目前廣為應用精子核染質結構分析 ( sperm chromatin structure assay, SCSA ) 檢測精子DNA結構之完整性，原理為酸處理後之精
子，結構不穩定之精子會因此變性，以AO ( acridine orange ) 染色，
雙股DNA為綠色，變性之單股DNA為紅色 ( Ambrogi et al., 2006 )。
另 外 應 用TUNEL ( terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling ) 檢測精子DNA之片段化，利用標記螢光之核 甘酸 ( nucleotide ) 與斷裂之DNA結合，藉此得知DNA片段化程度 ( Nakai et al., 2007 )。
雖然目前流式細胞儀之應用仍受限於儀器之高價位，且螢光染劑 通常所費不眥，尚未被廣泛應用於檢測精液品質，但其檢測精液樣品 具有快速且大量之優點，更可利用兩種以上螢光物質，同時檢測多項 參數，且只有顆粒物質可被偵測，不必沖洗游離染劑，將可成為檢測 精子品質之利器。
(2)、電腦輔助精子分析 ( Computer-assisted semen analysis, CASA ) 鑒於一般活力之顯微鏡檢查方式無法提供精子運動品質之資 訊，遂發展出電腦輔助精子分析系統，除了可以分析精子之一般活力 外，更可以評估多項活力指標，包括精子獲能作用後之過動現象 ( hyperactivity ) ( Schmidt and Kamp, 2004 )。
CASA 通常被用於分析下列數種精子活力指標，包括曲線速率 ( curvilinear velocity, VCL )、活動路徑平均速率 ( average path velocity, VAP )、直線速率 ( straight line velocity, VSL )、側頭位移之振幅
( qmplitude of lateral head displacement, ALH )、直線性 ( linearity, LIN )、搏動頻率 ( beat cross frequency, BCF )、平均角位移 ( mean angular displacement, MAD )、每隻精子頭部路徑面積。
比起不同CASA 系統，操作者之經驗與精液品質之差異為檢測變
異主要來源 ( Holt et al., 1994 )，雖然目前與體內生育力尚無顯著之 相關 ( Hirai et al., 2001; Quintero-Moreno et al., 2004 )，但 Holt et al.
( 1997 ) 與 Farrell et al. ( 1998 ) 均曾指出，VAP、VCL 或 ALH 與人 工授精後母猪之不重發情率具顯著相關性，尤有甚者，使用多項 CASA 參數之多重回歸 ( multiple regression ) 更能分析此相關性 ( Mortimer et al., 1995 )，惟 CASA 之參數與體外受精率並無顯著相關 ( Grunert et al., 1989 )。
除CASA之應用外，其他種類之儀器如自動精子形態分析儀
( Automated sperm morphology analysis, ASMA ) 與精子品質分析儀 ( Sperm Quality Analyzer, SQA-IIC )，已用於許多物種之精子品質分 析，除檢測精子活力外，更可檢測精子之形態與濃度，然此類儀器甚 少應用於養猪產業，但隨著人工授精普及率之上升，將可能普遍用於 養猪業 ( Hirai et al., 2001; Vyt et al., 2004 )。
雖CASA 參數與精液之體內生育力之相關尚有爭議，但 CASA 確 實可準確分析精子活動形態之微小差異，亦可檢測精子於儲存、冷凍
或其他處理後對精子活力造成之影響 ( Amann and Katz, 2004 )。如同 流式細胞儀，在快速且準確之原則下，若能調降儀器價格價格，與更 適合養猪產業之設計，也有可能成為例行性之精液檢測方法。
5、分子 ( molecule ) 與基因 ( gene ) 之檢測
