第四節 血液樣本的分析
(一) DNA 萃取：Hsieh 等 (2000) 以 phenol/chloroform /isoamylalcohol 萃取 。 (1) 以內含 EDTA 真空收集瓶抽取受試者全血 10 ml，上下均勻混合靜置於冰桶。
(2) 使用 3000 rpm 高速離心機 15 分鐘 分別收集上層血漿、中層的白血球至微量離心管 中，最後傾倒底層紅血球至廢液瓶時，必須特別注意底部可能有殘留的白血球。
(3) 將收集的白血球加入 RBC Lysis Buffer (含陰離子性清潔劑的細胞分解液、裂解緩衝 液) 上下混合，以 3000 rpm 高速離心 15 分鐘後倒除上清液，倘若白血球大約清潔完
成，即不用重複加入Lysis buffer 重複先前清洗的步驟。
(4) 清洗乾淨後加入 500 μl 的 PH9 TE Buffer，最後置於－80℃冰箱中隔夜。
(5) 隔天取出檢體置於 4℃冰上退冰，加入 20 μl 的 proteinase k，將白血球細胞膜打洞釋
放出細胞內的DNA，均勻混合後置於 37℃ 培養箱 16 小時，其後將檢體保存於 4℃
冰箱中。
(6) 加入與等比例的 Phenol (500 μl) ，以 10000 g 高速離心 15 分鐘後取上清液，上清液
中加入500 μl 的 chlorform，以 10000 g 高速離心 15 分鐘後取上清液，最後於上清 液中加入1000 μl 的 99%酒精沉澱所需之 DNA (白色棉絮) ，放置於－20℃冰箱沉澱 兩小時或隔夜。
(7) 將取出的檢體以 10000 g 高速離心 10 分鐘後去除上清液並到置於無塵紙上，加入 1000 μl 的 75%酒精震盪清洗檢體中的塩類，再以 10000 g 高速離心 10 分鐘後去除上
清液，置於鋪有無塵紙的自製烘乾板於37℃ 培養箱 7 ~ 8 分鐘，接著置於架上鋪上
無塵紙，等待30 分鐘以上的燥乾。
(8) 燥乾後，視檢體濃度加入不同量 PH8.3~8.5 的 TE Buffer 並以震盪來回溶 DNA。以 分光光度計 (spectrophotometer) 測 OD260/280，並定 DNA 濃度。
(二) 聚合酶連鎖反應 (PCR)
利用酵素對特定基因做體外或試管內 (In Vitro) 的大量合成。基本上是利用DNA
聚合酶進行專一性的連鎖複製。目前可以將一段基因複製為原來的一百億至一千億倍。
將合成PPARα 的引子，每一反應加入 DNA、引子、Taq polymerase、dNTP 等試 劑，並設定變性(denature)、黏合 (annealing)、展延 (extention)時間，約進行30~40 個循 環，以增幅DNA片段 (Flavell等, 2002) 。
變性是將 DNA 加熱變性，使雙股變為單股，做為複製的模板(Template)。很多 PCR 之所以會失敗很有可能是因為模版的不完全變性(Incomple tedenaturation)，典型的變性
條件是95℃ 30 秒或是 97℃15 秒，對於 G+C 較多的目標產物則須較高的變性溫度。
不完全變性會使二股DNA 突然黏合回雙股，而使 PCR 產量減少。但若是變性步驟的 時間太長或溫度太高則會造成不必要的酵素活性喪失。
而黏合則是令引子(Primers)於一定的溫度下附著於模板DNA 兩端，引子黏合所需
的時間和溫度決定於引子的組成、長度和濃度，較適合的黏合溫度為低於引子溫度值 5℃。黏合溫度提高可以減少不正確的引子黏合，並且可以減少引子3＇端的錯誤延長 (Misextension)。所以剛開始的幾個循環若是將黏合溫度提高將有助於反應的專一性。
最後步驟則是延長，在DNA 聚合酶(e.g. Taq polymerase)的作用下進行引子的延長 及另一股的合成(Extension of primers)。一般延長的反應溫度為72℃，在72℃ 下視其反 應中緩衝液、pH 值、鹽的濃度、DNA 模版的特性的不同，每秒DNA 合成酵素可延長 35-100 個核苷酸，一般在72℃ 下合成2 kb 需要1 分鐘。在經過一次的PCR 循環後可 以得到2 倍的產物，所以在經過N 次的循環就可得到2N 的目標產物。至於需經過幾次 的循環則視原始的目標DNA 的濃度而定。
本研究 PCR 方法引用自 Flavell 等 (2002)及 Ahmetov 等(2007)，如表 3-1、表 3-2、
表3-3，將調配完成之混合液 PCR 專用試管充分混合均勻後，置入聚合酶鏈反應儀 (Eppendorf Mastercycler Gradient, Hamburg , Germany)，進行聚合酶鏈鎖反應。所需進行
之DNA 片段增幅。
表3-1 PPARα Intron7 G/C PCR 反應條件表