3-3-1 分子生物技術之分析步驟
為提升現場分析之便利性，並減少儀器攜帶至現場之限制，本計畫利 用快速酵素冷凍破壁技術作為樣品之前處理，以增加萃取藻類DNA的效率 及彈性，該前處理流程如圖 3-20所示。其基本流程說明如下：樣品經過採 集後，取1 mL體積經高速離心機進行藻體濃縮，去除上清液後加入S1溶菌 酵素溶液與S2反應液於離心管中，利用震盪器與藻體均勻地混合。混和後 將離心管置於液態氮筒中進行快速冷凍，當管內液體結凍後立即取出且置 於濕式加熱槽內，37℃放置5分鐘直到管內液體解凍為止，並重覆結凍與解 凍步驟共3次，便完成藻體破壁處理。
DNA 的萃取部分，則選用 AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, USA)，
在樣品中加入 600 μL 的 Buffer RLT Plus，混和均勻後，利用 AllPrep DNA Mini Spin Column 將 DNA 截留至 Column 的膜上，RNA 則會貫穿至收集用 之離心管中，此步驟即可 DNA 與 RNA 分開(如圖 3-21 及圖 3-22 所示)，
後續則使用萃取之 DNA 搭配相關之引子及探針，進行目標物定量。
圖 3-20 現地藻體快速破壁技術(凍裂法)流程圖
取 1 mL 水樣
離心 13000rpm, 5 分鐘
去除上清液 加入 S1 和 S2
利用 Vortex 混合
利用液態氮冷凍後，
於 37℃水浴解凍，重 複步驟三次
37℃水浴培養 5 分鐘
圖 3-21 DNA/RNA 分離流程圖
圖 3-22 DNA 萃取流程圖
圖 3-23 RNA 萃取流程圖
樣品 加入600μL 的 Buffer RLT Plus
離心
加到 AllPrep DNA Mini
Spin Column
DNA 會被截留至 Column 的濾膜上
Buffer AW1 離心 13000 rpm, 15 秒
去除收集液
加入 500 μL 的 Buffer AW2
離心
70% ethanol
離心 13000 rpm, 15 秒
去除收集液
加入700 μL 的 Buffer RW1
離心
3-3-2 BMAA 於環境水樣的萃取與分析
針對BMAA 之分析，目前學界通常採用以下三種方法進行處理：(1)衍 生處理：利用衍生劑(如 6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl-carbamate (AQC))將極性的 BMAA 轉化為非極性物質，並具有紫外光吸收能力或螢光 特性的物質，再利用 HPLC 進行檢測(Kubo et al., 2008; Faassen et al., 2009)；
(2)更換層析柱：利用極性層析柱進行分離(如 HILIC 層析柱)，提高對各化 合物的留置效果。(3)更換檢測器：利用質譜直接對其定性、定量分析。由 於文獻指出藍綠菌具有產生多種 BMAA 異構物的能力(Jiang et al., 2012;
Banack et al., 2012; Metcalf et al., 2012)，因此無論採用衍生法還是直接檢測，
使用HPLC/MS/MS 鑑別 BMAA 等異構物是十分必要的。本團隊已成功建 立 BMAA 分析方法，可不經衍生、直接以 LC/MS/MS 分析，不僅檢量結 果良好，已於多個水體測得測得BMAA。
3-3-2-1 樣品前處理
以超音波破碎機(Digital Sonifier，BRANSON 公司)破碎水體中藻顆粒 15 分鐘(Amplitude= 61%, Pulse on= 5.0 sec, Pulse off= 3.0 sec)，接著離心並 以0.45 μm 濾膜過濾藻液，並調整至 pH 為 3，即可進行固相萃取。
3-3-2-2 固相萃取步驟 (如圖 3-24 所示)
1. 取 10 mL 的甲醇、10 mL 的 2%甲酸活化 MCX 管柱；另取 10 mL 的甲
醇、10 mL 的 LC water 活化 HLB 管柱。活化後，將 HLB 及 MCX 管柱 串聯以通過樣品。
2. 待樣品全數通過串聯管柱後，取 10 mL 的 2%甲酸以及 10 mL 的甲醇清 洗 MCX 管柱。並以 7.5 mL 溶在甲醇的 5%氨水溶液進行脫附。