為提早評估公猪之產精潛能，並用於改良公猪之精液品質，分子 與基因檢測之發展確實提供新方向，其進展概述如下。
(1)、分子
動物體內許多分子已被鑑定出可影響精液之品質，例如生理濃度 之類胰島素生長因子 ( insulin-like growth factor, IGF ) 可增加牛精子 洗滌後之活力 ( Henricks et al, 1998 )，在人類精液之研究更證實，精 漿中IGF 之濃度與精液品質呈正相關 ( Glander et al, 1996 )，然而在
猪之研究卻顯示，精漿中IGF 濃度與精液品質或配種後之體內生育力
無關 ( Hirai et al., 2001 )。
在人類之試驗顯示，生育力正常與不育者間之腫瘤壞死因子 ( tumor necrosis factor, TNF ) 含量並無差異 ( Papadimas et al, 2002 )，然而在猪之研究顯示，TNF 與精子活力及存活力間具有正相 關，與精子尾部形態異常呈負相關 ( Turba et al., 2006 )。
前已述及，精子膜富含不飽和脂肪酸，使其極易遭受氧化傷害，
尤其是儲存期間精子之氧化傷害更明顯 ( Cerolini et al., 2000 )。熱緊
迫蛋白 ( heat shock protein, HSP ) 為已知之保護因子，其中 70 kDa HSP ( HSP70 ) 與精液品質相關 ( Huang et al., 2000 )，且抗 HSP70 抗 体添加於精液中，顯著降低精子之體外受精率 ( Spinaci et al., 2005 )。
頭巾素活性 ( acrosin activity ) 之檢測也被建立做為頭巾完整性 之指標 ( Penn et al., 1972 )，具頭巾素活性之精子會於明膠 ( gelatin ) 周圍形成消化暈 ( digestion halo )，但此一檢測結果卻與體內生育力 不具相關性 ( Popwell and Flowers, 2004 )。
ATP 濃度為精子活力之重要參數 ( Brackett and Williams, 1967 )，
ATP 濃度較高之精子具較佳之體外穿透率 ( Gadea and Matás, 2000 )，但與窩仔數之相關卻不顯著 ( Gadea et al., 1998 )。
(2)、基因
影響母猪窩仔數與排卵率之基因 ( Linville et al., 2001 )，包括一 些內泌素與其受體，均與公猪生殖相關，被視為影響公猪精液性狀之 候選基因 ( candidate gene )。
前述熱緊迫蛋白 ( HSP70.2 ) 顯著影響熱季公猪之總精子數與精 子形態 ( Huang et al., 2002 )。輔肌動蛋白 ( actinins ) 基因 ( ACTN ) 於精子中表現，與精子頭巾反應相關 ( Casale et al., 1988 )。
泌乳素 ( prolactin ) 協同 LH 作用於來狄吉細胞，大鼠試驗證實 其受體與精子產生相關 ( Hondo et al., 1995 )，人類精漿中泌乳素濃度
亦與精子濃度及活力相關 ( Aiman et al., 1998 )，然而泌乳素受體基因 ( PRLR ) 卻不影響公猪精液性狀與體內生育力 ( Lin et al., 2006 )。
下視丘分泌之GnRH，可開啟 LH 與 FSH 之合成與釋放，影響精 子之發生，Lin et al. ( 2006 ) 研究證實 GnRH 受體基因 ( GNRHR ) 確 實影響精子之活力、成熟與形態異常。
FSH 除影響精子之發生外，更影響公猪睪丸形態與功能 ( Zanella et al., 1999 )。FSH 乃不同基因產生之α與β次單位所結合之異雙聚
體 ( heterodimer )。公猪中 FSHB 基因之表現與發軔素具正相關 ( Li et al., 1998 ) ， 基 因 剔 除 FSHB 之 小 鼠 睪 丸 較 小 且 精 子 稀 少
( oligospermia ) ( Layman, 2000 )，然而 FSHB 基因卻不影響公猪之精 液性狀與體內生育力 ( Lin et al., 2006 )。
