藤素亦可抑制癌細胞的生長及轉移，誘發癌細胞走向凋亡，達到抗癌的 效果。目前應用中草藥物干擾癌細胞生長, 代謝, 增殖等過程，最後誘導 細胞凋亡，已成為治療癌症之新途徑。因此本研究計畫主要以分子層次 來研究魚藤素 (deguelin) 對人類非小細胞肺癌 NCI-H460 細胞株之凋 亡作用機轉，探討魚藤素是否能有效抑制肺癌細胞生長並誘發凋亡途 徑，達到抗癌的功效。
第二章 材料與方法
1. Deguelin, purity > 98% (HPLC)：購自 Sigma
2. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodine (DiOC6)：購自 calbiochem 3. 40% Acrylamide/Bis (29:1)：購自 Amresco
4. Agarose：購自 MD 生化有限公司
5. Ammonium persulfate (APS)：購自 Amresco
6. Annexin V-FITC apoptosis detection kit：購自 BD 7. BioMax Flim：購自 Kodak
8. Bovine serum albumin (BSA)：購自 Merck
9. Dimethyl sulfoxide (DMSO)：購自 Sigma Chemical Co.
10. Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)：購自 Merck 11. 10X TG-SDS buffer：購自 Amresco
12. ELC kit (Enhanced chemiluminescent kit)：購自 Amresco 13. Ethanol：購自 TEDIA
14. Fetal bovine serum (FBS)：購自 Invitrogen 15. Formaldehyle：購自 Sigma Chemical Co.
16. Glycine ：購自 Amresco 17. L-Glutamine：購自 Invitrogen
18. Low melting agarose (LMA)：購自 USB
19. Methanol：購自 TEDIA
20. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) ：購自 Amresco 21. N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)：購自 Amresco 22. Normal melting agarose (NMA)：購自 USB
23. Penicillin-Streptomycin (PS)：購自 Invitrogen 24. Phenethyl isothiocyanate：購自 Sigma Chemical Co.
25. PhiPhi Lux® kit：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD, USA) 26. CaspaLux8® kit：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD, USA) 27. CaspaLux9® kit：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD, USA) 28. Potassium chloride (KCl)：購自 Merck
29. Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ：購自 Merck 30. Propidium iodide (PI)：購自 Sigma Chemical Co.
31. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad
32. Protein extraction solution (PRO-PREP)：購自 iNtRON Biotechnology, Inc.
33. Protein marker：購自 Fermentas
34. RNase A (Ribonuclease A)：購自 Amresco 35. RPMI-1640 medium：購自 Invitrogen 36. Sodium chloride (NaCl)：購自 Merck
37. Sodium dodecyl sulfate (SDS)：購自 Amresco
38. Tris (Tris(hydroxoymethyl)-aminomethane)：購自 Amresco 39. Triton X-100：購自 Sigma Chemical Co.
40. Trypan Blue：購自 Sigma Chemical Co.
41. Trypsin-EDTA：購自 Sigma Chemical Co.
42. Tween-20：購自 Amresco 43. 顯影劑：購自 Kodak
44. 定影劑：購自 Kodak
45. AKT kinase kit: 購自 Cell Signaling Technology 46. Primary antibody (1°antibody)
(1) Anti-β actin：購自 Sigma Chemical Co.
(2) Anti-AIF：購自 BD
(3) Anti-Apaf-1：購自 Calbiochem
(4) Anti-Bad：購自 Cell Signaling Technology (5) Anti-p-Bad：購自 Cell Signaling Technology (6) Anti-Bax：購自 upstate
(7) Anti-Bcl-2：購自 biovision (8) Anti-Bid：購自 Chemicon
(9) Anti-Caspase-3：購自 Sigma Chemical Co.
