Alterococcus agarolyticus S3PY 耐熱大分子洋菜酶純化與定性

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I

私立東吳大學微生物學系碩士論文

Master’s Thesis

Department of Microbiology Soochow University

指導教授：李重義博士(Dr. Chung-Yi Lee)

Alterococcus agarolyticus S3PY 耐熱大分子洋菜酶純化與定性

Purification and characterization of thermostable high molecular weight

agarase from Alterococcus agarolyticus S3PY

研究生：鄭永熙(Yung- Hsi Cheng)撰

中華民國一百零五年七月

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II

摘要

本實驗室從綠島溫泉篩選出洋菜分解菌 Alterococcus agarolyticus S3PY，前人得到的產物都是不同分子量大小的洋菜酶，懷疑是蛋白酶分解所致。本研究證實蛋白酶的存在，並證實 EDTA 可抑制蛋白酶。

在發酵槽培養時不通氣，純化時加入 EDTA 抑制蛋白酶，可得到大分子洋菜酶。本實驗離子交換層析純化出耐熱 53kDa 洋菜酶，該洋菜酶擁有熱穩定性，可在 60℃維持活性 1 小時，12 小時後活性還剩下 83%。

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III

Abstract

The agarolytic bacterium Alterococcus agarolyticus S3PY was isolated from hot spring in Ludao by our laboratory. Previous research revealed that product are multiple agarases, they were of the opinion that it caused by protease. This study confirmed the presence of protease, and it can be inhibited by EDTA. In this research, high molecular weight agarase can be obtained in fermenter culture without aeration and after purification in the presence of EDTA. A new thermostable 53kDa-agarase was found after purification with ion exchange column. The

53kDa-agarase has high thermal stability that retained approximately 99

% of the initial activity after incubation for 1 hour at 60 ℃, and retained 83 % activity after 12 hours.

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IV

第一章前言

第一節、洋菜糖介紹 1.1.1 洋菜糖結構

洋菜(Agar)為紅藻綱(Rhodophyceae)藻類細胞壁主要成分，由 70%的洋菜糖(agarose)與 30%洋菜膠(agaropectin)組成。洋菜糖為高分子聚合糖，由 D-galactose 和 3,6-anhydro-L-galactopyranose 以 α-(1→3) 和β-(1→4) 糖苷鍵交互鍵結。

1.1.2 洋菜糖的水解產物與應用

當洋菜糖的α-(1→3)鍵被水解時會產生洋菜寡糖，而 β-(1→4)鍵被水解時會產生新洋菜寡糖。新洋菜寡糖具有低熱量的特性，可用來做健康食品。新洋菜雙糖對皮膚有美白與保濕的功效(Reijiro et al, 1997；Jang et al, 2009)。

第二節、洋菜酶 1.2.1 洋菜酶

洋菜酶(agarase)具有水解洋菜的能力，含有洋菜酶的微生物在培養基上菌落均有凹陷的現象，此可作為觀察依據。洋菜酶可分為α-

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洋菜酶和β-洋菜酶(Fu and Kim，2010)，α-洋菜酶水解洋菜 α-(1→3) 鍵結；β-洋菜酶水解洋菜β-(1→4)鍵結，大部分的洋菜酶都屬於 β- 洋菜酶。而 β-洋菜酶又可分為 β-agarase I 與 β-agarase II：β-agarase I 作用於新洋菜八醣(neoagarooctaose)與新洋菜六醣(neoagarohexaose)，

生成新洋菜四醣(neoagarotetraose)；β-agarase II 作用於新洋菜四醣，

生成新洋菜雙醣(neoagarobiose)(楊，2010)。

1.2.2 洋菜酶基質特異性

洋菜酶具有基質特異性，因此不同洋菜酶水解洋菜的產物也不同。大部分的洋菜酶可水解六糖以上的寡糖，少部分只能水解四糖~

十糖或二糖。

1.2.3 洋菜酶應用

洋菜酶主要的應用是分解洋菜來獲得洋菜寡糖，此外洋菜酶還能用來從海藻分離出原生質體(Araki et al, 1998)，以及從洋菜膠回收 DNA(Ghazi M et al, 2013；Sugano et al, 1993)。

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1.2.4 洋菜酶生產菌 1.2.4.1 洋菜酶生產菌

洋菜酶主要是由海洋細菌所生產，常見的有 Pseudomonas、

Pseudoalteromonas、Vibrio(Sugano et al, 1993)、 Streptomyces、

Agarivorans、Alteromonas、Cytophaga(Van et al, 1974)和 Bacillus 等

(Feng ZH et al, 2012)。但大多數海洋菌生產的洋菜酶並不耐熱，60℃

就會失去活性。

1.2.4.2 嗜高溫菌

研究指出嗜熱菌可在 70℃以上的環境生長，其生產的酵素在高溫具有熱穩定性(Vieille and Zeikus，2001)，在工業生產時不用降溫，

能降低微生物汙染，又因代謝速率快，可得到較高的酵素產量(戴，

2004)。因此從嗜熱菌尋找熱穩定洋菜酶成為研究的方向。

嗜熱酵素擁有熱穩定性與高溫高活性的特點，因此嗜熱酵素常用在工業生產上。能生產耐熱洋菜酶的微生物大多屬於溫泉菌。例如

Bacillus sp. BI-3(Jiang Li et al, 2014)、Alterococcus agarolyticus

S3PY(顏，2002)、Microbulbifer sp. SD-1 (Do Kyun Kim et al, 2011)

