再讓小鼠接受注射（但是泡藥 後要盡快完成注射以防 streptozotocin 失去活性），小鼠接受連續 4 天腹腔的 streptozotocin 注射；而對照組小鼠則依照體重取與糖尿 病組相等量之 citrate buffer 腹腔注射 4 天。在連續四天腹腔注射 完成後的第七天測量小鼠血糖值，血糖值必須≧300 mg/dl 才視為 有意義之糖尿病誘發，若血糖值未超過 300 mg/dl，則再連續給予 小鼠兩天的 0.055 mg/g 的 streptozotocin 注射，同樣的，在兩天注 射 streptozotocin 完成後的第七天測量小鼠血糖值，血糖值必須≧
300 mg/dl，糖尿病誘發後養育 6 個月至小鼠週齡為 30 週左右，
於小鼠週齡為 28 週時再進行一次血糖測量，每週秤一次體重並 記錄。
1-4. 血糖的測量
準備材料，鋪報紙，注入乙醚於玻璃鐘罩及麻醉小罩杯，校 正儀器，校正液值為 180 mg/dl，用水清洗 pipette 後，用拭淨紙 擦乾，將小鼠放入玻璃鐘罩中麻醉，小鼠昏迷後，將其平躺置於 解剖台上，小鼠四肢以膠帶固定，若小鼠有醒來的跡象，以麻醉 小杯蓋住其口鼻，70 ％酒精棉消毒小鼠尾巴，用剪刀剪斷一小 段尾巴，擠出 5∼6 滴血(＞25μl)於透明平滑塑膠帶上，以鈍針加 樣器吸收取 25μl mice 全血，將全血打入儀器測量血糖值，清洗 pipette 後，用拭鏡紙擦乾，以乾棉球及止血夾夾住尾小鼠尾巴止 血，記錄血糖值。
二 、 小 鼠 肺 部 感 染 Klebsiella pneumoniae (KP)
＊ 材料：
Klebsiella pneumoniae (KP)、酒精燈、70 %噴霧酒精、擦手
紙、裝 70 ％酒精的小燒杯、微量離心管(1.5 ml micro centrifuge tube; eppendrof)、微量離心管放置架(eppendorff rack)、15ml 無菌 培養血清瓶、試管架、無菌 Tryptic Soy Broth (TSB broth; Becton Dickinson)、無菌 LB agar, Miller Plate (Becton Dickinson)、電動吸 取器(Electrical Pipette)、無菌吸管(5 ml pipettes)、無菌的一倍磷酸 鹽緩衝溶(1X PBS)、1000p、200p、20ｐ吸管唧筒(pipette pump)、
吸管尖(blue & yellow tip)、白金 loop、三角玻璃棒、無菌通風櫥、
37℃培養箱(incubator)，10 倍連續稀釋的 KP 菌液、廢物桶、廢 液桶、試管架、30 週 C57BL/6J 雄性小鼠、乙醚(ethyl ether)、麻 醉用玻璃鐘罩、無菌乾棉球、膠帶、縫線、縫針、持針器、解剖 盤、麻醉小罩杯、優碘、彎盆、剃毛機、試管震盪器(vortex mixer)、
手術燈、鈍頭鑷子、尖頭鑷子、尖頭小剪刀、圓頭剪刀、70 %噴 頭酒精、無菌生理食鹽水(normal saline)、50μl 微量注射針筒(50 μl syringe)、27 號針頭的 1ml 無菌注射針、104 cfu/30μl 濃度之 KP、冰塊，冰桶。
＊ 步驟：
2-1. Klebsiella pneumoniae (KP)
1.KP 來源：中國醫藥大學附設醫院之臨床病人分離之 KP 菌株（中 國醫藥大學附設醫院湯惠玲小姐提供）
2.KP 種類：
(1) Cluster A: KP1084 與 KP1112 (2) Cluster B: KP1008 與 KP2002 (3) Cluster C: KP1283 與 KP1284
(4) 不在 cluster 之內的 KP: KP1004 因 plasmid 的有無，而有兩 種不同的表現型，一為高黏性另一是低黏性，KP1004n 與
