第二章、 材料與方法
第二節、 菌株、活化、培養與保存
2.2.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 種菌製備
本實驗所使用的菌株為 Alterococcus agarolyticus S3PY，這是本 實驗室於 1995 年從綠島溫泉篩選得到的。
從-80℃取 Alterococcus agarolyticus S3PY 種菌接入 50ml PYA
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broth，以 45℃震盪培養(140rpm)48 小時，取菌液接種(使 OD660=0.022) 至新的 PYA broth 培養 24 小時，當作種菌。
菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 液態培養基(PYA)：
Bacto Peptone (Difco) 4g/L Bacto yeast extract (Difco) 2g/L MgCl．6H2O 0.5g/L NaCl 20g/L K2HPO4 2g/L Agar 0.25g/L (pH7) 一個錐形瓶裝 50ml
2.2.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 螺旋蓋錐形瓶培養 2.2.2.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 錐形瓶培養
用 250ml 螺旋錐形瓶裝入 50ml PYMA broth，接菌液至培養液中，
使起始 OD660=0.01，放入 45℃震盪培養(140rpm)48 小時。
菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 基礎液態培養基(PYMA)：
Bacto Peptone (Difco) 4g/L Bacto yeast extract (Difco) 1g/L MgCl．6H2O 0.5g/L NaCl 10g/L
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CaCl2 0.1g/L Ferric ammonium citrate 0.03g/L MOPSO 4.5g/L Agar 0.25g/L (pH7) 一個錐形瓶裝 50ml
2.2.2.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 培養時間測試
將菌液接種至 PYMA broth 後，分別培養 36 與 48 小時，硫酸銨 沉澱後進行冷凍乾燥。將兩個時段的冷凍乾燥產物以 ddH2O 溶解配 置成 1、2、3、4、5mg/ml 測定酵素活性與比活性；另配置 12.5mg/ml、
25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml 進行活性染。
2.2.2.3 冷凍乾燥
將沉澱後的粗酵素液放入-80℃冷凍庫，再放入冷凍乾燥機，以 0.014mbar 與-53℃進行冷凍乾燥至少 12 小時，得到酵素粉末。
2.2.3 Alterococcus agarolyticus S3PY 固態培養基製備 Agar 18g/L
Marine Broth 2216(Difco) 37.4g/L (pH 7.6±0.2)
先煮沸一分鐘後溶解培養基後，以 121℃滅菌 15 分鐘
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2.2.4 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽培養 2.2.4.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽培養
將 5L 之發酵槽裝入 3L PYMA 培養基，接 300ml PYA 菌液至發 酵槽，以 45℃、200rpm 培養 48 小時。
2.2.4.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽通氣量測試培養 將 5L 之發酵槽裝入 3L PYMA 培養基培養 Alterococcus
agarolyticus S3PY，接 300ml 菌液至發酵槽，以 45℃、200rpm 培養
48 小時，並用空氣壓縮機增加通氣量 0 vvm、0.5 vvm 與 1 vvm。每 隔 12 小時取菌液測 OD660生長曲線，並測定發酵液活性。另外取通 氣量 0.5 vvm 的發酵液後，立即加入十分之一體積的 0.05M EDTA 再 進行純化，觀察 EDTA 是否對洋菜酶的純化有影響。第三節、Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶純化 2.3.1 硫酸銨沉澱
將發酵液以 7000rpm 進行離心 35 分鐘，收集上清液。以 75%硫 酸銨進行沉澱後放置一天，用 12000rpm 離心 10 分鐘，將沉澱的蛋白 質裝入透析膜中，於 50mM Sodium phosphate buffer (pH6.8)透析 48 小時，每 12 小時換一次 buffer，所得為洋菜酶粗酵素液。
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2.3.2 丙酮沉澱