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1.2.5 洋菜酶純化 1.2.5.1 硫酸銨沉澱

蛋白質表面上有部分非極性區域，硫酸銨會搶走非極性區域表面的水分子，使蛋白質之間的非極性區域互相吸引形成沉澱。

1.2.5.2 丙酮沉澱

有機溶劑如丙酮或乙醇會降低蛋白質溶液的水濃度，使蛋白質溶解度下降而沉澱。但有機溶劑和水反應會產生熱，導致蛋白質變性，

所以有機溶劑必須先以極低溫處理才能操作。

1.2.5.3 冷凍乾燥

ㄧ般乾燥法會加熱導致酵素結構破壞。冷凍乾燥法藉由在冷凍狀態降低壓力使水分昇華來去除水分，以保存樣本。也因為在低溫環境，

使得粗酵素中的蛋白酶不會分解洋菜酶。

1.2.5.4 離子交換層析法

離子交換層析法為以固定相的電荷以離子鍵吸附相反電荷的蛋白質，而不帶電荷或與固定相相同電荷的分子會直接流出。吸附的蛋白質會使用 NaCl 改變蛋白質電荷來溶離；電荷越高的蛋白質離子鍵

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越強，因此需要的鹽濃度越高。根據文獻目前用來純化洋菜酶的離子交換層析管柱有 DEAE-Toyopearl 650M(蘇，2005)、DEAE-Sepharose CL-6B、Q-Sepharose F.F(Jiang et al, 2015；Fu et al, 2008)、

DEAE-cellulose(Jorge et al, 1998)、Toyopearl QAE-550(Sugano et al, 1994；Rhee et al, 2010)。

1.2.5.5 膠體過濾層析法

膠體過濾層析是以蛋白質的分子量大小來分離蛋白質，樣本分子量越小，越容易留在膠體中，而大分子會先流出來，藉此來分離蛋白質。目前用來純化洋菜酶的膠體過濾管柱有 Sephadex G-100(謝，2008；

Ghazi M et al, 2013)、Toyopearl HW55f(Rhee et al, 2010)、Sephacryl S-100HR(蘇，2005；Wandong et al, 2008)、Sephacryl S-200(Jiang et al, 2015)、Sephadex G75(Jorge et al, 1998)。

第三節、蛋白酶

1.3.1 蛋白酶介紹

蛋白酶可水解胜肽鍵來分解蛋白質，常用於食品、皮革和醫療工業等。根據前人文獻，蛋白酶會水解蛋白質，例如酵素，導致蛋白質產物分子量會短於基因序列所預測的分子量(Dong et al, 2007)。

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1.3.2 酶譜法

酶譜法(zymography)，將 SDS-PAGE 膠體加入蛋白質，如 casein 或 gelatin，藉由讓蛋白酶分解電泳膠體的蛋白質，使膠體其區域無法被染色，來推測蛋白酶的分子量(Oliver et al, 1999)。

第四節、研究目的：

1995 年本實驗室從綠島溫泉篩選出具有分解洋菜能力的嗜鹽嗜 熱菌株 S3PY(陳，1997)，已鑑定出此菌株為 Alterococcus agarolyticus，

有八種洋菜酶產物，皆屬於β-洋菜酶(顏，2002)。2006 年蘇嘉彥學 長有對 Alterococcus agarolyticus S3PY 進行純化，但沒有完整純化出 大分子量洋菜酶(蘇，2006)。2011 年邱士明學長懷疑是蛋白酶把洋菜酶切割成八種分子量，並發現蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465)能暫時阻止洋菜酶被分解(邱，2011)。

本實驗將證實蛋白酶是否存在，再進一步分析該抑制劑的何種成分有效，並藉抑制蛋白酶以建立有效純化完整洋菜酶的方法，並分析不同分子量洋菜酶的特性，如反應溫度、熱安定性與水解產物等。

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第二章材料與方法

第一節、藥品與儀器 2.1.1 藥品

藥品廠牌 Acrylamide Bio-rad Agar Nacalai Agarose Invitrogen Ammonium persulfate, APS Bio-rad Bis-acrylamide Bio-rad Braford reagent Bio-rad Chymysin Sigma EDTA Nacalai Ferric ammonium citrate Sigma Folin-Ciacalteu Nacalai Glycine Nacalai K2HPO4 Nacalai MgCl2．6H2O Nacalai MOPSO Sigma Naphthoresorcinol Sigma NaCl Nacalai Na2CO3 Nacalai Na₂HPO₄ Nacalai

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NaH2PO4 Nacalai Pepsin A Sigma Prestained protein marker P7708S BioLabs Prestained protein marker P7712S BioLabs Protein inhibitor cocktail P8465 Sigma Protein inhibitor cocktail Roche SDS Sigma

N,N,N',N'-tetramethyl- ethane-1,2-diamine(TEMED) Bio-rad Tris Nacalai

2.1.2 儀器

儀器廠牌發酵槽 Biostat Spectrophotometer SP-8001 Metertech Freezone 1L Labconco 分液收集系統 Gilison

第二節、菌株活化、培養與保存

2.2.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 種菌製備

本實驗所使用的菌株為 Alterococcus agarolyticus S3PY，這是本 實驗室於 1995 年從綠島溫泉篩選得到的。

從-80℃取 Alterococcus agarolyticus S3PY 種菌接入 50ml PYA

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broth，以 45℃震盪培養(140rpm)48 小時，取菌液接種(使 OD660=0.022) 至新的 PYA broth 培養 24 小時，當作種菌。

菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 液態培養基(PYA)：

Bacto Peptone (Difco) 4g/L Bacto yeast extract (Difco) 2g/L MgCl．6H2O 0.5g/L NaCl 20g/L K2HPO4 2g/L Agar 0.25g/L (pH7) 一個錐形瓶裝 50ml

2.2.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 螺旋蓋錐形瓶培養 2.2.2.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 錐形瓶培養

用 250ml 螺旋錐形瓶裝入 50ml PYMA broth，接菌液至培養液中，

使起始 OD₆₆₀=0.01，放入 45℃震盪培養(140rpm)48 小時。

菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 基礎液態培養基(PYMA)：

Bacto Peptone (Difco) 4g/L Bacto yeast extract (Difco) 1g/L MgCl．6H2O 0.5g/L NaCl 10g/L

