蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在家兔

A. HPLC 分析條件

層析管(Column)：Merck LiChrospher 100 RP-18 endcapped (250 mm ×4 mm , 5μm)

保護管柱(Pre-column)：Merck LiChrospher l00 RP-18 endcapped (5 μm) 檢測波長： UV 359 nm

流速： 1.0 ml/min

注入量： 50 μl

分析時間： 18 min

移動相：Methanol：Water ( 50：50 )

內部標準品：7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）200 μg/ml

B. 血漿檢品之前處理

用微量移液管精確量取血漿檢品200.0 μl 置於玻璃試管中，加入濃 度200 μg/ml 之 7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）內標溶液 20 μl，

再加入乙腈溶液600 μl，並以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。

以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μl 置於另一試管 中，以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以甲醇200 μl 完全溶解之，接著 以微量吸管吸取置於小瓶(vial)中，注入 50 μl 於高效液相層析儀中分 析。

C. 檢量線 (Calibration curve)之製作

精確量取家兔空白血漿180 μl，各管分別加入濃度為 400.0 至 2.0 μg/ml 之 Aloin 及 Isobarbaloin 標準溶液 20 μl，再加入濃度為 200 μg/ml 的7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，配製成濃度為 40.0-0.2 μg/ml 之標準血漿檢品液(表 2)。再加入乙腈 600 μl，以振盪器振盪 30 秒，

使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清 液600 μl 置於另一試管中，以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以甲醇 200 μl 完全溶解之，接著以微量吸管吸取至於小瓶(vial)中，注入 50 μl 進 行高效液相層析儀分析。將Aloin 和 Isobarbaloin 與 7-hydroxy-coumarin 的波峰面積比與對照標準血漿檢品濃度作線性回歸以製作標準曲線。

表2 Aloin、Isobarbaloin 標準濃度血漿檢品溶液之製備

標準溶液濃度(μg/ml)

各取20 μl 濃度 (μg/ml) Aloin Isobarbaloin

空白血漿 體積(μl)

內標溶液 體積 (μl)

Aloin Isobarbaloin 400 400 180 20 40 40

200 200 180 20 20 20

100 100 180 20 10 10

50 50 180 20 5 5

25 25 180 20 2.5 2.5

10 10 180 20 1 1

5 5 180 20 0.5 0.5

2 2 180 20 0.2 0.2

D. 相對回收率(Relative Recovery)試驗

目的在比較添加aloin 及 isobarbaloin 在空白血漿和空白溶液(甲醇) 中，經血漿檢品之前處理步驟處理後檢出量之差異比。實驗步驟如同 校正曲線製作中對檢品之處理過程。回收率可從下式求得:

Recovery(%) = × 100 %

E.精密度 (Precision) 與準確性 (Accuracy) 試驗

為了確認 aloin 及 isobarbaloin 定量分析方法之精確性，因此以同 日 內(Intraday) 及 間 日 內 (Interday) 的 精 密 度 (Precision) 與 準 確 性 (Accuracy)來比較。

(1) 同日內(Intraday)試驗:

以不同濃度含aloin 及 isobarbaloin 標準濃度血漿檢品，分別於同 一日的早上、中午、晚上分別各取濃度為200.0 、50.0、5.0 μg/ml 之 aloin 和 200.0、50.0、5.0 μg/ml 之 isobarbaloin 標準液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再加入濃度為 200 μg/ml 7-hydroxy-coumarin 內 標溶液20 μl。即得 aloin 濃度為 20、5.0、0.5 μg/ml，及 isobarbaloin 濃度為20.0、5.0、0.5 μg/ml 之血漿檢品(n=3)，計算各個校正濃度之 平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)及誤差(Error)。以確定 HPLC 定量法之精密度(Precision)及準確性(Accuracy)。

plasma standard peak area ratio

Mobile phase standard peak area ratio

(2) 間日內(Interday)試驗:

若 於 不 同 天 以 同 日 內 (Intraday) 試 驗 方 法 操 作 可 得 到 間 日 內 (Interday) 的精確性比較。

F. 靈敏度 (Sensitivity) 試驗

分析過程中，欲找出能被檢定出之最低濃度，但不需要能夠被定 量，故稱做最低偵測極限試驗(Limit of detection, LOD)，經使用指標成 分aloin、isobarbaloin 標準品溶液經逐步稀釋後，溶液以 HPLC 方法分 析，由Signal 對 Noise 比為 3:1。而偵測極量 (Limit of quantitation, LOQ），將依前述「檢量線之製作」，採標準濃度血漿檢品製備方法，

