1. 研究動機
近年來，蘆薈的應用價值，已大幅提升至藥品、食品、保健食品、
化妝品等各大領域上；尤其是日本、美國、中國等，醫藥科學家皆投 入大量研究，以期開發出廣大的臨床療效及經濟效益。據文獻表示，
蘆薈的有效成分被確立後，新的藥理作用及臨床療效不斷地被發現，
具有致瀉(2,3,4,13)、抗菌(2,13,21)、抗炎(13,14)、保護肝臟(13,23)、抗腫瘤(2,5,6,7)、 抗組織損傷(2,12,15-18)、抗衰老(8)、抗輻射(22)、抗病毒(13,21)、調節免疫功
能(13,19,20)、降血糖血脂血壓(9,10,11)等功效，因而展開了蘆薈新的藥用價
值及市場前景。
本研究是以蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）
混合液在家兔體內進行藥物動力學及生體可用率的分析研究。以這兩 種指標成分為定量目標，測定其注射液及口服液在給藥後的血漿中指 標成分濃度，並進行藥物動力學的評估，希望對蘆薈萃取液中蘆薈大 黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）的臨床應用與品質評估 提供可參考的應用資訊。
關於蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）的定量 法雖有報告，但僅局限於定量分析(24-38)；而目前也尚未有蘆薈大黃苷
（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）相關藥物動力學的研究報告，
但其代謝物Aloe-emodin 已有一篇報告可做參考(26)。藉此研究過程，
建立定量指標成分之HPLC 分析方法，瞭解蘆薈大黃苷（Aloin）及異 蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在家兔體內的運行過程，並建構藥物動力 學的研究模式，為日後在人體進行生體可用率試驗建立研究方法的基 礎。
2. 研究目的
A. 建立蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在血漿 檢品中之高效液相層析定量方法
探討一種簡單、快速、靈敏度高且具專一性的高效液相層析法，
可同時測定蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）之含 量。並對於分析方法進行確效性（Validation）的評估，以開發適合進 行藥物動力學研究之定量方法。
B. 蘆薈大黃苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）之藥物動力學 研究
探討在家兔經由耳靜脈注射給藥後(65-67)，分析指標成分蘆薈大黃 苷（Aloin）及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在家兔體內之藥物動力學 特性，經定量後而得知血中濃度經時變化數據，進行藥物動力學之相 關模式評估，以求得有關藥物動力學參數，並探討蘆薈大黃苷（Aloin）
及異蘆薈大黃苷（Isobarbaloin）在家兔體內之運行過程。
第三章 實驗材料及方法
第一節 實驗材料
一、藥品及試劑：
蘆薈大黃苷(Aloin、Barbaloin) Sigma U.S.A.，純度 97 % 異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin) Sigma U.S.A.
蘆薈大黃素(Aloe-emodin) 吳金濱教授提供，純度 96.5 % 7-羥基香豆素(7-Hdroxy-coumarin) Sigma U.S.A.
甲醇( Methanol ) Merck Germany 乙腈( Acetonitrile ) Merck Germany 冰醋酸(Acetic acid) Merck Germany 二氯甲烷(Dicholormethane) Merck Germany
肝素鈉(Heparin Sodium) Novo Industrlal Co. 5000 IU/ml 藥用酒精(Ethanol) 台灣菸酒公賣局
生理食鹽水(0.9％ NaCl) 信東化學工業公司 氮氣 源吉氮氣
＊ 使用於高效液相層析儀之試劑均為HPLC 級
＊ 使用於高效液相層析儀之水均經Millipore 公司之 Milli-RO 60 製造 之純水，再經Millipore 0.45 μm 過濾膜過濾
二、儀器及材料：
1. 高效液相層析儀之裝備
幫浦(Pump): Jasco Model PU-980
偵測器(Detector): Jasco Model UV-970 Intelligent UV/VIS
積分儀(Integrator): Scientific InformLation Service CorporationIntegrator
自動取樣機(Auto Sampler): Jasco Model AS-851 印表機(Printer): Hewellt Packard LaserJet 1200 series
層析管(Column): Merck LiChrospher 100 RP-18 endcapped (250 mm ×4 mm , 5μm)
保護管柱(Pre-column): Merck LiChrospher 100 RP-18 endcapped, (5 μm)
2. 實驗室裝備
電子天平( Electronic Balance )：Sartorius Type 1801 Switzerland 減壓抽氣機( Aspirator )：Eyela, Aspirator A-2S, Tokyo, Rikakai . 微量移液管( Micropipette )：Socorex Transferpette：l - 10μl,
20 - 200 μl, 100 - 1000 μl
觸動式振盪器(vortex)： Maxi Mix II Thermolyene Type 37600 Mixer 高速離心機( centrifuge )：Hettich Zentrifugen D-7200
Tuttlingen,Germany (5000 rpm)
酸鹼測定儀( pH meter )：Suntex Microprocessor pH meter Model-2200 純水製造裝置( water purification )：Operting and Maintenance manual
For RiOsTM and ElixTM Water purification system, Millipore Co.