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CaCl2 0.1g/L Ferric ammonium citrate 0.03g/L MOPSO 4.5g/L Agar 0.25g/L (pH7) 一個錐形瓶裝 50ml

2.2.2.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 培養時間測試

將菌液接種至 PYMA broth 後，分別培養 36 與 48 小時，硫酸銨沉澱後進行冷凍乾燥。將兩個時段的冷凍乾燥產物以 ddH₂O 溶解配置成 1、2、3、4、5mg/ml 測定酵素活性與比活性；另配置 12.5mg/ml、

25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml 進行活性染。

2.2.2.3 冷凍乾燥

將沉澱後的粗酵素液放入-80℃冷凍庫，再放入冷凍乾燥機，以 0.014mbar 與-53℃進行冷凍乾燥至少 12 小時，得到酵素粉末。

2.2.3 Alterococcus agarolyticus S3PY 固態培養基製備 Agar 18g/L

Marine Broth 2216(Difco) 37.4g/L (pH 7.6±0.2)

先煮沸一分鐘後溶解培養基後，以 121℃滅菌 15 分鐘

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2.2.4 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽培養 2.2.4.1 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽培養

將 5L 之發酵槽裝入 3L PYMA 培養基，接 300ml PYA 菌液至發酵槽，以 45℃、200rpm 培養 48 小時。

2.2.4.2 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵槽通氣量測試培養 將 5L 之發酵槽裝入 3L PYMA 培養基培養 Alterococcus

agarolyticus S3PY，接 300ml 菌液至發酵槽，以 45℃、200rpm 培養

48 小時，並用空氣壓縮機增加通氣量 0 vvm、0.5 vvm 與 1 vvm。每隔 12 小時取菌液測 OD₆₆₀生長曲線，並測定發酵液活性。另外取通氣量 0.5 vvm 的發酵液後，立即加入十分之一體積的 0.05M EDTA 再進行純化，觀察 EDTA 是否對洋菜酶的純化有影響。

第三節、Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶純化 2.3.1 硫酸銨沉澱

將發酵液以 7000rpm 進行離心 35 分鐘，收集上清液。以 75%硫酸銨進行沉澱後放置一天，用 12000rpm 離心 10 分鐘，將沉澱的蛋白質裝入透析膜中，於 50mM Sodium phosphate buffer (pH6.8)透析 48 小時，每 12 小時換一次 buffer，所得為洋菜酶粗酵素液。

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2.3.2 丙酮沉澱

本步驟參考自(Francois et al., 2014)，將 500ml 錐形瓶發酵液離心得到的上清液各分為 250ml，分別進行硫酸銨沉澱與丙酮沉澱。將進行丙酮沉澱的樣本裝入燒杯放入加水的冰桶置於 4℃冰箱緩慢倒入 3 倍體積的-20℃丙酮後放置一天，以 13000rpm 離心 10 分鐘，收集沉澱物，與硫酸銨沉澱的樣本比較活性。

2.3.3 離子交換層析

Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶帶負電荷，因此使用陰離 子交換樹脂來純化。本步驟參考自(蘇，2005)與(Rhee et al, 2010)，將 100g Toyopearl QAE-550C(TOSOH)膠體倒入 1L 燒杯，加入 RO 水 800ml 攪拌，攪拌停止後沉澱，倒掉上清液，以上步驟重複 5 次以上

。加入含有 1M NaCl 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 攪拌，

攪拌停止後沉澱，倒掉上清液。加入含有 1M NaCl 的 5mM Sodium phosphate buffer 和膠體形成 30~50%的泥狀，倒入管柱(1.6/40cm)進行膠體堆疊。以 1L 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer、流速 0.5ml/min 在 4℃冰箱中平衡酸鹼值。

管柱內緩衝液與膠體齊後加入粗酵素液，使其自然流出，加完粗酵素液後，使其與膠體作用 1 小時，以流速 0.5ml/min 含有 5mM EDTA

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的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管收集 5ml，收集 60 管。第 60~240 管拉 NaCl 濃度梯度，由 0%拉到 100% 1M NaCl，

240 管以後持續以 1M NaCl 洗，收集 60 管，共回收 300 管。測定酵素活性與 OD280。

2.3.4 膠體過濾層析法 2.3.4.1 Sephacryl S100HR

本步驟參考自(蘇，2005)，將管柱(1.6/100cm)架設好，倒入 Sephacryl S100HR 膠體，以含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 平衡管柱。加入酵素樣本後，以流速 0.8ml/min 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管收集 2ml，收集 320 管，每隔兩管測定酵素活性與 OD280。

2.3.4.2 Toyopearl HW55F

本步驟參考自(Rhee et al, 2010)，將管柱(1.6/100cm)架設好，倒入 Toyopearl HW55F 膠體，以含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 平衡管柱。加入酵素樣本後，以流速 0.8ml/min 含有 5mM EDTA 的 pH6.8 50mM Sodium phosphate buffer 進行沖提，每管收集 2ml，收集 160 管，每隔兩管測定酵素活性與 OD280。

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2.3.5 濃縮

本實驗使用濃縮管(Sartorius Stedim Biotech 30000 MWCO PES) 去除 EDTA 與鹽分，將樣本放入濃縮管，以 10000g、4℃離心 10 分鐘，以 ddH2O 回溶樣本。

第四節、洋菜酶活性分析 2.4.1 還原糖變化量測定

利用受質洋菜糖與洋菜酶反應產生的還原糖增加量，來判斷洋菜酶的水解活性。

2.4.1.1 緩衝液與受質製備

製備 50mM 的 MOPSO 緩衝液，調至 pH 6.8。加入洋菜糖(agarose) 配製成 2g/L 的受質溶液。

2.4.1.2 半乳糖標準品製備

取 0.1g 半乳糖溶於 100ml pH6.8 50mM MOPSO 緩衝液，即為 10 倍濃度的半乳糖溶液，進行 10 倍稀釋成為 1 倍濃度的半乳糖標準液 (100μg/ml)。再將 1 倍濃度的半乳糖標準液稀釋成 20μg/ml、40μg/ml、