3. 將脫附液以氮氣吹乾，再以 0.5 mL 的 0.1%甲酸回溶。
4. 最後，離心過濾後即可上機分析。
3-3-2-3 以 LC/MS/MS 分析 BMAA
本 研 究 使 用 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀(Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)分析，高壓液相層析儀為 Agilent 公司所生 產之1260 Infinity Quaternary LC System，搭配串聯式質譜儀為 Thermo 公司 生產之TSQ Quantum Ultra，選用之層析管柱為 HILIC 管柱(Shiseido 公司，
Capcell Core PC , S 2.7um, 4.6mm X 150 mm I.D.)。本研究所採用的高壓液 相層析質譜儀，配合著兩個高壓微量移動相幫浦，而後接著串聯式質譜儀；
分析所用的溶劑移動相為 0.1%的甲酸水溶液與添加 0.1% 甲酸的乙晴 (Acetonitrile)，分析管柱選用內徑 2.7 μm (Capcell Core PC, Shiseido, Japan)，
選擇使用的偵檢器為ESI (Electrospray)，監測模式為正電荷(Positive)模式，
分析模式為SRM，流速為 0.25 mL/min，注入樣本體積為 20 μL，分析時間 為20 分鐘。
研究中以標準品配製100 μg/L 的 BMAA 進行定性分析，以得知 BMAA 在分析管柱中的停留時間，結果顯示 BMAA 的出峰時間為 10.53 分鐘，
precursor ion m/z 為 119，product ions m/z 為 44.0 及 88.0。另配製 BMAA 於 一系列之稀釋濃度進行分析，配製濃度分別為 2、5、10、100、250、500 μg/L，
體積為 0.5 mL，而後以 LC/MS/MS 以上述所設定之 SRM 模式進行定量分 析，並利用統計軟體進行迴歸分析，所獲得之檢量線顯示分析結果良好。
圖 3-24 樣品 BMAA 之固相萃取步驟
3-3-3 酵素連結免疫吸附分析方法(ELISA)
本分析方法係參照環境保護署環境檢驗所公告之標準分析方法(NIEA E510.50B)，以分析水體中藻類毒素的濃度，本計畫採用商品化的盤式酵素 連結免疫吸附套組(ELISA kit，Abraxis，USA)，包括：微囊藻毒素Microcystins Kit (PN 520012)、柱孢藻毒素Cylindrospermopsin Kit (PN 522011)、蛤蚌毒 素毒素Saxitoxin Kit (PN 52255B)，配合酵素連結免疫吸附分析儀進行分析，
該分析方法已應用於移動式監測系統中。整體分析時間(包含樣品的前處理) 約1至3小時內，最多可同時檢測完成最大96個樣品。
圖 3-25 為微囊藻毒素之檢量線，依據標準操作步驟施作，檢量線上每 一濃度點為重複施作 3 次所得之平均值，並繪製標準差於各濃度點。該圖 顯示，各濃度點量測再現性佳，檢量線之 R2值為 0.98，最低偵測極限為 0.15 µg/L(廠商提供之資料)。圖 3-26 為柱孢藻毒素之檢量線，該圖顯示，各濃 度點量測再現性皆在可接受的誤差範圍內，且檢量線之 R2值為 1，最低偵 測極限為 0.05 µg/L(廠商提供之資料)。圖 3-27 為蛤蚌毒素(Saxitoxin)之檢 量線，各濃度點皆在可接受的誤差範圍內，檢量線之 R2值為 0.99，最低偵 測極限為 0.02 µg/L(廠商提供之資料)。整體而言，三種台灣最常見或最可 能出現之藻類毒素，均可以使用 ELISA 分析。
3-3-3-1 實驗設備、試藥與試劑 (1) 過濾設備：飛碟式濾膜。
(2) 震盪器。
(3) 酵素連結免疫分析儀：Multiskan FC，Thermo Scientific 公司，芬蘭。
3-3-3-2 分析步驟
3-3-4 藻類臭味物質分析