(10) Anti-Caspase-9：購自 biovision (11) Anti-Caspase-8：購自 biovision
(12) Anti-p53: 購自 Cell Signaling Technology (13) Anti-PI3K p110: 購自 biovision
(14) Anti-PI3K p85α: 購自 biovision (15) Anti-AKT: 購自 biovision
(16) Anti-p-AKT (Thr308): 購自 Millipore (17) Anti-p-AKT (Ser473): 購自 Millipore (18) Anti-cytochrome c：購自 biovision
(19) Anti-Bcl-X: 購自 Cell Signaling Technology 47. Secondary antibody (2°antibody)
(1) Goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody:
購自 Chemicon
(2) Goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody:
購自 Chemicon
(3) Goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody:
購自 Chemicon 三, 儀器設備
1.無菌操作臺, 細胞培養皿, 細胞培養箱, 冷凍管, 恆溫離心機, 血球 計 數 板 , 倒 立 式 顯 微 鏡 , Dispenser, 1.5/ 15/ 50 ml 離 心 管 , Pipetmen。
2.去離子水製造機, 電源供應器, 酸鹼值測定器 (pH meter), PVDF menbrane, 震盪器, SDS-PAGE 電泳槽套組, Transfer Cell Bolt Kit 加熱板。
3.流式細胞儀, 高速離心機, 酵素免疫分析儀, 單細胞電泳槽。
第二節 實驗方法
圖九 本研究實驗流程圖
一、藥品配製
Deguelin 為固體粉末藥物，分子量為 394.42，純度為 98% 以上。利 用 DMSO 為溶劑配製成 10 mM 的庫存液 (stock solution)，並分裝於 1.5 ml 微量離心管。庫存液儲存於 -20℃ 冰箱中備用，於每次實驗前利 用 DMSO 稀釋成所需之濃度。
二、人類非小細胞肺癌 NCI-H460 細胞株培養與繼代
NCI-H460 細胞株所使用之培養基為 RPMI-1640，額外添加胎牛血清 (FBS), 抗生素 (PS) 與 L-Glutamine，使細胞培養基最終含有 10 % FBS, 1 % PS 與 2 mM L-Glutamine，培養於 5 % CO2 , 37 ℃ 之環境。由於 NCI-H460 細 胞 株 為 貼 附 型 細 胞 ， 因 此 每 次 繼 代或分盤時需要利用 Trypsin-EDTA 將細胞懸浮。首先利用磷酸緩衝液 (phosphate buffer saline,
PBS) 清洗細胞，再加入 0.5 mg/ml Trypsin-EDTA，等待 3~5 分鐘，當 細胞完全懸浮時，加入培養基以終止 Trypsin-EDTA 的反應。離心 1500 rpm，5 分鐘，完成後去除上清液，加入培養基稀釋細胞，取出稀釋後的
Propidium iodine (PI) 是一種核酸染劑，會與 DNA 雙股螺旋中之A＝T, C≣G 鍵結的氫鍵 (hydro bond) 結合。當細胞死亡時，其細胞膜會失去 完整性，使得 PI 可進入細胞內與核酸結合；相反之，存活的細胞因其 細胞膜完整，因此 PI 無法進入細胞內與核酸結合。經 PI 染色完成的細 胞可利用流式細胞儀偵測，死亡的細胞會呈現較強紅色螢光，然而存活
的細胞則呈現較弱紅色螢光。
實驗方法：
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/ml 的濃度種於 12 孔培養盤中，待細胞 貼附後加入不同濃度之魚藤素 (deguelin)，等待 48 小時，將上清液收至 離心管，加入 PBS 清洗細胞，利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待細 胞懸浮後加入 1 ml 培養基中和反應並將細胞收至離心管，完成離心後，
除去上清液，加入 PI 染劑，均勻混合後利用流式細胞儀進行樣品分析。
樣品之活細胞與死細胞數量及比率，利用 CellQuest® 軟體分析。
六、細胞生長抑制分析46 實驗原理:
利用 Trypan blue 染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完 整，染料無法滲入而不會呈色，藉此來分辨出活細胞與死細胞，再配合 血球計數盤以倒立式位像差顯微鏡觀察便可以計算出活細胞數。