60μg/ml、80μg/ml 與 100μg/ml 的半乳糖標準液

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2.4.1.3 還原糖反應劑製備 Reagent A：

Anhydrous Na2CO3 40g/L Glycine 16g/L CuSO4‧5H2O 0.45g/L

Reagent B(需避光，顏色變黃丟棄)

Neocuproune-HCl 1.2g/L

2.4.1.4 還原糖變化量測定(參考 Leon et al., 1992)

取兩組 0.05ml 酵素液，一組加入 2ml reagent A 停止反應，加入 0.45ml 受質，55℃反應 10 分鐘；另一組加入 0.45ml 受質，55℃反應 10 分鐘，加入 2ml reagent A 停止反應。加入呈色試劑 2ml reagent B 後進行沸水浴 10 分鐘，以冷水降至室溫，使用 Spectrophotometer SP-8001 測 OD450，在 1 小時內完成。

活性單位：每一單位(1 unit)酵素活性為：每分鐘能產生的 1μmole 半乳糖的酵素量1 unit = 1 μmole galactose equivalent/min

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2.4.2 SDS-PAGE 電泳活性染

2.4.2.1 SDS-PAGE 電泳材料製備與實驗步驟 10%分離膠體(Separation gel)：

ddH2O 4ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 2.5ml 10% SDS 100ul

30% Acrylamide/bis stock 3.35ml(29.2g acrylamide + 0.8g N’N’ –bis – methylene -acrylamide , 加入 ddH2O 到 100ml)

10% APS 50ul TEMED 10ul

4% 焦集膠體(Stacking gel)：

ddH2O 3.05ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 1.25ml 10% SDS 50ul 30% Acrylamide/bis stock 0.65ml 10% APS 25ul TEMED 5ul

10X running buffer：

Tris-base 30g/L Glycine 144g/L SDS 6g/L

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4 倍樣本緩衝液(sample buffer)：

ddH2O 4ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 1ml Glycerol 0.8ml 10% SDS 1.6ml 2-β-mercaptoethanpl 0.4ml 0.05% bromophenol blue 0.2ml

儲存於 4℃，使用時與蛋白質樣本 1：3 混合使用

CBR 染液：

methanol 500ml ddH2O 400ml acetic acid 100ml

coomassie blue R250 10g

退染液：

methanol 500ml ddH2O 400ml acetic acid 100ml

將蛋白質樣本混合樣本緩衝液後注入膠體，以 80V 電壓在 1 倍的 running buffer 中電泳 3 小時。以 50 mM pH6.8 Sodium phosphate

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buffer 加入 0.5% agarose 配製成膠體，將洋菜酶酵素液進行 SDS-PAGE 電泳後，取下電泳膠片以 50 mM pH6.8 Sodium phosphate buffer 清洗，

放置於 0.5% agarose 膠體上，於 45℃反應 1 小時(依據酵素活性調整)，

反應後用碘液(0.05M I2 in 0.12M KI)染色。

2.4.2.2 發酵液電泳活性染建立

將 3 份發酵液樣本進行 SDS-PAGE。將 SDS 膠片以 50mM Sodium phosphate buffer(pH6.8)清洗後，在 45℃反應。第一片蓋上(作為反應 8 小時) 蓋在 0.5% agarose 膠體上，在 2 小時後蓋上第二片(作為反應 6 小時)，最後在 6 小時後蓋上第三片(作為反應 2 小時)，反應後用碘液染色。觀察反應時間的差異。

第五節、蛋白質定量

本實驗所用的蛋白質標準品為 Bovine serum abumin(BSA)，蛋白質標準液的濃度為 0.125 ~ 0.5mg/ml。將樣本蛋白質取 0.2ml，取 0.8ml 的 protein assay dye reagent(Bio Rad，稀釋五倍)混合後置於室溫下反應 5 分鐘，以分光光度計(Spectrophotometer SP-8001)測吸光值 595nm。

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第六節、蛋白酶抑配製制測試 2.6.1 蛋白酶抑制劑配製

根據文獻(邱，2011)，Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 可抑制洋菜酶被分解，Roche inhibitor cocktail 沒有效果。本實驗將探討該抑制劑何種成分能抑制洋菜酶被分解。

抑制劑：

Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465：可抑制 Serine protease、

Cysteine protease、Aspartic protease、metalloprotease，取 215mg 粉末溶於 1ml DMSO，並加入 4ml ddH2O。

Pepsin A：為 Aspartic protease 抑制劑，配 10mM 溶於 100%乙醇。

Chymysin：為 Serine protease、Cysteine protease 抑制劑，配 10mM 溶於 DMSO。

Roche inhibitor cocktail：為 Serine protease、Cysteine protease 抑制劑，

將一錠的 Roche inhibitor 溶於 1.5ml ddH2O 中，再稀釋 7 倍。

EDTA：為金屬蛋白酶抑制劑，本實驗使用 0.1M，與 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 中 EDTA 濃度一樣

2.6.2 抑制劑成分效果測試

將 100ul 1.25mg/ml agarase 分別加入不同的 10 μl 抑制劑在 4℃、

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30℃培養箱反應一個月。進行 SDS-PAGE，將電泳完的 SDS-PAGE 膠片蓋在 0.5% agarose gel 上，在 45℃培養箱反應 1 小時，倒碘液在 0.5% gel 上，觀察反應結果。

2.6.3 抑制劑濃度測試

將 100ul 1.25mg/ml agarase 分別加入不同濃度的 10ul EDTA(0.3M, 0.2M, 0.1M, 50mM, 25mM, 0mM)與 Protease inhibitor cocktail(Sigma, P8465)在 4℃、30℃培養箱反應一個月。進行 SDS-PAGE，將電泳完的 SDS-PAGE 膠片蓋在 0.5% agarose gel 上，在 45℃培養箱反應 1 小時，倒碘液在 0.5% gel 上，觀察反應結果。

