本實驗分別取出蛋白質質量為 150μg 的實驗組第六週水溶性水 晶體蛋白與尿素可溶性水晶體蛋白溶液，作 LC/MS/MS 全蛋白質譜 分析。實驗組第六週之水溶性水晶體蛋白溶液的主成份為：αA、αB、
βB3、βB1、和 βA4，次之為 γ 水晶體如 γD、γF。而實驗組第六週尿 素可溶性水晶體蛋白溶液之主成份為：βB3、βB1、βA4、βA3、和 γD，
次之為 γF、γB、γC。由質譜分析結果可得到蛋白質溶液當中多胜肽 片段受到修飾的情形(如表 15 到表 25 所示)，可看到無論是水溶性或 是尿素可溶性的水晶體蛋白溶液中α-、β-、和 γ-水晶體蛋白的多胜 肽片段都受到不同程度的改變。
在水溶性水晶體蛋白組成成份 αA、αB、βB3、βB1、和 βA4，及
尿素可溶性水晶體蛋白組成成份βA3、βB1、βA4、γF、和 γD 的多胜 肽片段上都有出現甲硫胺酸(Methionine)被氧化(Oxidation)的情形，經 由氧化過程會形成Methionine Sulfoxide(Garnet and Spector, 1980)、或 更進一步氧化成Methionine Sulfone，另外色胺酸(Tryptophan)和組胺 酸(Histidine)也有被氧化的現象。而天門冬醯胺(Asparagine)和榖胺酸 (Glutamine)上發生去胺基化(Deamidation) ，胺端(N-terminal)以及 賴 胺酸(Lysine)發生乙醯化(Acetylation)和 Carboxyethyl 的修飾。其中 Carboxyethyl 的修飾為草酸單烷基醯胺 (Oxalate monoalkylamide)，文
獻上指出這種化合物的生成由抗壞血酸(Ascorbate, ASC)進行氧化降 解(Oxidative Degradation)的產物 2,3-diketogulonate 和 L-threose 與蛋白 質快速結合並進行梅拉德氧化反應所得到，並且此化合物被認為是一 種糖化最終產物AGEs，在糖尿病患者的水晶體中發現含有高濃度的 草酸單烷基醯胺，隨著老化及白內障越嚴重堆積在水晶體內的糖化最 終產物的含量也越多(Ramanakoppa et al., 1999)。
從實驗組第六週的水溶性水晶體蛋白及尿素可溶性水晶體蛋白 兩者的共同蛋白質成份：βA3、βB1、βB3 的多胜肽片段的修飾情形 作比較，可以得到結論：(1) βA3 水晶體蛋白無論是屬於水溶性或是 尿素可溶性蛋白，都有胺端上乙醯化、以及組胺酸、天門冬醯胺、榖 胺酸上發生氧化的多胜肽片段，但是尿素可溶性的 βA3 水晶體蛋白 多了草酸單烷基醯胺的修飾，(2)水溶性及尿素可溶性水晶體蛋白中 的 βB1 成份，在相同的多胜肽片段上有相同的甲硫胺酸被氧化的修 飾，但是尿素可溶性的 βB1 水晶體蛋白多了在賴胺酸上的草酸單烷 基醯胺的修飾，(3) 水溶性及尿素可溶性水晶體蛋白中的 βB3 蛋白質 在相同的多胜肽片段上發生相同的修飾；胺端乙醯化、天門冬醯胺上 發生去胺基化以及甲硫胺酸、組胺酸、色胺酸和天門冬醯胺被氧化的 修飾，仍然是屬於尿素可溶性水晶體蛋白的 βB3 水晶體蛋白上多了 草酸單烷基醯胺的修飾。由這個結果對照文獻的內容，可以解釋成出
現了草酸單烷基醯胺的修飾可能是使原本水溶性的水晶體蛋白轉變 為非水溶性水晶體蛋白的原因之一。
由於水晶體內的水晶體蛋白很少有反轉代謝的情況，因此無論是 細胞代謝所產生的活性氧物質，或是因為半乳糖所導致的細胞生理失 調，使包含蛋白分解酵素的被活化與細胞還原能力的下降，都可能直 接影響水晶體內的水晶體蛋白；當氨基酸被改變時，區段間的作用力 也很容易隨之改變，很可能造成原來的集結形式產生變化，並且使得 聚集起來的水晶體蛋白無法維持其原本水溶性的本性而產生沉澱造 成水晶體混濁。
第四章 結論
本實驗以餵食含有 50％半乳糖的飼料的大白鼠作為實驗組，並 且與餵食正常飼料的大白鼠作為控制組作為對照，從實驗組第三週開 始大白鼠眼球出現混濁有白內障的現象產生。萃取眼球中的水溶性水 晶體蛋白作快速蛋白質液相層析後發現 β、γ 水晶體蛋白的波峰強度 隨著實驗週數變長而明顯下降，而 α 水晶體蛋白之高分子集結體的波 峰強度隨著實驗週數增長而明顯增加，在實驗組第五週時達到最大但 在第六週反而減弱，應是高分子量集結體聚集太大最後轉變為非水溶 性的蛋白質。曾有實驗分析高分子量集結體是α、β、γ 水晶體蛋白的 混合物，其主成份為αA、αB 水晶體蛋白(Zhucheng et al., 1994)，高 分子量集結體對大部份的物種來說都產生於水晶體核心的部位。有文 獻指出人類水晶體當中的水溶性水晶體蛋白之高分子集結體會隨年 齡增長和白內障的嚴重程度而增多，由實驗室以前的學長實驗螢光光 譜與圓二色光譜的結果顯示高分子集結體中的 α 水晶體蛋白有不同 的結構並且不具有分子伴護活性(Carver et al., 1996)。α 水晶體蛋白形 成高分子集結體之後會再逐漸變成非水溶性的蛋白質，因此高分子集 結體被認為可能是形成非水溶性蛋白質的前驅物，並且與白內障的生 成有關(Roy & Spector, 1978)。取出控制組及實驗組共六週的水溶性水 晶體蛋白作一維電泳分析，發現隨著實驗週數增長在分子量約為
