魚針草萃取物對 FaDu 癌細胞之凋亡影響

魚針草萃取物對FaDu細胞的細胞週期影響。首先，將 Fadu細胞以 5 × 10⁴ 分 盤至 24 well 培養盤，經培養 24 hr 後，以IC50 值(60 μg/ml)附近的濃度(45 μg/ml、60 μg/ml、75 μg/ml及90 μg/ml)之魚針草萃取物、正控制5-Fu (100 μg/ml) 及 控制組0 μg/ml處理24 hr、48 hr及72 hr。利用propidium iodine (PI, 核酸螢光染劑) 會進入細胞內後嵌入雙股 DNA的特性，對於各不同濃度處理過的FaDu細胞使用 流式細胞儀辨別細胞週期的差異。

由圖 3 數據顯示，FaDu口腔癌細胞經由魚針草萃取物處理48小時，將隨著 劑量的增加而增加細胞停滯於G2/M phase的比例。起一開始 Control 組 (0 μg/ml) 的G2/M phase有27.85%，到濃度90 μg/ml時顯著上升至39%；同時伴隨著G0/G1

phase的減少，Control 組從原本的49.47%，在濃度為90 μg/ml時降低至34.43%，

而S期的表現則未有太大的變化，但在90 μg/ml則有大量增加的趨向。整體而言，

當魚針草萃取物處理FaDu細胞48小時的時候，隨著劑量的增加將可顯著的使細胞 週期停滯在G2/M phase。為了再進一步的觀察魚針草萃取物對於FaDu細胞的作 用，於是將進一步的拉長處理時間達72 hr，可以發現到結果與48小時相一致，隨 著魚針草萃取物劑量的增加，G0/G1 phase隨之減少，從一開始的Control 組的 49.47%，在濃度為90 μg/ml時降低至27.37%，而S期的表現則仍未有太大的變化；

G2/M phase在濃度90 μg/ml時，則顯著增加到48.48%，可以明顯發現到是G2/M phase arrest的狀況。相較於正對照組 5-FU 在 100 μg/ml 時，則是發生 S phase arrest，且隨著處理時間增長此一現象更為明顯。由此可知，魚針草萃取物對FaDu

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細胞抑制作用為促使細胞生長停滯於 G2/M phase。

G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M

C e ll cy cl e D ist ri but ion ( % )

0

此時磷脂絲氨酸(phosphatidylserine, PS)會暴露在細胞外環境中與 Annexin V 結 合，此時會顯示出 Annexin V positive (橫軸, FL1-H)現象。一般而言，因為LR (右 下角)區域是只有染上FITC-Annexin V，所以認為是早期凋亡。；當細胞是壞死 (necrosis)時，細胞膜破裂，導致 PI 直接與 DNA 結合，顯示出 PI positive (縱軸, FL2-H)現象，即以UL (左上角)區域而論；當細胞凋亡至晚期時，細胞膜持續皺縮 至破裂，PI進入細胞中與 DNA 結合，顯示出 Annexin V/PI positive 現象，於是 UR (右上角區)會被認為是細胞凋亡末期或是細胞壞死所致。將5 × 10⁴個FaDu細 胞接種於 24-well培養盤，經24 hr 培養後，加入不同濃度魚針草萃取物處理24、

48 hr

72 hr

圖 3. 不同濃度的魚針草萃取物對FaDu口腔癌細胞分別處理48 小時或 72 小時的

生長週期分佈之影響。

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48與 72 hr 後，以 trypsin-EDTA 處理並收集細胞進行 Annexin V/PI stainning，

再利用流式細胞儀檢測細胞死亡類型。

FITC-Annexin V

圖 4. 魚針草萃取物於不同濃度處理24 hr 對FaDu癌細胞凋亡程度。(A) Control, (B) Vehicle, (C) 45 μg/ml, (D) 60 μg/ml, (E) 75 μg/ml, (F) 90 μg/ml。LL:左下角象限，UL:左上 角象限，LR:右下角象限，UR:右上角象限。未加藥處理的0 μg/ml為Control組，DMSO 為Vehicle (濃度為0.50%)。

由圖4顯示，在FaDu經魚針草萃取物處理24 hr時，細胞群落尚未有明顯的變 化，而從圖5及圖6的數據中顯示，當FaDu細胞未經魚針草萃取物處理時(Control 及Vehicle)時，細胞群落大部分聚集在LL區域(即為Annexin V/PI stainning皆為 負)，48 與 72 hr 的LL區域為88-90 %，但是當以魚針草萃取物處理 FaDu 細胞 48小時後，隨著藥物處理濃度提高，群聚於左下角LL象限細胞群明顯減少(90 μg/ml在48 hr 的LL區僅29.55 %; 72 hr 的LL區也降至7.53 %)，而右下角LR象限之 細胞累積量有增加的傾向(90 μg/ml在48 hr 的LR區為10.57%; 72 hr的LR區增加至