第七節、蛋白酶定性分析 2.7.1 蛋白酶分子量分析

實驗採用酶譜法觀察蛋白酶的分子量，參考自(Almas et al, 2009)，配製 10% separating gel(含 0.0385% gelatin 作為蛋白酶的基質) 與 4% stacking gel。

將洋菜酶粗酵素液進行 SDS-PAGE，以 2.5% Triton X-100(以 50mM Tris-HCl, pH7.6 緩衝液稀釋)浸泡 30 分鐘 2 次去除膠體裡的 SDS。浸泡在 Developing buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.6 containing 0.2 M NaCl and 5mM CaCl2)放到 45℃培養箱靜置 16-20 小時。最後使用

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Biolab rapid stain 染劑進行染色 15 分鐘，再用 ddH2O 退染 10 分鐘 2 次。顯示透明的區域為蛋白酶活性區域，對照 SDS-PAGE 所用的 marker，可得知 agarase 分子量大小效果。將膠體取出後沖洗以兩層玻璃紙將膠體包覆在玻璃上，玻璃紙與膠體之間加 ddH2O 以防止氣泡產生，置於通風處保存。

2.7.2 蛋白酶活性測試 2.7.2.1 蛋白酶活性測試

取 1g casein 溶於 50ml pH7.6 0.05M Tris buffer。以 1ml tris-casein buffer 分別加入 25 μl, 50 µl, 75 μl, 100 μl 1.81mg/ml tyrosine 與 20 μl 0.01M CaCl2作為標準品，實驗組每管加入 1ml tris-casein buffer、20 μl 0.01M CaCl2、100 μl 粗酵素液。

在 30℃反應 10 分鐘，加入 2 ml 5% TCA 停止反應，以 2000 rpm 10 min 進行離心。每管取 1ml 上清液加入 2.0ml 0.5M NaOH 混合，再加入 0.1ml Folin-Ciacalteu 試劑，反應 10 分鐘後，測 OD₅₅₀ 。

2.7.2.2 金屬離子對蛋白酶活性影響

將試管加入 1ml tris-casein buffer 與 100 μl 粗酵素液，控制組加入 20 μl ddH2O，實驗組分別加入 20 μl 0.01M CaCl2、0.01M EDTA，

在 55℃反應 15 分鐘。加入 2 ml 5% TCA 停止反應，以 2000 rpm 10 min

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進行離心。每管取 1ml 上清液加入 2.0ml 0.5M NaOH 混合，再加入 0.1ml Folin-Ciacalteu 試劑，反應 10 分鐘後，測 OD550 。

第八節、各分子洋菜酶活性分析 2.8.1 洋菜酶最適反應溫度

將洋菜酶活性調整成 0.1U/ml，依照還原糖酵素活性測定法，分別在 45、50、55、60、65、70、75℃反應 10 分鐘，測還原糖變化量。

2.8.2 洋菜酶熱穩定性

將洋菜酶活性調整成 0.25U/ml，在 60℃分別反應 1 小時、3 小時、

6 小時與 12 小時，依照還原糖酵素活性測定法測定酵素殘存活性。

第九節、水解產物分析 2.9.1 實驗材料

TLC 分解水解產物(Kirimura et. al., 1999) 薄層分析片為 TLC silica gel 60 F254(Merck) 展開劑：

n-butanol acetic acid

ddH2O 組成比例為 2:1:1

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23

呈色劑：

Naphthoresorcinol 0.2g Ethanol 100ml H3PO4 10ml

2.9.2 水解產物分析

配置 0.1% agarose 溶液，取 100μl 加入 0.1U 洋菜酶 10μl 進行反應 12 與 24 小時，得到水解產物。將 silica gel 60 裁剪後用鉛筆畫上起始線，樣本與標準品(新洋菜六糖、新洋菜四糖與新洋菜二糖)取 5μl 用毛細管點上 silica gel 60，用展開劑進行展開，展開劑不能碰到起始線，展到終止線後進行風乾，噴上呈色劑再以 110℃烘乾 10 分鐘，求出 Rf 值，並比對標準品的位置位置。

(33)

24

第三章結果

第一節、洋菜酶活性分析建立 3.1.1 洋菜酶的酵素活性分析建立

圖一為粗洋菜酶的酵素動力學，計算洋菜酶的活性來決定要使用的洋菜糖濃度。當洋菜酶以 agarose 為基質時，得到 V_max= 0.026 μ mole/min、Km=0.201g/L。進行酵素活性測試時，將以 Km的十倍 2g/L 來當成基質的濃度。

3.1.2 發酵液電泳活性染建立

前人研究都是以回收後的蛋白質當電泳對象。以發酵液進行電泳的好處是可以立即知道所生產蛋白質的分子量，不會因回收的誤差造成干擾；也可以因此決定是否要進行回收。反應 2 小時後，80~175kDa 的洋菜酶隱約出現條帶；反應 6 小時後，80~175kDa 以上的洋菜酶有明顯的條帶，而 46kDa 以上的洋菜酶隱約出現條帶；而 8 小時後，

46kDa 的洋菜酶才有明顯的條帶(圖二)。

第二節、蛋白酶分子量酶譜法分析

本實驗製作含 gelatin 的 SDS-PAGE 膠體，蛋白酶會水解膠體裡的 gelatin 使得被水解區域無法被染色，來藉此觀察蛋白酶分子量。

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只有在 0.0385% gelatin(圖三 a)中，83 kDa 區域沒有被染到色，顯示蛋白酶的分子量大約在 83kDa 左右；0.05%(圖三 b)與 0.1%(圖三 c) 並沒有蛋白酶的反應，可能是蛋白酶活性很弱，所以無法分解 gelatin 到肉眼可見。此實驗證實 Alterococcus agarolyticus S3PY 會製造蛋白 酶。