本步驟參考自(Francois et al., 2014)，將 500ml 錐形瓶發酵液離心 得到的上清液各分為 250ml，分別進行硫酸銨沉澱與丙酮沉澱。將進 行丙酮沉澱的樣本裝入燒杯放入加水的冰桶置於 4℃冰箱緩慢倒入 3 倍體積的-20℃丙酮後放置一天，以 13000rpm 離心 10 分鐘，收集沉 澱物，與硫酸銨沉澱的樣本比較活性。
2.3.3 離子交換層析
Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶帶負電荷，因此使用陰離 子交換樹脂來純化。本步驟參考自(蘇，2005)與(Rhee et al, 2010)，將 100g Toyopearl QAE-550C(TOSOH)膠體倒入 1L 燒杯，加入 RO 水 800ml 攪拌，攪拌停止後沉澱，倒掉上清液，以上步驟重複 5 次以上
。加入含有 1M NaCl 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 攪拌，
攪拌停止後沉澱，倒掉上清液。加入含有 1M NaCl 的 5mM Sodium phosphate buffer 和膠體形成 30~50%的泥狀，倒入管柱(1.6/40cm)進行 膠體堆疊。以 1L 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer、流速 0.5ml/min 在 4℃冰箱中平衡酸鹼值。
管柱內緩衝液與膠體齊後加入粗酵素液，使其自然流出，加完粗 酵素液後，使其與膠體作用 1 小時，以流速 0.5ml/min 含有 5mM EDTA
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的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管收集 5ml，收 集 60 管。第 60~240 管拉 NaCl 濃度梯度，由 0%拉到 100% 1M NaCl，
240 管以後持續以 1M NaCl 洗，收集 60 管，共回收 300 管。測定酵 素活性與 OD280。
2.3.4 膠體過濾層析法 2.3.4.1 Sephacryl S100HR
本步驟參考自(蘇，2005)，將管柱(1.6/100cm)架設好，倒入 Sephacryl S100HR 膠體，以含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 平衡管柱。加入酵素樣本後，以流速 0.8ml/min 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管 收集 2ml，收集 320 管，每隔兩管測定酵素活性與 OD280。
2.3.4.2 Toyopearl HW55F
本步驟參考自(Rhee et al, 2010)，將管柱(1.6/100cm)架設好，倒 入 Toyopearl HW55F 膠體，以含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 平衡管柱。加入酵素樣本後，以流速 0.8ml/min 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管 收集 2ml，收集 160 管，每隔兩管測定酵素活性與 OD280。
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2.3.5 濃縮
本實驗使用濃縮管(Sartorius Stedim Biotech 30000 MWCO PES) 去除 EDTA 與鹽分，將樣本放入濃縮管，以 10000g、4℃離心 10 分 鐘，以 ddH2O 回溶樣本。
第四節、洋菜酶活性分析 2.4.1 還原糖變化量測定
利用受質洋菜糖與洋菜酶反應產生的還原糖增加量，來判斷洋菜 酶的水解活性。
2.4.1.1 緩衝液與受質製備
製備 50mM 的 MOPSO 緩衝液，調至 pH 6.8。加入洋菜糖(agarose) 配製成 2g/L 的受質溶液。
2.4.1.2 半乳糖標準品製備
取 0.1g 半乳糖溶於 100ml pH6.8 50mM MOPSO 緩衝液，即為 10 倍濃度的半乳糖溶液，進行 10 倍稀釋成為 1 倍濃度的半乳糖標準液 (100μg/ml)。再將 1 倍濃度的半乳糖標準液稀釋成 20μg/ml、40μg/ml、
60μg/ml、80μg/ml 與 100μg/ml 的半乳糖標準液
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2.4.1.3 還原糖反應劑製備 Reagent A：
Anhydrous Na2CO3 40g/L Glycine 16g/L CuSO4‧5H2O 0.45g/L
Reagent B(需避光，顏色變黃丟棄)
Neocuproune-HCl 1.2g/L
2.4.1.4 還原糖變化量測定(參考 Leon et al., 1992)
取兩組 0.05ml 酵素液，一組加入 2ml reagent A 停止反應，加入 0.45ml 受質，55℃反應 10 分鐘；另一組加入 0.45ml 受質，55℃反應 10 分鐘，加入 2ml reagent A 停止反應。加入呈色試劑 2ml reagent B 後進行沸水浴 10 分鐘，以冷水降至室溫，使用 Spectrophotometer SP-8001 測 OD450，在 1 小時內完成。
活性單位：每一單位(1 unit)酵素活性為：每分鐘能產生的 1μmole 半乳糖的酵素量1 unit = 1 μmole galactose equivalent/min