實驗方法:
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/ml 的濃度種於 12 孔培養盤中，待細胞 貼附後加入 250 nM 濃度之魚藤素 (deguelin)，等待 0, 24, 48, 72 小 時，將上清液收至離心管，加入 PBS 清洗細胞，利用 Trypsin-EDTA 使 細胞懸浮，待細胞懸浮後加入 1 ml 培養基中和反應並將細胞收至離心 管。完成離心後，除去上清液，加入 10 ml 培養基於細胞懸浮液中。
最後取 10 ml 細胞液與 90 ml Trypan blue ( 0.4% w/v trypan blue ) 溶 液，混合均勻後以血球計數板計算 0, 24, 48, 72 小時之活細胞數目。
七、細胞染色質凝集現象47 實驗原理:
DAPI (4- 6-diamidino-2-phenylindole) 是 一 種 可 與 DNA 上 的 小 溝 (minor groove) AT 區域結合之核酸螢光染劑。細胞凋亡時會出現染色質 凝集 (chromosomes condensation) 與 DNA 斷裂 (DNA fragmentation) 的現象。當凋亡現象越嚴重，DNA 斷裂也越嚴重，minor groove 暴露出
八、DNA 膠體電泳分析 (DNA gel electrophoresis)48 實驗原理:
細胞凋亡時會伴隨 DNA 斷裂現象的發生，其細胞核內 DNA 會裂解成 180~200 bp (base pair)。因此純化 DNA 後，經電泳跑膠，觀察 DNA 斷 裂現象。若有 DNA 斷裂情形，其膠體經 UV 照射後會呈現階梯狀 (ladder)，可藉由 DNA marker 來得知其斷裂鹼基對，判斷是否為細胞凋 亡之特徵。
實驗方法:
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/ml 的濃度種於 12 孔培養盤中，細胞貼
附後利用不同濃度之魚藤素 (deguelin)，等待 48 小時，利用 Tissue and Cell Genomic DNA Purification Kit (Gene Mark) 純化 DNA。將上清 液收至離心管中，加入 PBS 清洗細胞，利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸
高速離心；丟棄液體，加入 600 μl Washing solution，高速離心；丟棄 液體，加入 600 μl Washing solution ，高速離心 5 分鐘；丟棄液體，
並更換已去上蓋之新 1.5 ml eppendorf，放入 55℃ 烘箱 3~5 分鐘，藉 以揮發殘留 Ethanol；將Elution Solution 預熱至 70℃，每個樣品加入 60 μl Elution solution 後，高速離心 1 分鐘，其液體內含 DNA。將樣品 與 6X DNA loading dye 以5：1 比例混勻，注入至 2% agarose (1g agarose, 50 ml 0.5X TBE buffer, 10μl Ethedium bromide) 膠體，以 100 V 進行電泳跑膠，完成後將膠體放至 UV 下照射拍照。
九、彗星試驗 (Comet assay)49 實驗原理:
彗星試驗又稱作單細胞電泳分析 (Single cell gel electrophoresis assay)，可 用來分析及定量 DNA 受損的程度，屬於一種簡單, 快速以及敏感性高 的技術。當 DNA 受損後發生斷裂，藉由電泳之方式將斷裂 DNA 拖出 膜外，之後加以染色。 DNA 受損越嚴重，拖尾現象越明顯，由此可藉 由拖尾的長短，觀察 DNA 損傷程度。
實驗方法:
表一 Alkaline buffer (pH=13)
組成 重量 (g)
NaOH 12 g
EDTA 0.347 g
DDW 將體積定量至 1000 ml
表二 Lysis buffer (需新鮮配製，pH=8~10)
組成 體積 (ml)
5M NaCl 100 ml
1M Tris 2 ml
0.5M EDTA 40 ml
Triton X-100 2 ml
DDW 56 ml
Total 200 ml
表三 Tris buffer (0.4 M，以 HCl 調整 pH=7.5)
組成 重量 (g)
Tris 48.456 g
DDW 將體積定量至 1000 ml
十、Annexin V affinity assay50 實驗原理:
細 胞 進 行 程 式 性 死 亡 - 細 胞 凋 亡 (apoptosis) 時 ， phospholipid phosphatidylserine (PS) 會從細胞膜內層向外轉移至外層，由於 Annexin V 為一種具有鈣離子依存性的磷脂質，它會與 PS 具有高度的專一性，