第三節、蛋白酶抑制測試

3.3.1 各種抑制劑對 Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶分子量的變 化

邱世明學長的研究指出 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 可抑制洋菜酶被分解(邱，2011)，而 Roche inhibitor cocktail 沒有效，

本實驗將研究該抑制劑的何種成分能抑制蛋白酶。本實驗依照 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 的抑制特性使用可抑制 Aspartic protease 的 Pepsin A、可抑制金屬蛋白酶的 EDTA、可抑制 Serine protease、Cysteine protease 的 Chymysin(sigma)與 Roche inhibitor cocktail，Chymysin(sigma)與 Roche inhibitor cocktail 的測試是看不同廠牌的抑制劑是否會有影響。

在 4℃的結果中加入各種抑制劑的樣本與控制組在 83kDa 與 175Dka 之間的位置皆有洋菜酶(圖四 a)；在 30℃時，控制組(圖四 b，

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lane 2)、加入 Protease inhibitor cocktail P8465(sigma) (圖四 b，lane 4) 與加入 EDTA (圖四 b，lane 8)的樣本在 83kDa 處才有洋菜酶存在，而且 lane 4 與 lane 8 圖譜一樣，加入其他抑制劑的樣本在 83kDa 處沒有洋菜酶反應。因此確定 EDTA 有抑制蛋白酶的效果。

3.3.2 EDTA 濃度對 Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶分子量的變 化

本實驗將探討 EDTA 能抑制蛋白酶的最低濃度。在 4℃時各加入各濃度 EDTA 的樣本在 83kDa 處都有洋菜酶反應，但加入 0.2 與 0.3M EDTA 的樣本在 47.5kDa 處沒有洋菜酶反應(圖五 a)；在 30℃的結果中，未加 EDTA(圖五 b，Lane 2)與加了 25mM EDTA(圖五 b，Lane 9) 的洋菜酶只有 62kDa 以下的洋菜酶，其餘樣本在 83kDa 處都有洋菜酶反應，這顯示至少要濃度 50mM 以上才可得到大分子量洋菜酶。

由此實驗也可知道 S3PY 蛋白酶在 30℃就有很強的活性。

3.3.3 蛋白酶活性測試

實驗結果(表一)顯示 Ca²⁺ 對 S3PY 蛋白酶活性沒有影響，但 EDTA 會降低蛋白酶活性。

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第四節、培養條件建立

3.4.1 生產時間對洋菜酶活性的影響

此實驗的目的是要觀察錐形瓶發酵結果，決定發酵槽發酵時間。

由實驗結果得知錐形瓶發酵液培養 48 小時的酵素活性與比活性高於培養 36 小時的酵素液(圖六、圖七)。

粗酵素液電泳活性染中(圖八)顯示發酵 36 小時的粗酵素液在 SDS-PAGE 的結果在酵素濃度 50~100mg/ml 中與發酵 48 小時並無太大差距(Lane 2、Lane 3)，但在濃度 25mg/ml 以下時，發酵 48 小時的樣本比發酵 36 小時的樣本活性強(Lane 4、Lane 5)。因此發酵槽發酵時間採用 48 小時。

3.4.2 發酵槽通氣量對產物的影響

本人依照前人的做法進行發酵槽培養(邱，2011)，結果沒有出現大分子量洋菜酶，只有在錐形瓶培養才有出現，兩者差別在於有無通氣，因此進行通氣測試，看是否是通氣量造成影響。

在菌株培養時，通氣量對 12 小時的菌株生長較沒差別。從 24 小時開始差異就很明顯，通氣量 1vvm 的 OD₆₆₀略高於通氣量 0.5 vvm，

在 48 小時後開始下降，而通氣量 0 vvm 的 OD₆₆₀最低(圖九)。

將發酵液進行活性測定後，通氣量 0 vvm 洋菜酶活性最高，再

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來是通氣量 0.5 vvm，而通氣量 1vvm 洋菜酶活性遠低於前兩者(圖十)。

將各通氣量的粗酵素液進行活性染(圖十一)。通氣量 1 vvm(lane 2)時沒有大分子量洋菜酶，產物以 58kDa 以下的洋菜酶為主；通氣量 0.5 vvm(lane 3)時有大分子量洋菜酶，但產物還是以 58kDa 以下的洋菜酶為主，加入 EDTA 的 0.5 vvm 通氣量的樣本(lane 4)在 58kDa 處比沒加 EDTA 的樣本淡，說明 EDTA 有抑制洋菜酶被分解；通氣量 0 vvm(lane 5)的樣本是以 100kDa 的洋菜酶為主。因此發酵槽通氣選擇以 0 vvm 作為發酵條件。

第五節、Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶純化成果 3.5.1 丙酮沉澱

將發酵液分為兩份，分別進行硫酸銨沉澱與丙酮沉澱，再進行 SDS-PAGE 活性染。結果發現兩者的圖譜並無差異，皆可回收到大分子洋菜酶(圖十二)。

比較兩個的回收效率與活性，由表二可知丙酮沉澱的回收率只有 42.14%，而硫酸銨沉澱有 94.01%；而比活性硫酸銨沉澱 44.39U/mg，

丙酮沉澱 18.88U/mg；純化倍率硫酸銨沉澱純化 12 倍，而丙酮沉澱只有 5 倍，顯示硫酸銨沉澱效率比丙酮沉澱高。

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3.5.2 離子交換層析法

3.5.2.1 通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液

以通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液進行離子交換層析，將得到的產物做活性測試，有三個區域活性較高，第 I 組：第 8~44 管、第 II 組：

第 81~94 管、第 III 組：第 131~165 管(圖十三)。

收集後進行 SDS-PAGE 活性染(圖十四)，第 I 組(lane 3)以 58kDa 洋菜酶為主，58kDa 下還有洋菜酶，1M NaCl 濃度在 0%時會被沖提下來；第 II 組(lane 4)以 46kDa 洋菜酶為主，58kDa 洋菜酶有部分出現，大約 NaCl 濃度在 11~18%以上時會被沖提下來；第 III 組(lane 5) 有 80kDa 以上的洋菜酶反應，以及 58、32kDa 洋菜酶，大約 NaCl 濃度在 50%以上時會被沖提下來。