臭味物質的分析為依照環境保護署環境檢驗所公告之標準分析方法 (NIEA W537.51B)，以固相微萃取法(Solid Phase Micro-Extraction，SPME)將 水 樣 中 臭 味 物 質 吸 附 於 吸 附 纖 維 上 ， 再 搭 配 氣 相 層 析 質 譜 儀 (gas chromatograph/mass spectrometry detector ， GC/MSD) (6890/5973, Agilent, USA)，將吸附完畢之吸附針注入 GC/MSD 進行定性及定量分析，主要分析 之臭味物質包含 Geosmin、2-MIB 及 β-Cyclcitral。詳細方法參考 Lin et al., (2003)。
3-3-5 藻類鏡檢技術
為與分子生物技術互相印證，本計畫水庫樣品的藻類鏡檢分析部分，
將以傳統分析技術的顯微鏡鏡檢法進行藻類的鑑種與計數的工作。目前台 灣水體中主要之產毒藻種多屬於藍綠細菌門，較常見為微囊藻(Microcystis spp.)、柱孢藻(Cylindrospermopsis spp.)及魚腥藻(Anabaena spp.)等，藻類鑑
種需由資深或透過長期訓練之人員進行目視判定，而藻體計數定量方式則 参考自 Standard Method 10200F 標準方法，該方法係用以檢驗湖河池泊水 庫等水域浮游植物之種類及數量。實驗設備及相關試藥、試劑說明如下。
3-3-5-1 實驗設備、試藥與試劑
(1) 細胞計數盤 (S52 Sedgwick-Rafter cell)。
(2) 蓋玻片 (cover glass, 24 mm × 60mm)。
(3) 顯微鏡：型號BX51，OLYMPUS公司。
(4) 冰醋酸(Acetic acid)：GR級，MERCK公司。
(5) 碘(Iodine)：GR級，MERCK公司。
3-3-5-2 計數步驟
(2) 將樣品注滿計數盤，避免氣泡於chamber的角落形成。
(3) 靜置30分鐘使樣品沉澱。
3-3-5-3 計數方法
將細胞計數盤置於顯微鏡下，放大倍數調轉至400倍，並隨機選取N行，
計數視野下出現之藻類總數。藻類之鑑定則對照圖鑑而加以判定。
3-3-5-4 結果分析
根據計數所得之數目，以下列公式求得樣品中藻類的濃度：
其中，C = 計數之藻類總數，cells L = 細胞計數盤中每一行之格數 N = 計數的行數
3-3-6 現地螢光水質分析儀
本計畫使用現地多參數水質監測系統(Model 6600V2，YSI，USA)，進 行水庫水質之監測。該水質分析儀主要利用多重電極與光學原理，針對多 項水質物理參數進行同時量測，並可即時回傳與收集相關數據資料，除傳 統水質項目外，並可以分析葉綠素a及藻藍素，可與本計畫藍綠細菌濃度互 相印證。由於該設備對於葉綠素a及藻藍素之監測，係使用光學方法，因此 受到水體中葉綠素、濁度、藻種類、藻團粒大小、藻生長期均會影響其測試 準確度。Chang et al., (2012)研究證明，該技術經過適度現場參數校正後，
可以克服葉綠素、濁度、藻團粒等之影響，在水庫現場快速提供準確之藍 綠菌濃度。
除藻類相關參數外，本計畫量測的項目尚包括：溶氧百分比(DO%)、溶 氧值(DO mg/L)、電導度(Conductivity)、比電導度(Specific Conductance)、溫 度(Temperature)、鹽度(Salinity)、總溶解固體(Total Dissolved Solids)、電阻 值(Resistivity)、酸鹼值(pH)、水中深度(Depth)、水位(Vented Level)、流量 (Flow)、濁度(Turbidity)、葉綠素 a(Chlorophyll-a)等 14 種參數，部份樣品亦 將於現地利用快速分析套件分析總磷(TP)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)，此類 參數之收集後續可以用於修正監測結果(如藍綠菌數)、以及作為環境參數與 藍綠菌生成之關聯性分析。
3-3-7 分子生物方法與其他方法間之相關性