PI

60 μg/ml Control (A)

UL UL

LL LR

DMSO

(B) (C) 45 μg/ml

(D) (E) 75 μg/ml (F) 90 μg/ml

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19.93%)，同時伴隨著左上角UR象限的明顯增加(90 μg/ml在48 hr的UR區為54.37%;

72 hr 的UR區增加至67.76%)。由圖7中更可直接比較當FaDu細胞處理魚針草萃取 物後，細胞群落在48 hr及72 hr的變化。從兩個不同時間點的結果都可以明顯看出 細胞群落皆由LL區域移向LR及UR區域，顯示FaDu細胞隨著魚針草萃取物劑量的 增加會誘導FaDu細胞走向早期凋亡及晚期凋亡。

FITC-Annexin V

圖 5. 魚針草萃取物於48 hr不同處理濃度對FaDu癌細胞凋亡程度。(A) Control, (B) Vehicle, (C) 5-Fu (100 μg/ml), (D), (E) 60 μg/ml, (F) 75 μg/ml, (G) 90 μg/ml。未加藥處理的 0 μg/ml為Control組，DMSO為Vehicle (濃度為0.50%)。

PI

UL UR

LL LR

Control DMSO 5-FU

45 μg/ml 60 μg/ml 75 μg/ml

90 μg/ml

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

(G)

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FITC-Annexin V

圖 6. 魚針草萃取物於不同濃度處理72 hr對FaDu癌細胞凋亡程度。(A) Control, (B) Vehicle, (C) 5-Fu (100 μg/ml), (D) 45 μg/ml, (E) 60 μg/ml, (F) 75 μg/ml, (G) 90 μg/ml。未加 藥處理的0 μg/ml為Control組，DMSO為Vehicle (濃度為0.50%)。

PI

(A) (B)

UL UR

LL LR

Control DMSO ^(C) 5-FU

45 μg/ml

(D) (E) 60 μg/ml

90 μg/ml (G)

75 μg/ml (F)

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LL UL LR UR LL UL LR UR

P e rc e n ta g e (% )

0 20 40 60 80 100

5-Fu Control Vehicle 45 μg/ml 60 μg/ml 75 μg/ml 90 μg/ml

圖 7. 不同濃度的魚針草萃取物(45、60、75、90 μg/ml)，對FaDu口腔癌細胞分別處理48 小時或72小時的凋亡程度。LL:左下角象限，UL: 左上角象限， LR: 右下角象限，UR:

右上角象限。未加藥處理的0 μg/ml為Control組，DMSO為Vehicle (濃度為0.50%)。

圖8. 不同濃度的魚針草萃取物(45、60、75、90 μg/ml)，對 FaDu 口腔癌細胞處理 24 hr 後細胞的壞死程度。未加藥處理的0 μg/ml 為 Control 組，DMSO 為 Vehicle(濃度為 0.50%)。

為了更進一步了解魚針草萃取物對於FaDu細胞的影響，於是將進行Trypan

48 hr

72 h

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Blue Exclusion Assay試驗，觀察FaDu細胞在經由魚針草萃取物處理時細胞壞死 率。由於Trypan blue分子量極大，所以當細胞膜完整時不會被染色。從圖 8 結果 中可以發現到在24 hr時，隨著萃取物濃度的增加，被Trypan blue染上色的細胞也 會隨之增加。在Control 組僅0.88%會染上色; 但隨著萃取物濃度的增加，染色率 會隨之增加；在濃度為45、60、75 μg/ml時，所染上Trypan blue的比率依序為 8.28%、16.9%、23.5%。可以發現到相對於未添加魚針草萃取物的Control組及 Vehicle組，魚針草萃取物在高濃度確實會對於癌細胞產生皺縮破裂的毒殺效果。

隨後，本研究使用DNA fragmentation assay 來瞭解 FaDu 癌細胞的皺縮破裂 是否與凋亡相關。將以萃取物處理 48 小時及 72 小時候後之細胞樣品，藉由 1.8%

的agarose gel 觀察細胞是否有 DNA 片段化(DNA ladder)的現象產生。由於 DNA 片段化為凋亡較晚期才會產生的結果，故本實驗所選用時間點較長。

AIE conc. (μg/ml) AIE conc. (μg/ml)

M 5-Fu 0 45 60 75 M 5-Fu 0 45 60 75

圖9. 以不同濃度魚針草萃取物對 FaDu 細胞分別處理 (A) 48 hr，及(B) 72 hr 的 DNA 斷裂情形；其中5-FU (100 μg/ml) 為正控制組；M 為 Marker，表示不同分子量。

44 (Bcl-2、Bcl-xl)、促凋亡蛋白(Bad、Bax、Bak)以及 caspase

Relative density (% of control)

0

Relative density (% of control)

0