取六次檢品分析決定之。

LOD=S/N >3/1 LOQ=LOD × 3.3 S: Signal

N: Noise

G. 安定性 (Stability) 試驗

(1) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿中於-30 ℃下之安定性試驗：

取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、

50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，振 盪30 秒混合均勻，將之置於-30℃的冷凍櫃中，於第 0 , 1 , 3 , 6 , 10 , 15 ,

(2) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿去蛋白-30℃下之安定性試驗：

取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、

50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再 加入濃度為200 μg/ml 之 7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，再加入 乙腈600 μl，以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於 4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液。然後置於-30℃的冷凍櫃中，於 第0 , 1 , 3 , 6 , 10 , 15 , 21 天分別取出一組檢品(n=3)。解凍後，吹氮氣 處理，加入200 μl 甲醇，以 HPLC 分析，觀察 aloin 及 isobarbaloin 之 濃度變化情形。

(3) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿中於 25 ℃下之安定性試驗：

取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、

50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，振 盪30 秒混合均勻，置於室溫下，於第 0 , 1 , 3 , 6 , 12 , 24 , 48 小時，分 別取出一組檢品(n=3)，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分 析，觀察aloin 及 isobarbaloin 之濃度變化情形。

(4) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿去蛋白 25 ℃下之安定性試驗：

取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、

50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再 加入濃度為200 μg/ml 之 7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，再加入 乙腈600 μl，以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於 4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液。然後置於室溫下，於第 0 , 1 , 3 ,

6 , 12 , 24 , 48 小時分別取出一組檢品(n=3)。吹氮氣處理，加入 200 μl 甲醇，以HPLC 分析，觀察 aloin 及 isobarbaloin 之濃度變化情形。

2. Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔體內之藥物動力學

A.實驗設計

取雄性家兔六隻，體重介於3.0 至 4.0 公斤之間，每隻家兔以蘆薈大黃 苷(aloin)及異蘆薈大黃苷(isobarbaloin)混合液，以靜脈(IV)注射與口服 (P.O)給藥。實驗家兔之重量、劑量及給藥順序標示於表 3，每次給藥 後至下次給藥，時間須相隔一週以上。

表 3 實驗家兔之體重

隻

兔重(kg) No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 Aloin 及 Isobarbaloin

IV (20 mg/kg) 3.1 3.3 3.9 3.53 3.2 3.42 Aloin 及 Isobarbaloin

IV (30 mg/kg) 3.36 3.3 3.06 3.53 3.64 3.5 Aloin 及 Isobarbaloin

IV (40 mg/kg) 3.9 3.65 3.54 - - - Aloin 及 Isobarbaloin

PO (100 mg/kg) 4.02 3.94 3.65 - - - Aloin 及 Isobarbaloin

3.54 3.68 3.58 - - -

B. 給藥法及檢品處理

(1) 蘆薈大黃苷(Aloin)及異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin)混合液靜脈注射 給藥

實驗前家兔先秤重紀錄實際體重以便配置給藥劑量。實驗時將兩 耳之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其兔耳血管擴 張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈置留針，將針塞 (Injection plug)注滿肝素鈉溶液約 1 ml，以防靜脈置留針內之血液凝固。

投藥前先抽取 1.5 ml 之空白血液。靜脈注射給藥時由另一耳投 藥，分別於投藥後 5，10，15，20，30，40，60，90，120，150，180，

210，240，270 分鐘由靜脈置留針之針塞抽取 1.5 ml 血液，置於真空 採血管中，以 4000 rpm 轉速離心 20 分鐘後取出上層血漿，依前述血 漿檢品之處理步驟分析定量之，並立即進行分析。

(2) 蘆薈大黃苷(Aloin)及異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin)混合液口服給藥

口服給藥實驗前家兔至少禁食24 小時，實驗期間亦不進食。實驗 時將兩耳之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其兔耳血 管擴張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈置留針，將針 塞(Injection plug)注滿肝素鈉溶液約 1 ml，以防靜脈置留針內之血液凝 固。

投藥前先抽取1.5 ml 之空白血液。以張口器將家兔之口張開後，

再以胃管插入給藥。投藥前先抽取1.5 ml 之空白血液。給藥後之 10，

20，30，40，60，90，120，150，180，210，240，270，300，360 分 鐘由靜脈滯留針之針塞抽取1.5 ml 血液，置於真空採血管中，以 4000 rpm 轉速離心 20 分鐘後取出上層血漿，依前述血漿檢品之處理步驟分 析定量之，並立即進行分析。