本研究團隊歷年以分子生物 qPCR 方法為基礎所得知分析結果，與化 學分析(如 GCMS)、ELISA 方法、及顯微鏡計數相比較，具有良好之關聯 性，可以做為推估藻數、及相關代謝物之參考。圖 3-28 為 qPCR 法與顯微 鏡計數之比較(Chiu et al., 2017)、圖 3-29 為 qPCR 法與 GC/MS 法比較(Chiu et al., 2016)、圖 3-30 為 qPCR 法與 ELISA 法之比較(Chiu et al., 2017)，均 顯示具有良好之關聯性。顯示 qPCR 定量系統可作為傳統分析法的替代技 術，藉由 qPCR 定量系統的快速監測，搭配基因與有害藻類數目及其代謝 物濃度的相關性以及 95%的預測區間，並可即時地判斷水體中有害藻類數 目及其代謝物濃度的範圍，提供水庫管理單位作為水源管理的重要依據。
舉例來說，當進行環境檢測時，樣品以分子生物技術於 3 小時內檢測到 104 cell/mL 的總微囊藻細胞數時，可在樣品送回實驗室做進一步分析之前，將 此數據代回圖 3-28(a)中，便可立即了解水體中微囊藻細胞數約落在 534
cells/mL 至 95,374 cells/mL 之間。同樣的概念亦適用於臭味物質(圖 3-29) 及藻類毒素(圖 3-30)的推估。
由於圖 3-28、圖 3-29 以及圖 3-30 為綜合 2013 年至 2016 年來台灣 29 座主要水庫的數據，然而 29 座水庫的特性不同，因此其 95%預測區間範圍 較大，若未來能針對單一水庫進行長期數據的收集，便能縮小 95%預測區 間的範圍。
圖 3-28 qPCR 法與顯微鏡計數結果之相關性
95% Predition interval y = 1.002 + 0.713 x R2= 0.740
Pearson Correlation = 0.860 (p < 0.01, 2-tailed).
Cell abundance of Microcystis, cells mL-1 , log (y+1)
Cell equivalents of 16S rRNA gene, cell equivalents mL-1, log (x+1)
(a)
95% Predition interval y = 1.169 + 0.753 x R2= 0.659
Pearson Correlation = 0.812 (p < 0.01, 2-tailed).
(b)
Cell equivalents of rpoC1 gene, cell equivalents mL-1, log (x+1) Cell abundance of Cylindro., cells mL-1 , log (y+1)
0
95% Prediction interval y = 0.053 + 0.481 x R2= 0.473
Total 2-MIB concentration, ng L-1 , log (y+1)
Copy number, copies mL-1, log (x+1)
(a)
Pearson Correlation = 0.688 (p < 0.01, 2-tailed).
-0.5
95% Prediction interval y = -0.436 + 0.535 x R2= 0.479
Cell-bound 2-MIB concentration, ng L-1 , log (y+1)
Copy number, copies mL-1, log (x+1)
(b)
Pearson Correlation = 0.692 (p < 0.01, 2-tailed).
-1
95% Predition interval y = -0.671 + 0.374 x R2= 0.683
Total MCs concentration, μg L-1 , log (y+1)
Pearson Correlation = 0.827 (p < 0.01, 2-tailed).
(a)
Cell equivalents of mcyB gene, cell equivalents mL-1, log (x+1) -0.2
95% Predition interval y = -0.157 + 0.142 x R2= 0.392
Total CYN concentration, μg L-1 , log (y+1)
Pearson Correlation = 0.626 (p < 0.01, 2-tailed).
(b)
Copy number of pks gene, copies mL-1, log (x+1)