Operting and Maintenance manual Milli-Q®, Millipore Co.
超音波振盪器( Ultrasonic Cleaner )：BRANSON 5510, BRANSON ULTRASONIC Co. , USA 吹氣濃縮裝置: Organomation Associates INC. Model No. 112.
3. 電腦/軟體設備
藥物動力學計算軟體：Pharsight WinNolin 3.1® professional 統計軟體：WinNonlin 3.1® professional
圖形軟體：SigmaPlot 2000 for Window Version 9.0
4. 家兔抽血實驗所用器材
胃管(內徑 1.5 mm)：信德儀器公司 針筒過濾器0.22 μm： PRO-XTM(Lida)
注射針及針筒(Syring with needle)：Terumo Co. Japan 1 ml Syringe 25G × 5/8" (0.5 mm × l6 mm)
2.5 ml Syringe 24G × l" (0.55 mm × 25 mm) 5 ml Syringe 23G × l" ( 0.63mm × 25 mm) 10 ml Syringe 22G × l.5" (0.70 mm × 38mm)
血漿分離管（Brand PSTM Tubes for plasma separation 13×100mm 6ml）
靜脈置留針及針塞：IV Catheter 22G x l"，Terumo Co. Japan Injection Plug, 0.2 ml，Terumo Co. Japan 家兔固定器：STR-45 ( 45 × 17 ×18 cm)
張口器、棉花、3M 膠帶、計時器
5. 溶液製備
(1) 蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷的標準溶液 (Stock standard solution of Aloin and Isobarbaloin )
準確稱取Aloin 及 Isobarbaloin 標準品各 20 mg 分別置入一個 50 ml 的容量瓶中，添加甲醇至刻度，即得濃度為 400 μg/ml 的 Aloin 及 Isobarbaloin 的標準溶液。使用時再以甲醇稀釋至所需濃度。
(2) 內部標準溶液 (Internal standard solution)
準確稱取 7-羥基香豆素(7-Hydroxy-coumarin) 20 mg 置於 100 ml 的定量瓶中，加入甲醇至刻度，可得7-羥基香豆素(7-Hydroxy-coumarin) 濃度為200 μg/ml 的內部標準溶液。
(3) 肝素鈉溶液 (Heparin sodium solution)
準確量取肝素鈉注射液(5000 IU/ml) 2.5 ml 加至 500 ml 0.9％生理 食鹽水中，即得25 I.U./ml 的抗凝血肝素鈉溶液。
(4) 蘆 薈 大 黃 苷 及 異 蘆 薈 大 黃 苷 混 合 液 之 靜 脈 注 射 液 (Aloin and Isobarbaloin mixture solution for IV injection)
準確稱取蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷混合粉末後，再加入適量蒸 餾水混合溶解，再經0.22 μm 過濾薄膜過濾除菌即得。每 ml 含 5.25mg 的蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷混合液之注射液。
(5) 蘆 薈 大 黃 苷 及 異 蘆 薈 大 黃 苷 混 合 液 之 口 服 溶 液 (Aloin and Isobarbaloin mixture solution for Oral solution)
準確稱取蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷混合粉末後，再加入適量蒸餾 水混合溶解即得。每 ml 含 8.75mg 的蘆薈大黃苷及異蘆薈大黃苷混合 液之口服液。
第二節 實驗方法
1. 蘆薈大黃苷(Aloin)及異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin)在家兔血漿中之 HPLC 定量法:
A. HPLC 分析條件
層析管(Column)：Merck LiChrospher 100 RP-18 endcapped (250 mm ×4 mm , 5μm)
保護管柱(Pre-column)：Merck LiChrospher l00 RP-18 endcapped (5 μm) 檢測波長： UV 359 nm
流速： 1.0 ml/min
注入量： 50 μl
分析時間： 18 min
移動相：Methanol：Water ( 50：50 )
內部標準品：7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）200 μg/ml
B. 血漿檢品之前處理
用微量移液管精確量取血漿檢品200.0 μl 置於玻璃試管中，加入濃 度200 μg/ml 之 7-羥基香豆素（7-Hydroxy-coumarin）內標溶液 20 μl，