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30% Acrylamide/bis stock 3.35ml(29.2g acrylamide + 0.8g N’N’ –bis – methylene -acrylamide , 加入 ddH2O 到 100ml)
10X running buffer：
Tris-base 30g/L Glycine 144g/L SDS 6g/L
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4 倍樣本緩衝液(sample buffer)：
ddH2O 4ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 1ml Glycerol 0.8ml 10% SDS 1.6ml 2-β-mercaptoethanpl 0.4ml 0.05% bromophenol blue 0.2ml
儲存於 4℃，使用時與蛋白質樣本 1：3 混合使用
CBR 染液：
methanol 500ml ddH2O 400ml acetic acid 100ml
coomassie blue R250 10g
退染液：
methanol 500ml ddH2O 400ml acetic acid 100ml
將蛋白質樣本混合樣本緩衝液後注入膠體，以 80V 電壓在 1 倍 的 running buffer 中電泳 3 小時。以 50 mM pH6.8 Sodium phosphate
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buffer 加入 0.5% agarose 配製成膠體，將洋菜酶酵素液進行 SDS-PAGE 電泳後，取下電泳膠片以 50 mM pH6.8 Sodium phosphate buffer 清洗，
放置於 0.5% agarose 膠體上，於 45℃反應 1 小時(依據酵素活性調整)，
反應後用碘液(0.05M I2 in 0.12M KI)染色。
2.4.2.2 發酵液電泳活性染建立
將 3 份發酵液樣本進行 SDS-PAGE。將 SDS 膠片以 50mM Sodium phosphate buffer(pH6.8)清洗後，在 45℃反應。第一片蓋上(作為反應 8 小時) 蓋在 0.5% agarose 膠體上，在 2 小時後蓋上第二片(作為反應 6 小時)，最後在 6 小時後蓋上第三片(作為反應 2 小時)，反應後用碘 液染色。觀察反應時間的差異。
第五節、蛋白質定量
本實驗所用的蛋白質標準品為 Bovine serum abumin(BSA)，蛋白 質標準液的濃度為 0.125 ~ 0.5mg/ml。將樣本蛋白質取 0.2ml，取 0.8ml 的 protein assay dye reagent(Bio Rad，稀釋五倍)混合後置於室溫下反 應 5 分鐘，以分光光度計(Spectrophotometer SP-8001)測吸光值 595nm。
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第六節、蛋白酶抑配製制測試 2.6.1 蛋白酶抑制劑配製
根據文獻(邱，2011)，Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 可 抑制洋菜酶被分解，Roche inhibitor cocktail 沒有效果。本實驗將探討 該抑制劑何種成分能抑制洋菜酶被分解。
抑制劑：
Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465：可抑制 Serine protease、
Cysteine protease、Aspartic protease、metalloprotease，取 215mg 粉末 溶於 1ml DMSO，並加入 4ml ddH2O。
Pepsin A：為 Aspartic protease 抑制劑，配 10mM 溶於 100%乙醇。
Chymysin：為 Serine protease、Cysteine protease 抑制劑，配 10mM 溶 於 DMSO。
Roche inhibitor cocktail：為 Serine protease、Cysteine protease 抑制劑，
將一錠的 Roche inhibitor 溶於 1.5ml ddH2O 中，再稀釋 7 倍。
EDTA：為金屬蛋白酶抑制劑，本實驗使用 0.1M，與 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 中 EDTA 濃度一樣
2.6.2 抑制劑成分效果測試
將 100ul 1.25mg/ml agarase 分別加入不同的 10 μl 抑制劑在 4℃、
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30℃培養箱反應一個月。進行 SDS-PAGE，將電泳完的 SDS-PAGE 膠片蓋在 0.5% agarose gel 上，在 45℃培養箱反應 1 小時，倒碘液在 0.5% gel 上，觀察反應結果。
2.6.3 抑制劑濃度測試
將 100ul 1.25mg/ml agarase 分別加入不同濃度的 10ul EDTA(0.3M, 0.2M, 0.1M, 50mM, 25mM, 0mM)與 Protease inhibitor cocktail(Sigma, P8465)在 4℃、30℃培養箱反應一個月。進行 SDS-PAGE，將電泳完 的 SDS-PAGE 膠片蓋在 0.5% agarose gel 上，在 45℃培養箱反應 1 小 時，倒碘液在 0.5% gel 上，觀察反應結果。