因此當在 Annexin V 上標記螢光物質時，便可偵測 PS 外翻的情形，同 時搭配 Propidium Iodide (PI) 染劑，透過雙染模式區別凋亡與壞死細胞。
實驗方式:
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/ml 的濃度種於 12 孔培養盤中，待細胞 貼附後加入 250 nM 濃度之魚藤素 (deguelin)，等待0, 24, 30, 36, 48 小
時，將上清液收至離心管，加入 PBS 清洗細胞，利用 Trypsin-EDTA 使
十一、粒腺體膜電位 (Mitochondrial membrane potential,
m) 之檢測51 實驗原理:在活細胞中，粒線體內膜電位較高，此時粒線體內膜間會充滿 H+，致使 膜電位探針 DiOC6 (3-3-Dihexyloxacarbocyanine iodine) 穿透細胞膜，專 一性結合於活細胞之粒腺體表面，此時利用流式細胞儀測得之螢光亮度 也越強；反之，細胞凋亡的過程中，粒腺體上由多個蛋白組成之通透性 轉變通道 (PT pore) 打開，使得粒腺體內膜通透性改變，造成粒腺體內 膜 H+ 梯度下降，相對結合的 DiOC6 變少螢光強度變弱。其螢光強度的 改變可反映出細胞膜電位 (mitochondrial membrane potential) 改變的情 形。
十二、鈣離子 (Ca2+)釋出之檢測52 實驗原理:
細胞內鈣離子可作為細胞信號傳遞的分子，是細胞啟動過程中重要的功 能因子。將螢光染劑 Fluo-3/AM 導入細胞後，在細胞內被內生性的 (endogenous esterases) 水解 (hydrolyze) 成 Fluo-3 ， Fluo-3 能滯留在細 胞內並跟鈣離子具有專一性的結合力。隨著細胞內鈣離子濃度的改變，
利用Caspase-3 substrate (PhiPhiLux-G1D2) 來檢測凋亡蛋白 caspase-3 之 活性。PhiphiLux- G1D2 基質是種含有螢光物質之胺基酸序列 ( amino acid sequence )，當 caspase-3 具有活性時，可裂解胺基酸序列之特定位 置，使得內含之螢光物質釋放出來，如此可利用流式細胞儀分析螢光含 量得知 caspase-3 活性。
實驗方法:
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/ml 的濃度種於 12 孔培養盤中，待細胞 貼附後加入 250 nM 濃度之魚藤素 (deguelin)，等待 0, 12, 24, 36, 48 小 時，將上清液收至離心管，加入 PBS 清洗細胞，利用 Trypsin-EDTA 使 細胞懸浮，待細胞懸浮後加入 1 ml 培養基中和反應並將細胞收至離心 管，離心完成去除上清液，加入 Caspase-3 substrate (PhiPhiLux-G1D2)，
混合均勻於 37℃ 水浴槽反應。反應完成，加入 Flow Cytometer Buffer ， 利用流式細胞儀進行樣品分析。樣品之螢光量以 CellQuest®軟體分析。
十四、西方墨點法 (Western blotting)53 實驗原理:
藉由抗體抗原反應來觀察蛋白質的變化。藉由特定抗體對特定胺基酸序 列具有專一性特性，當抗體與蛋白質抗原結合後，再以帶有 Horseradish peroxidase (HRP) 的二級抗體與一級抗體做結合。再利用 Enhanced chemiluminescent (ECL)呈色後，藉由感光底片吸收冷光而產生曝光。經 過顯影與定影步驟後，根據曝光程度區域大小就可以知道蛋白質表現量 的變化。
實驗方法:
(一)、蛋白質萃取 (protein extration)
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/dish 的濃度種於培養皿中，待細胞貼附
(二)、蛋白質定量分析
之後注入上層膠 (Stacking gel) 並插上齒梳 (comb)，避免氣泡產生，待 上層膠凝固後，將鑄好的膠體放置於電泳槽中，加入電泳緩衝液 (1X TG-SDS buffer)，接著將萃取出的蛋白依定量後之體積與 5X protein loading dye 混合，並以 95℃ 乾浴加熱 10 分鐘使蛋白質變性。完成後 依序將標示標準分子量的 Marker 及各樣品注入孔槽中，通以電壓80 volts，待樣品通過 stacking gel 後，電壓調為 110 volts，繼續電泳直到 染劑到達底端並停止。
(2) 轉漬
將轉漬夾打開後，黑色面朝下，將海綿墊片以 transfer buffer 潤濕並鋪在
將轉漬夾打開後，黑色面朝下，將海綿墊片以 transfer buffer 潤濕並鋪在