與FSH 相似，LH 亦由兩次單位α與β所組成，LHB 基因之表現 與曼龍 ( blue gourami ) 之精子發生相關 ( Degani et al., 2003 )，人類 LHB 基因之突變，造成 LHβ次單位之不活化，而導致自發性發身缺
乏與不育 ( Huhtaniemi et al., 1999 )。然而 LHB 基因亦不影響公猪之 精液性狀與體內生育力 ( Lin et al., 2006 )。
抑制素及發軔素與精子之發生具有相關，在小鼠之研究指出，兩 者調控FSH之分泌與性腺功能 ( Cho et al., 2001 )。精漿中抑制素之濃 度可以反應精子發生與生精細管之狀態 ( Hu and Huang, 2002 )。抑制
素β之兩次單位基因INHBA與INHBB亦調控大鼠之精子發生 ( Kaipia et al., 1992 )，而猪之INHBA基因顯著影響精子之成熟與形態異常，
INHBB則影響精子濃度 ( Lin et al., 2006 )。
許多與精液品質相關之基因陸續被提及，例如類固醇 21-羥化酶
( steroid 21-hydroxylase ) 基因 ( CYP2 ) ( Kmiec et al., 2002 )、磷酸甘 油酸激酶2 ( phosphoglycerate kinase 2 ) 基因 ( PGK2 ) ( Chen et al., 2004 ) 與 ryanodine 受體基因 ( RYR1 ) ( Urban and Kuciel, 2001 ) 等，基因乃與生俱來，若於出生後即檢測，及早淘汰基因不良之公畜，
減少飼養將來可能生育力不佳之公猪，可以節省可觀之飼養經費。
四、公猪生育力之體外測定
上述精液品質之檢測方法，通常僅單方面檢測精液樣本，但受精 作用乃精子與卵母細胞之交互作用，因此若能準備卵母細胞，應可以 更準確評估精子之受精能力。
哺乳動物之體外受精 ( in vitro fertilization, IVF ) 源自於 Chang ( 1959 ) 所創，以兔子體外成熟 ( in vitro maturation, IVM ) 之卵母細 胞進行體外受精，成功產下子代。猪體外受精技術之開發，係Cheng ( 1985 ) 所建立，乃經由調整培養液之 pH 值、提高鈣離子濃度與受 精之培養溫度，順利完成猪卵之體外受精，並產下子代。體外受精不 僅有助受精機制之研究，也可被應用於檢測精子之受精能力。
(一)、影響體外受精之因素
雖然應用體外受精技術檢測精子受精能力，可以控制各項條件，
減少母猪體內之變異，然而一些因素也會影響體外受精之結果，分別 闡述於下。
1、卵母細胞
進行精子受精能力所使用之卵母細胞分為兩種，第一種為體外成 熟卵母細胞，經由屠宰場取回女猪之卵巢，在實驗室取得生發泡 ( germinal vesicle, GV ) 階段之卵母細胞，經由 44 至 48 小時體外成 熟培養，使其發育至第二次減數分裂中期 ( metaphase-II, MII )；第二 種為直接經由外科手術取得之體內成熟卵母細胞。體外成熟者須將卵 巢保持在 30 ℃以上，若低於 25 ℃將降低卵母細胞之成熟能力 ( Yuge et al., 2003 )；另外，體內成熟之卵母細胞因取得不易，故目前 研究多採用體外成熟之卵母細胞。
體內成熟之卵母細胞被排到輸卵管時，外圍包覆著卵丘細胞，雖 然GV階段之卵母細胞，其外圍卵丘細胞之多寡並不影響精子之穿透 ( Matás et al., 1996 )，而成熟卵母細胞外圍，卵丘細胞呈現粘稠且擴 散之現象，受精時卵丘細胞之存在，有助於精子之穿透作用與雄原核 之形成 ( Kikuchi et al., 1993 )，尤有甚者，卵丘細胞更被證實可以支 持早期胚之發育 ( Yamauchi and Nagai, 1999 )，職是之故，挑選體外
受精之卵母細胞時，應選擇有卵丘細胞之卵丘-卵母細胞複合體 ( cumulus-oocyte complex, COCs )。
2、精子
