試劑配製:
表四 SDS-PAGE 下層膠 (Separating gel) 之配製及組成 組成
10% Separating gel
(四片量)
12% Separating gel (四片量)
DDW 9.6 ml 8.6 ml
40% Acryamine/Bis (29:1) 5 ml 6 ml 1.5 M Tris (pH=8.8) 5 ml 5 ml 10% SDS 0.2 ml 200 μl
10%APS 0.2 ml 200 μl
TEMED 20 μl 15 μl
表五 SDS-PAGE 上層膠 (Stacking gel) 之配製及組成
組成
5% Stacking gel
(四片量)
DDW 4.06 ml
40% Acryamine/Bis (29:1) 1.02 ml 1.5M Tris (pH=8.8) 1.66 ml
10% SDS 66 μl
10% APS 33.4 μl
TEMED 15 μl
表六 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8
組成 重量 (g)
Tris 36.3 g
DDW 150 ml
HCl 調整至 pH=8.8
加 DDW 將總體積定量至 200 ml
表七 0.5 M Tris-HCl, pH=6.8
組成 重量 (g)
Tris 3 g
DDW 40 ml
HCl 調整至 pH=6.8
加 DDW 將總體積定量至 50 ml
表八 電泳緩衝液 (Electrophoresis running buffer) 之組成
組成 體積
10 X TG-SDS buffer
(25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)
200 ml
加 DDW 將總體積定量至 2000 ml
表九 轉漬緩衝液 (Transfer buffer) 之組成
組成 重量 (g)
Tris 4.5 g
Glycine 21.6 g
Methanol 300 ml
加 DDW 將總體積定量至 1500 ml
表十 10X TBS之組成。配製成 1X TBST = 100 ml of TBS 10X + 900 ml DDW + 1ml Tween-20
組成 重量 (g)
Tris 24.23 g
NaCl 80.06
DDW 800 ml
HCl 調整至 pH=7.6
加 DDW 將總體積定量至 1000 ml
十五、免疫螢光染色 (Immunofluorescence Staining)54 實驗原理:
利用抗體專一性，以一級抗體送入細胞內結合所需偵測的蛋白質，藉由 二級抗體連接 Fluorescenin isothiocyanate (FITC) 螢光的方式，使標定 蛋白產生螢光，接著使用不同的螢光染劑標記細胞內胞器，如：細胞核, 粒 線體。藉由共軛焦顯微鏡 (Confocal microscope) 觀察細胞表現量的差 異，以及將兩種不同的螢光個別拍照，最後將兩者疊合觀察蛋白是否有 轉位 (translocation) 的現象發生，進行控制組與實驗組的比較。
實驗方法:
實驗方法:
(1) 蛋白質萃取
NCI-H460 細胞株以 1×105 cells/dish 的濃度種於培養皿中，待細胞貼附 後加入 250 nM 濃度之魚藤素 (deguelin)，等待 0, 12, 24, 36, 48 小時。
反應時間終止，將培養基去除，以冰的 1X PBS 清洗細胞表面，加入 0.2 ml 1X Cell Lysis Buffer (20 mM Tris pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA，
1% TrionX-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β−Glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin, 1 mM PMSF)，至於冰上 5 分鐘，將細 Kinase Buffer (25 mM Tris pH7.5, 5 mM β−Glycerolphosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4, 10 mM Mgcl2) 各別清洗 beads。完成後於每一樣品中加 入 50 μl Kinase Bufer, 10 μl ATP 及 2 μg GSK 3 Fusion Protein，置於 30
℃ 乾浴作用 30 分鐘，之後加入 25 μl 3X SDS Sample Buffer ( 187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6﹪w/v SDS, 30﹪glycerol, 150 mM DTT, 0.3﹪W/V bromphenol blue) 終止反應。
(4) 西方墨點法
將樣本以 95℃ 處理 5 分鐘，至於冰上，用西方墨點法 (請參考前述步 驟) 分析樣品中 p-GSKα/β的量。
十七、統計分析 (Statistics analysis)
實驗結果以平均值標準差 (mean ± SD) 表示，使用 Student’s t-test 來決 定實驗組與對照組之差異。當 p 值小於 0.05 時則認為具有統計上意 義，以＊表示 p < 0.05。
第三章 研究結果
第一節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 細胞形態之影響
人類非小細胞肺癌 NCI-H460 細胞株處理不同濃度之魚藤素 (0, 100, 200, 300, 400, 500 nM)，培養 48 小時之後，以倒立式像位差顯微鏡放大 觀察細胞型態變化，可以發現細胞經魚藤素處理，隨著藥物濃度的提高，