15kDa 處有蛋白質條帶從第三週開始變得越來越明顯，同時從第三週 開始在較高分子量處約 25kDa 附近有蛋白質條帶變得越來越不明 顯，到了第五、六週此條帶變得很淡。取第三週及第六週分子量約為 15kDa 處的條帶作質譜分析，實驗組第三週的條帶成份為 γD、γF、γE、
γA、γB 水晶體蛋白，第六週的成份依序為 αA、αB、γD、γA、βS、βA3，
結果可與水溶性水晶體蛋白作二維電泳的結果符合；在 α 水晶體蛋白 的區塊中出現了許多零星的蛋白質點，可能是由 α 水晶體蛋白被截斷 後產生的小分子量碎片產生，且這些較低分子量的蛋白質點也隨著實 驗組時間增長而強度變得更強。
另外，取出定量的水溶性水晶體蛋白作二維電泳分析，可發現在 β、γ 水晶體蛋白的區域中蛋白質點的強度對照控制組之 β、γ 水晶體 蛋白質點有逐漸減弱的現象，與水溶性水晶體蛋白的液相層析結果符 合且文獻上記載 γ 水晶體蛋白上有多量含硫殘基:半胱胺酸、甲硫胺 酸、酪胺酸和色胺酸，容易被氧化，蛋白質的性質改變造成水晶體蛋 白集結，而其氧化物也有被鑑定出來(Dillon, Spector & Nakanishi, 1976)。取出定量的尿素可溶性水晶體蛋白作二維電泳分析，但結果 在β 水晶體蛋白區域的蛋白質點強度並沒有增加反而是變弱，因此推 測受到修飾後的 β 水晶體蛋白不是由水溶性水晶體蛋白轉變為尿素 可溶性水晶體蛋白，可能大部份會轉化成非尿素可溶性的水晶體蛋
白，而 γ 水晶體蛋白的蛋白質點到實驗組第四週為止皆為強度增加的 情況，但到了實驗組第六週γ 水晶體蛋白質點的強度反而減弱，推測 是 γ 水晶體蛋白在白內障初期受到修飾轉為尿素可溶性水晶體蛋 白，到了白內障較嚴重時又可能轉化成非尿素可溶性的蛋白質。
使用定量的實驗組第六週之水溶性水晶體蛋白以及尿素可溶性水晶 體蛋白作全蛋白質譜分析來觀察水晶體蛋白受到修飾的位置及修飾 的種類，由兩者共同都有的成份 βA3、βB1、βB3 可看出多胜肽的相 同片段上具有相同的修飾，而差別在於尿素可溶性水晶體的多胜肽片 段上多了草酸單烷基醯胺的修飾，一種由抗壞血酸進行氧化降解後的 產物與蛋白質縮合並氧化所得到的產物，形成了互相交連的蛋白質並 具有褐化(Browning)和螢光性質(Fluorescence)，抗壞血酸也能進行多
種梅拉德反應生成pentosidine，carboxymethyllysine(CML)，LM-1 等 產物累積在人類水晶體內(Ramanakoppa et al, 1992)。草酸單烷基醯胺 堆基在水晶體內與水晶體產生老化及白內障的形成有關(Lyson et al., 1991；Mruthinti, Green & Abraham, 1996)。至於水溶性水晶體蛋白中 的主成分αA、αB 水晶體蛋白上也有許多的修飾，但卻沒有出現在實 驗組第六週尿素可溶性水晶體的質譜分析結果中，這顯示了 α 水晶體 具有維持水晶體透明度的重要功能；具有多種的修飾但還能維持水溶 性的特性，如果能把實驗組的週數增長，繼續觀察也許會有變化出現。
圖
7 實驗組第一週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
圖
8 實驗組第二週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
圖
9 實驗組第三週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
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10 實驗組第四週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
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11 實驗組第五週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
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12 實驗組第六週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相層析圖
圖
13 實驗組第一至第六週之大白鼠水溶性水晶體蛋白的快速蛋白質液相
層析圖的綜合比較(a) M N 1 2 3 4 5 6
六週。膠片使用濃度為12.5％ Acrylamide，以 Coomassie Blue 染色。
圖14(a)為 Loading 10μg 水溶性水晶體蛋白；圖 14(b)為 Loading 15μg 的水溶性水晶體蛋白。
(a)
圖
16 大白鼠控制組水溶性水晶體蛋白的二維電泳圖與實驗組第一週 之二維電泳結果互相比對。紅圈部份代表實驗組第一週的蛋白
質點強度對比控制組強度變強兩倍以上，綠圈部份代表實驗組 第一週的蛋白質點強度變弱兩倍以上。70
40 35 25
10 130 170
55
10015
pH 3 pH 10
圖
17 大白鼠實驗組第一週水溶性水晶體蛋白的二維電泳圖與控制組 之二維電泳結果互相比對。紅圈部份代表實驗組第一週的蛋白
質點強度對比控制組強度變強兩倍以上，綠圈部份代表實驗組 第一週的蛋白質點強度變弱兩倍以上。70
40 35 25 170
55
10015
130
10
pH 3 pH 10
表