再加入乙腈溶液600 μl，並以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。
以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μl 置於另一試管 中，以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以甲醇200 μl 完全溶解之，接著 以微量吸管吸取置於小瓶(vial)中，注入 50 μl 於高效液相層析儀中分 析。
C. 檢量線 (Calibration curve)之製作
精確量取家兔空白血漿180 μl，各管分別加入濃度為 400.0 至 2.0 μg/ml 之 Aloin 及 Isobarbaloin 標準溶液 20 μl，再加入濃度為 200 μg/ml 的7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，配製成濃度為 40.0-0.2 μg/ml 之標準血漿檢品液(表 2)。再加入乙腈 600 μl，以振盪器振盪 30 秒，
使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清 液600 μl 置於另一試管中，以氮氣噴吹至乙腈完全逸離後，以甲醇 200 μl 完全溶解之，接著以微量吸管吸取至於小瓶(vial)中，注入 50 μl 進 行高效液相層析儀分析。將Aloin 和 Isobarbaloin 與 7-hydroxy-coumarin 的波峰面積比與對照標準血漿檢品濃度作線性回歸以製作標準曲線。
表2 Aloin、Isobarbaloin 標準濃度血漿檢品溶液之製備
標準溶液濃度(μg/ml)
各取20 μl 濃度 (μg/ml) Aloin Isobarbaloin
空白血漿 體積(μl)
內標溶液 體積 (μl)
Aloin Isobarbaloin 400 400 180 20 40 40
200 200 180 20 20 20
100 100 180 20 10 10
50 50 180 20 5 5
25 25 180 20 2.5 2.5
10 10 180 20 1 1
5 5 180 20 0.5 0.5
2 2 180 20 0.2 0.2
D. 相對回收率(Relative Recovery)試驗
目的在比較添加aloin 及 isobarbaloin 在空白血漿和空白溶液(甲醇) 中，經血漿檢品之前處理步驟處理後檢出量之差異比。實驗步驟如同 校正曲線製作中對檢品之處理過程。回收率可從下式求得:
Recovery(%) = × 100 %
E.精密度 (Precision) 與準確性 (Accuracy) 試驗
為了確認 aloin 及 isobarbaloin 定量分析方法之精確性，因此以同 日 內(Intraday) 及 間 日 內 (Interday) 的 精 密 度 (Precision) 與 準 確 性 (Accuracy)來比較。
(1) 同日內(Intraday)試驗:
以不同濃度含aloin 及 isobarbaloin 標準濃度血漿檢品，分別於同 一日的早上、中午、晚上分別各取濃度為200.0 、50.0、5.0 μg/ml 之 aloin 和 200.0、50.0、5.0 μg/ml 之 isobarbaloin 標準液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再加入濃度為 200 μg/ml 7-hydroxy-coumarin 內 標溶液20 μl。即得 aloin 濃度為 20、5.0、0.5 μg/ml，及 isobarbaloin 濃度為20.0、5.0、0.5 μg/ml 之血漿檢品(n=3)，計算各個校正濃度之 平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、變異係數(C.V.)及誤差(Error)。以確定 HPLC 定量法之精密度(Precision)及準確性(Accuracy)。
plasma standard peak area ratio
Mobile phase standard peak area ratio
(2) 間日內(Interday)試驗:
若 於 不 同 天 以 同 日 內 (Intraday) 試 驗 方 法 操 作 可 得 到 間 日 內 (Interday) 的精確性比較。
F. 靈敏度 (Sensitivity) 試驗
分析過程中，欲找出能被檢定出之最低濃度，但不需要能夠被定 量，故稱做最低偵測極限試驗(Limit of detection, LOD)，經使用指標成 分aloin、isobarbaloin 標準品溶液經逐步稀釋後，溶液以 HPLC 方法分 析，由Signal 對 Noise 比為 3:1。而偵測極量 (Limit of quantitation, LOQ），將依前述「檢量線之製作」，採標準濃度血漿檢品製備方法，
取六次檢品分析決定之。
LOD=S/N >3/1 LOQ=LOD × 3.3 S: Signal
N: Noise
G. 安定性 (Stability) 試驗
(1) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿中於-30 ℃下之安定性試驗：
取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、