細胞在外觀上有皺縮變小的現象。
圖十 利用倒立式像位差顯微鏡觀察 NCI-H460 細胞株經不同濃度魚藤 素處理培養 48 小時，細胞型態之變化。 NCI-H460 細胞株隨著魚藤素 藥物濃度上升，細胞呈現皺縮現象。
第二節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 細胞存活率之影 響
利用流式細胞儀分析細胞存活率，經核酸染劑 PI 染色後，螢光強 度較弱為活細胞，螢光較強為死細胞，依螢光強弱的差別即可分析出細 胞存活率。結果得知魚藤素對 NCI-H460 細胞株具有毒殺作用，並在量 化中顯示有藥物劑量依存性 (dose-dependent) 的現象，亦即隨著藥物濃 度提高 (0, 100, 200, 300, 400, 500 nM) 細胞存活率隨之下降。根據存活 率試驗的結果，當利用 250 nM 之魚藤素藥物作用於 NCI-H460 細胞 株 48 小時，可達半數致死率，故選擇此 IC50 作為之後實驗的濃度依據。
圖十一 利用流式細胞儀偵測得知 NCI-H460 細胞株經不同魚藤素藥物 濃度 (0, 100, 200, 300, 400, 500 nM) 處理後培養 48 小時之細胞存活率。
＊表示以 student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差 異，p＜0.05。
第三節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 細胞生長抑制之 影響
取魚藤素藥物劑量 250 nM 作用於 NCI-H460 細胞株不同時間點 (0, 24, 48, 72 h) 後，利用血球計數盤與 Trypan blue 計算細胞數。由於 Trypan blue 可以染死細胞而活細胞不會被染色，藉此來分辨出活細胞與 死細胞，再配合血球計數盤以倒立式像位差顯微鏡觀察便可以計算出活 細胞數。根據此實驗可得知，魚藤素 250 nM 作用於 NCI-H460 細胞株 0, 24, 48, 72 小時之後，其細胞數持續減少，由量化分析顯示魚藤素能抑制 NCI-H460 細胞株的生長。
圖十二 利用 Trypan blue 染色計算細胞數，以倒立式像位差顯微鏡觀察 NCI-H460 細胞株經 250 nM 魚藤素處理不同時間點，細胞數目之變化。
＊表示以student’s t-test 進行分析各時間點實驗組與控制組之間存在之顯 著差異，p＜0.05。
第四節 魚藤素對人類非小型肺癌細胞 NCI-H460 細胞株誘導凋亡之影 響
當細胞凋亡時，磷脂絲氨酸 (PS) 會外翻至細胞膜外，藉由 Annexin V 與 PS 有高度結合性的特性，在 Annexin V 上標定 FITC 螢光物 質，另外搭配 PI 染劑進行細胞雙染，以流式細胞儀偵測其螢光量，即 可得知細胞凋亡及壞死程度。由結果顯示，當NCI-H460 細胞株經 250 nM 之魚藤素誘導，隨時間增加 (0, 24, 30, 36, 48 h)，凋亡程度明顯上升，代 表魚藤素可誘發 NCI-H460 細胞株之凋亡作用。
(A) (B)
圖十三 NCI-H460細胞株經 250 nM 魚藤素處理後，培養不同時間點。
(A) 利用流式細胞儀偵測早期細胞凋亡。(B) 凋亡細胞量化圖。
＊表示以student’s t-test進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差 異，p＜0.05。
第五節 觀察魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) DNA 受損
Fluorescence of intensity (% of control)
0
二、DNA膠體電泳 (DNA gel electrophoresis)
當細胞 DNA 受損的時候，利用 DNA 膠體電泳可看出其成階梯狀分 佈，即有所謂的DNA ladder 的表現。實驗結果顯示，伴隨著處理藥物濃 度的增加，DNA 斷裂的現象有明顯的表現。結果顯示魚藤素會造成 NCI-H460 細胞株之 DNA 受損。
圖十五 魚藤素對 NCI-H460 細胞株之 DNA 斷裂的影響。經不同濃度魚 藤素 (0, 50, 250, 500 nM) 處理細胞 48 小時後，利用 DNA 膠體電泳偵 測 DNA 斷裂之現象。圖中箭頭所指之處為 DNA ladder 現象。
三、彗星試驗
Comet length (folds of control)
0
第六節 魚藤素對人類非小型細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 粒線體之影響。
以 250 nM 之魚藤素處理 NCI-H460 細胞株後，經 0, 12, 24, 36, 48 小 時 ， 利 用 流 式 細 胞 儀 偵 測 DiOC6 螢 光 量 觀 察 粒 線 體 電 位 (Mitochondrial membrane potential, MMP,
m) 的變化。隨著處理藥物時 間越長， DiOC6 螢光量下降，結果顯示魚藤素會影響粒線體膜電位並使 其下降。(A) (B)
Time of incubation (h)
0 12 24 36 48
第七節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 粒線體凋亡路徑
(Mitochrondria-dependent apoptotic pathway) 相關蛋白之影響