3.5.2.2 通氣 1 vvm 發酵槽粗酵素液

以通氣 1 vvm 發酵槽粗酵素液進行離子交換層析，將得到的產物做活性測試，有兩個區域活性較高，第 I 組：第 19~55 管、第 II 組：

第 153~171 管(圖十五)。

收集後進行 SDS-PAGE 活性染(圖十六)，通氣 1 vvm 第 I 組(lane 5)在 46kDa 與 58kDa 之間有洋菜酶反應，1M NaCl 濃度在 0%時會被沖提下來；通氣 1 vvm 第 II 組(lane 6)在 58、46 與 32kDa 區域有洋菜

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30

酶，大約 1M NaCl 濃度在 50~60%時會被沖提下來。由於第 I 組因為活性比較弱，所以在活性染上十分模糊。

將通氣 1 vvm 發酵槽粗酵素液離子純化兩組產物和不通氣發酵槽的離子交換產物比較(圖十七)，通氣 1 vvm 第 I 組濃縮(lane 2)與不通氣的第 I 組(lane 4)的圖譜類似，在 46kDa 與 58kDa 之間有洋菜酶條帶，兩者行走距離一致，只是通氣 1 vvm 第 I 組在 46kDa 附近比位通氣樣本多一個調帶，而通氣 1 vvm 第 II 組(lane 3)在 58kDa 附近行走距離比第 I 組上面一點。與蛋白質標準品相對位置對照，計算出通氣 1 vvm 第 I 組有 53 與 46kDa 洋菜酶；通氣 1 vvm 第 II 組有 56、46 和 35kDa 洋菜酶；通氣 0 vvm 第 I 組有 53 kDa 洋菜酶。通氣與不通氣的第 I 組的 53 kDa 洋菜酶皆為在 0% NaCl 沖提下來，可能是相同產物。

3.5.3 膠體過濾法

3.5.3.1 GE Sephacryl S-100 HR 膠體過濾

將通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液進行離子交換層析得到的產物第 III 組使用 GE Sephacryl S-100 HR 進行膠體過濾後，進行活性測定得到兩個區域(圖十八)。第 I 組：第 28~52 管、第 II 組：第 78~114 管。

SDS-PAGE 圖譜結果顯現第 I 組活性以 58~80kDa 以上的洋菜酶為主

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(圖十九，lane 6)；第 II 組活性以 32~58kDa 為主(圖十九，lane 7)。

3.5.3.2 Toyopearl HW55f 膠體過濾

將通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液進行離子交換層析得到的產物第 III 組使用 Toyopearl HW55f 進行膠體過濾後，得到四個活性區域(圖二十)，第 I 組：第 27~37 管、第 II 組：第 41~55 管、第 III 組：第 71~79 管、第 IV 組：第 80~97 管。四組調成相同活性進行 SDS-PAGE 活性染，四個區域的圖譜都一樣(圖二十一，lane4~7)，皆為 58~80kDa 的洋菜酶，顯示洋菜酶沒有分離。

第六節、洋菜酶定性結果 3.6.1 最適反應溫度

本實驗以 45~75℃為實驗溫度與洋菜糖反應，測試粗洋菜酶最適反應溫度。結果顯示粗洋菜酶活性從 45℃開始上升，到 60℃活性最高，然後從 60℃以上開始酵素活性開始下降，65℃活性剩下 75%，

70℃就只剩下 30%(圖二十二)。因此以 60℃為熱安定測試溫度。

3.6.2 熱安定測試

圖二十三為洋菜酶熱安定測式的結果，洋菜酶的活性隨著加熱時間增加而下降。通氣 0 vvm 的發酵槽粗洋菜酶經 60℃處理一小時

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後活性降至 50%；三小時後剩下 35%，六小時後剩下 24%，十二小時後剩下 17%。通氣 1 vvm 發酵槽粗洋菜酶經 60℃處理一小時後活性降至 36%，三小時後活性剩下 29%，六小時後剩下 24%，十二小時後剩下 15%。錐形瓶粗洋菜酶經 60℃處理一小時後活性降至 64%，

三小時後活性還有 52%，六小時後剩下 38%，十二小時後剩下 20%，

顯示不通氣的培養方式讓酵素熱穩定性增加。

通氣 0 vvm 的發酵槽粗洋菜酶進行離子交換層析得到三組產物：

第 I 組 58kDa 洋菜酶 60℃處理一小時後活性維持在 99%，處理三與六小時後活性還有 90%以上，12 小時後還有 80%的活性。第 II 組洋菜酶 60℃處理一小時後活性剩下 70%，三小時後活性還有 50%，六小時後剩下 49%，十二小時後剩下 43%。第 III 組洋菜酶 60℃處理一與三小時後，活性只剩約 14%，六小時後活性只有 1%，十二小時後完全失活。三組中第 I 組有很高的耐熱性。

通氣 0 vvm 的發酵槽第 III 組離子交換層析產物進行 Hw55f 膠體過濾的洋菜酶 60℃處理一小時後活性降至 26%，三小時後活性還有 12%，六小時後只剩 3%，十二小時後完全失活。

通氣 1 vvm 發酵槽粗酵素液進行離子交換層析得到兩組產物：

第 I 組洋菜酶經 60℃處理一小時後活性殘留 80%，三小時與六小時後分別還有 70 與 60%，十二小時後活性剩下 40%；第 II 組經 60℃處

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理一小時後活性降至 36%，三小時後活性不到 10%，十二小時後完全失活。

