ADMA 和 SDMA 的分析方法

大自然界存在著許多的同分異構物，而同分異構物雖具有相同的 分子量，但卻常常在生物體中有極大不同的功能，如身體中所需的蛋 白質其胺基酸組成都屬 L 型。因此如何分辨同分異構物一直是分析化 學領域中一個重要的課題，目前常用的分析方法可分為兩大類，一種 為間接方式，乃藉由層析等技術將不同的同分異構物先行分離，再進 行偵測，另外一種則以質譜技術為主，直接對樣品進行分析，不需要 以層析方法先行分離。因此長久以來如何分辨同分異構物是分析化學 的一項重要課題。目前相較於以質譜儀分析同分異構物，層析方法雖 然較為耗時，卻可對同分異構物進行較準確的定量分析；反之，質譜 儀雖然較少應用於同分異構物的定量分析，卻可以快速分辨混合液中 的同分異構物。以下將簡單介紹以層析法與質譜法聯用(間接方式)以 及單獨應用質譜法(直接方式)分析混合物中同分異構物的方法。同分 異構物極多，以下介紹主要以本研究所用的分析物 ADMA 和 SDMA 探討為主。

間接方式

以高效能液相層析儀和氣相層析儀分析生化樣品中的 ADMA 和 SDMA 時，為了達到較佳的偵測極限，常需要進行樣品前處理或是衍 生化等步驟的改良。例如 SPE 萃取⁸、蛋白質沉澱法^{6, 9}、離心萃取^10,

11等樣品前處理方式和 monolithic column⁸、RP C18 ⁶等層析管柱的改 良 ， 或 是 o-phthal aldehyde (OPA)6, 8, 12, 13、 pentafluorobenzoyl

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chloride¹¹、methyl ester tri(N-pentafluoropropionyl)¹⁴ 等衍生化詴劑和

13C6-ARG⁹、d₃Me-ADMA¹⁴、L-homoarginine^{10, 15}、(CD₃)2NH¹¹等內標 Martens-Lobenhoffer 等人 ⁶則將血漿與尿液中的蛋白質進行簡單的沉 澱後，以 OPA 和 2-mercaptoethanol 進行衍生化後以 LC-MS 分析，測 得健康人體血漿中 ADMA 和 SDMA 的含量分別為 0.128 μM 和 0.612 μM，尿液中則為 16.6 μM 和 50.4 μM。

不同於沉澱法，Huang 等人¹⁵以 5-sulfosalicylic acid (5-SSA)去除 血漿中的蛋白質干擾物，於 2004 年分析血漿中 ADMA 與 SDMA 含 量。以 LC-MS 方式測得血漿中 ADMA 和 SDMA 的含量分別為

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0.48±0.07 μmol/L 和 0.41±0.05 μmol/L，偵測極限則為 0.01 μmol/L。

為了避免使用衍生化時缺乏選擇性，以及伴隨著分析時間的增長，

Liang 等人不使用複雜的前處理步驟，改以 L-homoarginine 為內標 物，利用 LC-MS 方式分析尿液中 ADMA 與 SDMA 含量，¹⁰此分析 上分離和衍生法的偵測極限可達到 5 pmol。除了 LC/MS 以外，Tsikas 等人¹⁴於 2003 年以 methyl ester tri(n-pentafluoropropionyl)為衍生劑，

【²H3】-methyl ester ADMA (d₃Me-ADMA)為內標物，以氣相層析串 聯質譜儀(GC/MS/MS) 測得血漿中 ADMA 含量為 0.39±0.06μM，偵 測極限可達 10 amol。2007 年 Tsikas 與其他人以 GC-MS 測得人體尿 液中平均含 27.3±15.3 μM 的 ADMA，¹¹所採用的前處理方式則為以 甲苯對尿液萃取後，再以 pentafluorobenzoyl chloride 進行衍生化，定 量時則以 (CD₃)2NH 為內標物。

除了樣品前處理以及內標物的研究外，分析管柱的改良也是高通 量分析 ADMA 與 SDMA 研究上的另一項領域。Teerlink 等人 ⁸以高 分離效率且背壓較小的 monolithic 管柱取代常用的 C18 管柱進行 ADMA 與 SDMA 的分析。Monolithic 管柱是以矽棒(silica rod)所填 充，所形成的雙模態孔洞(bimodal pore)較傳統的矽顆粒(silica particle) 填充物有較高的滲透性，可乘載較高的流速而增加分離的效率和減少

11 (tandem mass spectrometry，MS/MS)進行快速分析。¹⁶ Bishop 等人於 2007 年以 mixed-mode ion-exchange LC/MS/MS 方式進行 ADMA 的分 析，¹⁶樣品在經過兩分鐘的離心微萃取後，不需要分離 ADMA 與

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SDMA，直接以串聯式質譜儀分別偵測 ADMA 和 SDMA 特殊的離子 斷片(m/z 46 和 m/z 172)進行定量分析。此方法偵測極限為 0.06 μM，

測得血漿中 ADMA 含量為 0.66±0.12 μM，所得結果與前述其他方法 一致(表 2-1)。