以 西 方 墨 點 法 觀 察 粒 線 體 凋 亡 路 徑 相 關 蛋 白 ， 發 現 促 凋 亡 (pro-apoptosis) 蛋 白 – Bid, Bak, Bax 蛋 白 表 現 量 上 升 ； 抗 凋 亡 (anti-apoptosis) 蛋白 - Bcl-2 蛋白表現量被抑制；促進 cytochrome c 和 AIF 蛋白表現量。另外， cytochrome c 會誘發 Apaf-1 和 caspase-9 結 合，形成凋亡體 (apoptosome) ，進而引起 caspase-3 之活化，實驗結果 顯示 Apaf-1 之表現量上升，且 caspase-9 與 caspase-3 有被裂解的情 形。此現象證明魚藤素會影響粒腺體，使其功能喪失而促使凋亡相關蛋 白的表現，
(A)
(B)
(C)
圖十八 粒線體路徑之凋亡相關蛋白表現變化。 NCI-H460 細胞株以 250 nM 之魚藤素處理後，經 0, 12, 24, 36, 48 小時，利用西方墨點法檢測 (A) 粒腺體膜上促凋亡蛋白 (Bid, Bak, Bax) 表現量之變化； (B) 存於粒線 體內之凋亡相關蛋白 cytochrome c 和 AIF 之蛋白表現變化； (C) 關於 粒線體內在路徑之凋亡相關蛋白 Apaf-1, caspase-9, caspase-3 之表現變 化。
第八節 利用免疫螢光染色探討魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460
cells) 凋亡相關蛋白之表現與轉移之影響
以 250 nM 魚藤素處理 NCI-H460 細胞株 0, 24, 48 小時後，利用 免疫螢光染色與共軛焦顯微鏡觀察凋亡蛋白轉移之現象。實驗結果顯 示，當細胞以藥物處理 24, 48 小時之後， AIF 大量的表現並轉位至細 胞核中，造成 DNA 受損。
圖十九 魚藤素對於 NCI-H460 細胞株內 AIF 的表現與轉移之影響。
NCI-H460 細胞株以 250 nM 魚藤素處理，經過 0, 24, 48 小時，利用免 疫螢光染色與共軛焦顯微鏡觀察 AIF 蛋白的表現與轉位。
第九節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 之凋亡蛋白酶
(caspase) 活性之影響
本實驗利用 PhiPhiLux 偵測細胞內 caspase-3 活性之變化。由實驗結 果得知，NCI-H460 細胞株經 250 nM 魚藤素處理 0, 24, 48 小時之後，
caspase-3 螢光強度增加，即代表 caspase-3 之活性明顯上升。故可由此 推測魚藤素可誘導 NCI-H460 細胞株走向細胞凋亡。
(A) (B)
圖 二 十 250 nM 魚 藤 素 作 用 於 NCI-H460 細 胞 株 不 同 時 間 點 ， 以 PhiPhiLux 螢光染劑分析細胞內 caspase-3 活性的變化。(A) 以流式細胞 儀偵測細胞內 caspase-3 活性之螢光強度；(B) Caspase-3 活性量化統計 圖。＊表示 student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著 差異，p＜0.05。
第十節
Pan-caspase (Z-VAD-FMK) , caspase-3 (Z-DEVE-FMK) 及 casepase-9 (Z-LEDH-FMK) 凋亡蛋白酶抑制劑對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 之存活率影響
利 用 Z-VAD-FMK (2 μ M), Z-DEVE-FMK (10 μ M) 和 Z-LEDH-FMK (2μM) 先加入細胞前處理 (pre-treatment) 2 小時，之後再 以 250 nM 魚藤素作用於 NCI-H460 細胞株 48 小時後，利用流式細胞 儀偵測其存活率。實驗結果顯示，加入 Z-VAD-FMK, Z-DEVE-FMK 和 Z-LEDH-FMK 凋亡蛋白酶抑制劑能使細胞存活率有回升之趨勢，亦即代 表本研究推測魚藤素能誘發細胞凋亡之粒腺體內在路徑是被證實的。
圖二十一 凋亡蛋白酶抑制劑對魚藤素誘發 NCI-H460 細胞株凋亡現象 之存活率變化。 ＊表示 student’s t-test 進行分析各抑制劑添加實驗組與 魚藤素單獨處理組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
第十一節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) 細胞內鈣離子
(Ca
2+) 釋出的影響
以 250 nM 魚藤素處理 NCI-H460 細胞株後，經 0, 12, 24, 36, 48 小 時，利用流式細胞儀偵測 Fluo-3/AM 螢光量，觀察 Ca2+ 在細胞內的濃 度變化情形。當細胞經藥物處理後，由圖可觀察到 Fluo-3/AM 螢光量有 增強之趨勢，即推測魚藤素可誘使 NCI-H460 細胞內之 Ca2+ 濃度增加。
(A) (B)
圖 二 十 二 魚 藤 素 對 NCI-H460細 胞 內 鈣 離 子 (Ca2+) 濃 度 之 影 響 。 NCI-H460 細胞以 250 nM 魚藤素處理後，經 0, 12, 24, 36, 48小時後，
利用流式細胞儀觀察鈣離子在細胞內的表現情形。(A) 利用流式細胞儀 觀察鈣離子在細胞質內之螢光變化量；(B) 鈣離子於細胞內釋出之量化 圖。 ＊表示 student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著 差異，p＜0.05。
第十二節 魚藤素對人類非小細胞肺癌 (NCI-H460 cells) Bad 蛋白之調 控