50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，振 盪30 秒混合均勻，將之置於-30℃的冷凍櫃中，於第 0 , 1 , 3 , 6 , 10 , 15 ,
(2) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿去蛋白-30℃下之安定性試驗：
取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、
50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再 加入濃度為200 μg/ml 之 7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，再加入 乙腈600 μl，以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於 4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液。然後置於-30℃的冷凍櫃中，於 第0 , 1 , 3 , 6 , 10 , 15 , 21 天分別取出一組檢品(n=3)。解凍後，吹氮氣 處理，加入200 μl 甲醇，以 HPLC 分析，觀察 aloin 及 isobarbaloin 之 濃度變化情形。
(3) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿中於 25 ℃下之安定性試驗：
取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、
50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，振 盪30 秒混合均勻，置於室溫下，於第 0 , 1 , 3 , 6 , 12 , 24 , 48 小時，分 別取出一組檢品(n=3)，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分 析，觀察aloin 及 isobarbaloin 之濃度變化情形。
(4) Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔血漿去蛋白 25 ℃下之安定性試驗：
取aloin 濃度為 10.0、50.0、200.0 μg/ml 和 isobarbaloin 濃度為 10.0、
50.0、200.0 μg/ml 之標準溶液各 20 μl，加入 180 μl 之空白血漿中，再 加入濃度為200 μg/ml 之 7-hydroxy-coumarin 內標溶液 20 μl，再加入 乙腈600 μl，以振盪器振盪 30 秒，使血漿中蛋白質沉澱。以離心機於 4000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液。然後置於室溫下，於第 0 , 1 , 3 ,
6 , 12 , 24 , 48 小時分別取出一組檢品(n=3)。吹氮氣處理，加入 200 μl 甲醇，以HPLC 分析，觀察 aloin 及 isobarbaloin 之濃度變化情形。
2. Aloin 及 Isobarbaloin 在家兔體內之藥物動力學
A.實驗設計
取雄性家兔六隻，體重介於3.0 至 4.0 公斤之間，每隻家兔以蘆薈大黃 苷(aloin)及異蘆薈大黃苷(isobarbaloin)混合液，以靜脈(IV)注射與口服 (P.O)給藥。實驗家兔之重量、劑量及給藥順序標示於表 3，每次給藥 後至下次給藥，時間須相隔一週以上。
表 3 實驗家兔之體重
隻
兔重(kg) No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 Aloin 及 Isobarbaloin
IV (20 mg/kg) 3.1 3.3 3.9 3.53 3.2 3.42 Aloin 及 Isobarbaloin
IV (30 mg/kg) 3.36 3.3 3.06 3.53 3.64 3.5 Aloin 及 Isobarbaloin
IV (40 mg/kg) 3.9 3.65 3.54 - - - Aloin 及 Isobarbaloin
PO (100 mg/kg) 4.02 3.94 3.65 - - - Aloin 及 Isobarbaloin
3.54 3.68 3.58 - - -
B. 給藥法及檢品處理
(1) 蘆薈大黃苷(Aloin)及異蘆薈大黃苷(Isobarbaloin)混合液靜脈注射 給藥
實驗前家兔先秤重紀錄實際體重以便配置給藥劑量。實驗時將兩 耳之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其兔耳血管擴 張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈置留針，將針塞
實驗前家兔先秤重紀錄實際體重以便配置給藥劑量。實驗時將兩 耳之毛剔除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其兔耳血管擴 張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈置留針，將針塞