KP1004m 表列如下：
2-2. 定量 Klebsiella pneumoniae 菌液濃度
以下步驟必須在無菌通風櫥中操作，用 loop 取 1 個 colony
cluster Paired KP String test DM history
KP1004
cluster Paired KP String test DM history
KP1004
cluster Paired KPPaired KP String testString test DM historyDM history
KP1004
焰上反覆燒烤三次，並冷卻之，再塗抹下一盤，將塗抹好稀釋 菌液的 LB agar plate，放入 37 ℃培養箱，培養 18 小時後，計 數並記錄 plates 上的 colony 數目，經計算並回推每管稀釋菌液 的菌量，之後取 10-3此管稀釋菌液，以 PBS 做進一步稀釋而達 到 104 cfu/30μl。
2-3. Klebsiella pneumoniae (KP) 肺部之感染
器皿以 70 ％酒精消毒，以無菌 normal saline 沖洗殘餘酒精，
器械泡於無菌 normal saline，微量針以 KP 菌液沖洗一次，KP 菌 液 vortex 均勻，以微量針抽好 30μl KP 菌液，乙醚麻醉小鼠，不 可麻死，用膠帶將小鼠四肢固定在解剖板上，將小鼠門牙以線綁 住，拉直小鼠頭部再用膠帶固定，剃掉小鼠頸部的毛後，以優碘 消毒小鼠頸部皮膚，將小鼠頸部皮剪開，用鑷子將氣管上方的肉 和胸腺小心撥開，將氣管上的膜拉高，剪開膜露出氣管，暴露出 氣管後，用鑷子將氣管游離出並撐住，以 27 號針頭注射入 30μ KP，共 104 cfu，讓小鼠直立 2 min，將小鼠頸部的皮縫合，再以 優碘消毒小鼠頸部皮膚並放回飼養盒，使其自由進食進水，飼養 20 小時或 40 小時。
三、感染後小鼠左肺、右肺肺泡巨噬細胞(bronchoalveolar lavage)及血 液的取得
＊ 材料：
感染 KP 20h 或 40 h 之後 C57BL/6J 雄性小鼠、乙醚(enthyl ether)、麻醉用玻璃鐘罩、無菌乾棉球、膠帶、縫線、止血鉗、解 剖盤、麻醉小罩杯、優碘、彎盆、鈍頭鑷子、尖頭鑷子、尖頭小 剪刀、圓頭剪刀、70 %噴頭酒精、無菌生理食鹽水(normal saline)、
無菌一倍磷酸鹽緩衝溶液(1X PBS)、含 EDTA 的抗凝管、離心管 (15ml centrifuge tube)、微量離心管(1.5ml micro-centrifuge tube)、
離心管(15ml & 50 ml centrifuge tube)、PE 管(polyethylene tube；
PE-50)，21 號針頭(21gauge needle)、針筒(1ml syringe)、26 號針 頭的 1ml 無菌注射針，冰塊、冰桶。
＊步驟：
將事先滅菌的器皿以無菌 normal saline 倒入適量，器械泡於 無菌 normal saline 中，小鼠感染後 20 小時，乙醚麻醉小鼠，以下 手術部分皆在無菌通風桶中操作，將小鼠胸腔打開，將胸骨完全 剪開，以止血鉗將肋骨往左右扳開固定，，以 1 ml 空針插入心臟，
採集 0.2 ml 全血，將全血置入己含 EDTA 的抗凝管中並混合之，
全血靜置於冰上，剪開頸部皮膚，並用 2 隻尖鑷子撥開，找到甲 狀腺、氣管，小心仔細的扯開氣管上的肉，將氣管上的膜拉高，
剪開露出氣管，暴露出氣管後，用鑷子將氣管撐住，鑷子夾線，
從氣管下方穿線，將小鼠心臟拉高剪去，將其左肺以鈍端鑷子拉 出後，可看到左支氣管，把左肺拉出並用止血鉗將左支氣管夾 緊，左支氣管用縫線綁兩個死結，剪下左肺，以無菌 normal saline 沖過並放入含有 3 ml PBS 的高速離心管中，將左肺靜置於冰上，