第七節、蛋白酶定性分析 2.7.1 蛋白酶分子量分析
實驗採用酶譜法觀察蛋白酶的分子量，參考自(Almas et al, 2009)，配製 10% separating gel(含 0.0385% gelatin 作為蛋白酶的基質) 與 4% stacking gel。
將洋菜酶粗酵素液進行 SDS-PAGE，以 2.5% Triton X-100(以 50mM Tris-HCl, pH7.6 緩衝液稀釋)浸泡 30 分鐘 2 次去除膠體裡的 SDS。浸泡在 Developing buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.6 containing 0.2 M NaCl and 5mM CaCl2)放到 45℃培養箱靜置 16-20 小時。最後使用
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Biolab rapid stain 染劑進行染色 15 分鐘，再用 ddH2O 退染 10 分鐘 2 次。顯示透明的區域為蛋白酶活性區域，對照 SDS-PAGE 所用的 marker，可得知 agarase 分子量大小效果。將膠體取出後沖洗以兩層 玻璃紙將膠體包覆在玻璃上，玻璃紙與膠體之間加 ddH2O 以防止氣 泡產生，置於通風處保存。
2.7.2 蛋白酶活性測試 2.7.2.1 蛋白酶活性測試
取 1g casein 溶於 50ml pH7.6 0.05M Tris buffer。以 1ml tris-casein buffer 分別加入 25 μl, 50 µl, 75 μl, 100 μl 1.81mg/ml tyrosine 與 20 μl 0.01M CaCl2作為標準品，實驗組每管加入 1ml tris-casein buffer、20 μl 0.01M CaCl2、100 μl 粗酵素液。
在 30℃反應 10 分鐘，加入 2 ml 5% TCA 停止反應，以 2000 rpm 10 min 進行離心。每管取 1ml 上清液加入 2.0ml 0.5M NaOH 混合， 再 加入 0.1ml Folin-Ciacalteu 試劑，反應 10 分鐘後，測 OD550 。
2.7.2.2 金屬離子對蛋白酶活性影響
將試管加入 1ml tris-casein buffer 與 100 μl 粗酵素液，控制組加 入 20 μl ddH2O，實驗組分別加入 20 μl 0.01M CaCl2、0.01M EDTA，
在 55℃反應 15 分鐘。加入 2 ml 5% TCA 停止反應，以 2000 rpm 10 min
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進行離心。每管取 1ml 上清液加入 2.0ml 0.5M NaOH 混合， 再加入 0.1ml Folin-Ciacalteu 試劑，反應 10 分鐘後，測 OD550 。
第八節、各分子洋菜酶活性分析 2.8.1 洋菜酶最適反應溫度
將洋菜酶活性調整成 0.1U/ml，依照還原糖酵素活性測定法，分 別在 45、50、55、60、65、70、75℃反應 10 分鐘，測還原糖變化量。
2.8.2 洋菜酶熱穩定性
將洋菜酶活性調整成 0.25U/ml，在 60℃分別反應 1 小時、3 小時、
6 小時與 12 小時，依照還原糖酵素活性測定法測定酵素殘存活性。
第九節、水解產物分析 2.9.1 實驗材料
TLC 分解水解產物(Kirimura et. al., 1999) 薄層分析片為 TLC silica gel 60 F254(Merck) 展開劑：
n-butanol acetic acid
ddH2O 組成比例為 2:1:1
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呈色劑：
Naphthoresorcinol 0.2g Ethanol 100ml H3PO4 10ml
2.9.2 水解產物分析
配置 0.1% agarose 溶液，取 100μl 加入 0.1U 洋菜酶 10μl 進行 反應 12 與 24 小時，得到水解產物。將 silica gel 60 裁剪後用鉛筆畫 上起始線，樣本與標準品(新洋菜六糖、新洋菜四糖與新洋菜二糖)取 5μl 用毛細管點上 silica gel 60，用展開劑進行展開，展開劑不能碰到 起始線，展到終止線後進行風乾，噴上呈色劑再以 110℃烘乾 10 分 鐘，求出 Rf 值，並比對標準品的位置位置。
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第三章 結果
第一節、洋菜酶活性分析建立 3.1.1 洋菜酶的酵素活性分析建立
圖一為粗洋菜酶的酵素動力學，計算洋菜酶的活性來決定要使 用的洋菜糖濃度。當洋菜酶以 agarose 為基質時，得到 Vmax= 0.026 μ mole/min、Km=0.201g/L。進行酵素活性測試時，將以 Km的十倍 2g/L 來當成基質的濃度。
3.1.2 發酵液電泳活性染建立
前人研究都是以回收後的蛋白質當電泳對象。以發酵液進行電泳 的好處是可以立即知道所生產蛋白質的分子量，不會因回收的誤差造 成干擾；也可以因此決定是否要進行回收。反應 2 小時後，80~175kDa 的洋菜酶隱約出現條帶；反應 6 小時後，80~175kDa 以上的洋菜酶有 明顯的條帶，而 46kDa 以上的洋菜酶隱約出現條帶；而 8 小時後，
46kDa 的洋菜酶才有明顯的條帶(圖二)。
46kDa 的洋菜酶才有明顯的條帶(圖二)。