精子之品質對受精結果之影響已如前述，惟體外受精與體內受精 之主要差異，乃在自然配種時，精子之獲能作用是在雌性生殖道中完 成 ( Rodríguez-Martínez et al., 2005 )，而進行體外受精時，事先對精 子進行體外獲能處理。公猪精子於16 至 18 ℃靜置 16 小時以上，再 經洗滌之動作，可有助移除去獲能因子 ( decapacitation factors )，才 能順利完成體外受精 ( Cheng, 1985 )。
3、培養液組成
精子與卵母細胞被共培養於培養液中，因此培養液之組成亦影響 受精之結果。其中之鈣離子不僅是精子獲能所需，亦為卵母細胞發育 所需，職是之故，鈣離子之添加有利於體外受精 ( Cheng, 1985 )。重 碳酸鹽 ( bicarbonate ) ( Suzuki et al., 1994 )、三羥甲基氨基甲烷 ( tris ) 與胎牛血清有助於精子之獲能作用 ( Abeydeera and Day, 1997a )，咖 啡因 ( caffeine ) 可延長並增加精子活力 ( Garbers et al., 1973 )，提高 細胞內環磷酸腺苷 ( cyclic adenosine monophosphate, cAMP ) 之濃度 ( Casillas and Hoskins, 1970 )，容易使精子產生獲能作用與頭巾反應 ( Funahashi et al., 2000 )。每次使用之猪濾泡液 ( porcine follicular fluid,
PFF ) 或BSA，其成份具有變異性，恐影響體外受精之結果，因此研 究者積極發展不含血清之培養液 ( Abeydeera et al., 1998; Kishida et al., 2004; Katayama et al., 2007 )。
4、精子與卵母細胞比例
多 精 入 卵 一 直 是 體 外 產 製 猪 胚 之 主 要 障 礙 ( Niwa, 1993;
Funahashi and Day, 1997; Kikuchi et al., 2002 )，與體內受精不同者，
乃體外受精之精子數遠高於體內受精者，雖然進行體外受精時減少精 子數，可以增加單精入卵率 ( monospermy rate )，但也伴隨著穿透率 之降低 ( Abeydeera and Day, 1997b; Gil et al., 2004a )；反之，受精時 較多之精子數亦同時增高多精入卵率 ( Xu et al., 1996 )。而依照 Cheng ( 1985 ) 建議之體外受精之精子濃度，以 105至106 / ml 較適當。
5、共培養時間
精卵共培養時間也會影響精子對卵母細胞之穿透率，目前多使用 5 至 6 小時之共培養時間 ( Abeydeera and Day, 1997b; Gil et al., 2003 )，縮短共培養時間，的確可以提高單精入卵率 ( Coy et al., 1993 )，Gil et al. ( 2004b ) 證實共培養時間 1 小時與 6 小時之單精入 卵率顯著高於10 與 30 分鐘，卻不影響隨後胚之發育。
(二)、體外受精評估公猪生育力
精子於受精作用時，第一障礙為卵丘細胞 ( cumulus cell ) 與透明
帶，因此常用穿透率 ( penetration rate ) 評估精子之體外受精力。
Yanagimachi ( 1972 ) 證 實 公 猪 精 子 可 以 穿 透 無 透 明 帶 之 倉 鼠 ( hamster ) 卵母細胞，之後去除透明帶之倉鼠卵母細胞被用來檢測公 猪、牛與人等精子之受精能力 ( Imai et al., 1977; Bousquet and Brackeet, 1982; Shibahara et al., 1998 )，然而若能使用同種之卵母細胞
Yanagimachi ( 1972 ) 證 實 公 猪 精 子 可 以 穿 透 無 透 明 帶 之 倉 鼠 ( hamster ) 卵母細胞，之後去除透明帶之倉鼠卵母細胞被用來檢測公 猪、牛與人等精子之受精能力 ( Imai et al., 1977; Bousquet and Brackeet, 1982; Shibahara et al., 1998 )，然而若能使用同種之卵母細胞