C. 數據處理

各種給藥方法所取得之血漿檢品經HPLC 法定量後，依標準曲線 換算蘆薈大黃苷(Aloin)及異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin)之血中濃度數據 後，利用電腦程式WinNonlin，分別利用配適後的分室來計算相關之藥 物動力學參數。

第四章 結果與討論

1. 蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）之 HPLC 定量 法

根據 Nobuyuki Okamura 等⁽²⁵⁾的實驗表示，將蘆薈經甲醇多次萃 取，再離心、過濾所得檢品，採用 HPLC-UV 的分析法，在檢測波長 290nm，流速為 1.0ml/min，以水與乙腈為移動相作梯度沖提，結果可 將蘆薈之十種指標成分完全分離，得到清晰的層析圖。高鈞等⁽²⁴⁾的實 驗也顯示，若以甲醇、水、冰醋酸為移動相，檢測波長 359nm，也可 得到蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷等清晰的層析圖。Chen JD⁽²⁹⁾等實驗也 顯示，若以甲醇、水為移動相，檢測波長 298nm，也可得到相同清楚 的層析圖。

本研究定量分析法，是將配製好的蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈 大黃苷（Isobarbaloin）標準溶液，加入含 200μg/ml 7-羥基香豆素

（7-Hydroxy-coumarin）之乙腈溶液，取上清液以氮氣噴吹至乙腈完全 逸離後，以適當甲醇溶解之，再以HPLC 分析。經多次試驗與修正後，

找出最適當定量的分析條件。

故採用HPLC-UV 分析法，在檢測波長 359nm，流速為 1.0ml/min，

以甲醇、水（50：50）為移動相，於 18 分鐘內完成分析。而層析圖中 蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）波峰分別與其內 部標準品7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）的波峰之間清晰且穩 定，較無干擾波峰。可見本法分離效果良好，具專一性。如圖五所示。

但於分析過程中，發現蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷之間極為不穩 定，兩者會發生異構化反應，產生立體選擇性轉化產物，此為腸內細 菌與中藥成分結構的生物轉化功能（biotransformation）。一般可經由水 解反應、氧化反應、還原反應、異構化反應、含氧化合物向氮化合物 的轉化，脫醯基化作用、酯化作用、聚合作用、碳苷水解作用等類型，

來進行多種生物轉化反應，若利用腸內菌，則具有高度選擇性、立體 選擇性及一般化學方法難以實現的反應，一般以水解作用為主，也常 見氧化和還原作用。

蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷在甲醇溶液中，48 小時內呈穩定狀態

(24)。本研究經簡便的實驗表示，蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷之甲醇溶 液，在25℃、8℃、-30℃時，會分別漸進在 24 小時、21 天、0 天，產 生漸進之異構化反應。並嘗試加入 0.1N 冰醋酸來防止苷類化合物於 HPLC 分析方法下產生離子化現象，造成波峰拖尾出現，但未獲得明 顯改善，可見蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷之甲醇溶液於-30℃下才呈穩 定狀態，不易被分解，故實驗過程中，應新鮮配製使用及注意溶液之 安定性及保存性。

2. 蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在血漿檢品中 之HPLC 定量法

本研究定量分析法，是將配製好的蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈 大黃苷（Isobarbaloin）混合液給藥後取得之血漿檢品，每 200μl 血漿 檢品中，加入含200μg/ml 7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）之乙 腈溶液，進行去蛋白處理，取上清液以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，

適當定量的分析條件。

採用HPLC-UV 分析法，在檢測波長 359nm，流速為 1.0ml/min，

以甲醇、水（50：50）為移動相。層析圖中空白血漿與蘆薈大黃苷（Aloin）

及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）波峰分別與其內部標準品 7-羥基香豆 素（7-Hydroxy-coumarin）的波峰之間清晰且穩定，較無干擾波峰。其 滯留時間分別為 13、11 及 5 分鐘，總分析時間為 18 分鐘，可見本法 分離效果良好，具專一性。如圖五所示。

利用本法所製備血漿檢品之檢量線，其二個指標成分aloin 及 isobarbaloin，各取八個血漿濃度點，濃度範圍為 0.2～40 μg/ml；與 7-Hydroxy-coumarin 波峰面積比的回歸方程式分別為 X=(Y-0.015)/

0.0323、X=(Y-0.0025)/0.0401，其判定係數(r²)均達到 0.999 以上，故顯 示在此濃度範內有良好的線性關係，如圖6～7 所示。

實驗中曾經使用二氯甲烷（dicholoromethane）作為血漿去蛋白劑，

實驗中曾經使用二氯甲烷（dicholoromethane）作為血漿去蛋白劑，