接續進行支氣管灌流術(bronchoalveolar lavage；BAL)，用尖剪刀 在鑷子下方（較靠近頭的方）替氣管剪一小洞，穿入 PE tube，PE tube 綁線固定，用膠帶在桌上固定 PE tube，插上抽好 0.6 ml PBS 的針筒，慢慢打入 PBS，看到右肺脹起來，再慢吸回 PBS，重複 灌洗 0.6 ml PBS，最後總共灌出 15 ml 灌洗液(BALF)，肺泡灌洗 液靜置於冰上。
四、小鼠肺部及血液中 Klebsiella pneumoniae 菌量測定
＊ 材料：
均質機、滅菌的均質棒、70 %酒精(alcohol)、裝冰塊的小燒 杯、廢液桶、15 ml 離心管、左肺、全血、無菌的一倍磷酸鹽緩 衝溶(1X PBS)、電子天平秤、酒精燈、 70 %噴霧酒精、擦手紙、
裝 70%酒精的小燒杯、微量離心管(1.5ml micro-centrifuge tube)、
微量離心管放置架(eppendorff rack)、試管震盪器(vortex mixer)、
三角玻璃棒、無菌 PBS、無菌 LB agar plate、1000p、200p、20p 吸管唧筒(pipette pump)、吸管尖(blue & yellow tip)、廢物桶、無
菌通風櫥、37℃培養箱(incubator)、小鼠左肺均質液與 0.2 ml 全 血。
＊ 步驟：
4-1. 小鼠左肺及血液的處理
將左肺以電子天平秤秤重，之後以均質機在 10000 rpm、10 秒、4 ℃下共均質三次，均質液置於冰上，清洗質棒，15 ml 離 心管內裝 70 %酒精與無菌 1X PBS，順序為：70 %酒精二次，等 酒精乾燥後以無菌 1X PBS 清洗三次。清洗完均製棒後才能均質 下一管左肺；0.2 ml 全血置於冰上。
4-2. 左肺及血液的細菌培養
取老鼠之肺均質液與全血 100μl 用無菌 PBS 作 1:10 的連續 稀釋，各稀釋到 10-1、10-2倍，取均質液及全血與其 10-1、10-2倍 稀釋液各 100μl 均勻塗抹於 LB agar 上，將塗抹好的 LB agar 靜 置於 37℃培養箱中，培養 18 小時，18 小時後計算 LB agar 上的 菌落數。
五、肺泡巨噬細胞吞噬 Klebsiella pneumoniae 菌量之計數
＊ 材料：
15 ml 離心管(15 ml centrifuge tube)、滅菌一倍磷酸鹽緩衝溶 液(1X PBS)、滴管(dropper)、電動吸取器(electrical pipette)、無菌
吸管(5 ml pipettes)、細胞計數盤(hemacytometer; Hausser Scientific, USA)、計數器、顯微鏡(microscopy)、離心機、小鼠肺泡灌洗液、
玻片(micro slides glass; Daco)、玻片架、滴管(dropper)、cytospin 用固定架和 cytospin 用漏斗 (Shadon)、打洞濾紙(190005 Filter Cards; Shandon)、cytospin 離心機(cytospin 3; Shadon)、Giemsa 染 液(Meditech)、ddH2O、methanol、Gram stain Kit (Meditech)、光 學顯微鏡(Olympus)。
玻片(micro slides glass; Daco)、玻片架、滴管(dropper)、cytospin 用固定架和 cytospin 用漏斗 (Shadon)、打洞濾紙(190005 Filter Cards; Shandon)、cytospin 離心機(cytospin 3; Shadon)、Giemsa 染 液(Meditech)、ddH2O、methanol、Gram stain Kit (Meditech)、光 學顯微鏡(Olympus)。