第七節、水解產物分析

3.7.1 通氣 0 vvm 發酵槽酵素液水解產物分析

將各洋菜酶純化酵素進行洋菜糖水解 12 小時後，每組產物皆有新洋菜八糖、六糖與四糖。不通氣洋菜酶粗酵素液(圖二十四 a ， lane 2)、離子交換層析第 III 組(圖二十四 a ，lane 5)與 GE Sephacryl S-100 HR 膠體過濾層析產物第 I 組(圖二十四 a ，lane 6)在新洋菜二糖對應位置有些微的藍點。24 小時後洋菜酶粗酵素液(圖二十四 b，

lane 2)、離子交換層析第 III 組(圖二十四 b，lane 5)、GE Sephacryl S-100 HR 膠體過濾層析產物第 I 組(圖二十四 b，lane 6)與其第 II 組(圖二十四 b，lane 7)在新洋菜二糖對應位置的藍點比反應 12 小時的樣本明顯。

離子交換層析第 I 組 12 小時後有新洋菜八糖的藍點(圖二十四 a，

lane 3)，24 小時後沒有新洋菜八糖的藍點(圖二十四 b，lane 3)，產物還是新洋菜六糖與四糖，但沒有新洋菜雙糖，因此判斷離子交換層析第 I 組洋菜酶以新洋菜八糖為基質，產物是新洋菜四糖。

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3.7.2 通氣 1 vvm 發酵槽酵素液水解產物分析

將各洋菜酶純化酵素水解洋菜糖後，12 小時後粗酵素液(圖二十五 a，lane 3)的產物有主要是新洋菜六糖與八糖，四糖、十糖與十糖以上有比較淡的反應，24 小時後(圖二十五 b，lane 3)的產物只有新洋菜四糖與六糖；離子交換層析第 I 組 12 與 24 小時後的產物是六糖與四糖(圖二十五，lane 4)；離子交換層析第 II 組 12 與 24 小時後的主要產物是四糖和六糖，二糖有比較淡的反應(圖二十五，lane 5)。

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第四章討論

第一節、Alterococcus agarolyticus S3PY 蛋白酶的抑制測試

Alterococcus agarolyticus S3PY 的洋菜酶會被分解成小分子量的 洋菜酶，邱世明學長將 SDS-PAGE 上的蛋白質條帶切割下來分析。

發現 83kDa 條帶處會形成 3 個分子量不同的洋菜酶，認為有蛋白酶 在切割(邱，2011)。本實驗由酶譜法測得 Alterococcus agarolyticus S3PY 生產的蛋白酶分子量為 83kDa，證實他的假設。在 Jorge Vera 的研究中，Pseudoalteromonas antarctica strain N-1 會製造蛋白酶分解 其洋菜酶，使導致其洋菜酶分子量短於基因序列的分子量(Vera et al, 1998)。

本實驗證實 EDTA 可以抑制蛋白酶活性，而且 EDTA 價格比 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 低廉，可在工業生產時降低成本。從文獻(Diermayr et al，1987)得知 EDTA 為金屬離子螫合劑，會提供電子對與金屬離子形成配體，使金屬蛋白酶得不到金屬離子而失 去活性，因此判斷 Alterococcus agarolyticus S3PY 屬於金屬蛋白酶，

目前實驗結果確定 Ca²⁺不會影響蛋白酶活性。

把加入 Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8465 與 EDTA 的樣本與控制組比較。控制組在 83 與 175kDa 處有洋菜酶，加了 Protease

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inhibitor cocktail, Sigma, P8465 與 EDTA 後變成在 83kDa 處以及與 62kD 處才有洋菜酶，但是三種樣本 62kDa 以下的洋菜酶位置皆一樣。

原因可能是 EDTA 改變大分子洋菜酶的形狀，導致電泳時速度較快，

所以會到比較下面處。

蛋白酶分子量與欲收集之洋菜酶分子量接近，因此不能使用膠體過濾法分離。酶譜法只有 0.0385% gelatin gel 有蛋白酶反應，0.05%

gelatin gel 與 0.1% gelatin gel 沒有，顯示 Alterococcus agarolyticus S3PY 蛋白酶活性很弱。

第二節、Alterococcus agarolyticus S3PY 培養

實驗結果發現用不通氣的培養方式才會得到大分子量洋菜酶，而且不通氣的洋菜酶活性比通氣量 0.5 vvm 與通氣量 1 vvm 高；通氣量 0.5 vvm 的產物有 80kDa 的洋菜酶，但產物還是以 58kDa 的洋菜酶為主，硫酸銨沉澱過程中加入 EDTA 後可以更清楚看到 80kDa 以上的洋菜酶；通氣 1 vvm 的產物沒有大分子量洋菜酶。另外在純化過程中加 EDTA 也可抑制洋菜酶被蛋白酶分解。文獻(楊，2011)指出提升通氣量可使洋菜酶活性增強，也有文獻指出提升通氣量可提升酵素活性 (林，2004、高，2009)。本研究不通氣菌生長較差但洋菜酶活性較高，

其原因值得進一步探討。

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第三節、Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶純化

丙酮沉澱可以得到和硫酸銨沉澱一樣的洋菜酶，但是回收率比硫酸銨沉澱差。不過丙酮的優點是純化過程可以比硫酸銨省去很多時間與實驗步驟，而且丙酮還可以回收再利用，在工業生產時可以減少成本。

蘇家彥學長使用 Toyopearl DEAE-650M 膠體進行離子交換層析，

得到五個活性區，分別為 39kDa、未完全純化的 128kDa、55kDa 與 55kDa 混雜的兩個區域(蘇，2005)。本實驗使用 Toyopearl QAE-550C 膠體進行離子交換層析，通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液得到三個活性區域。第一區與第二區分別以 53kDa 與 46kDa 洋菜酶為主第三區有，

80kDa 以上的洋菜酶與 58kDa、46kDa、32kDa 洋菜酶混雜。蘇家彥學長大約在 30~40% NaCl 濃度得到大分子洋菜酶，本實驗在 50%

NaCl 濃度得到大分子洋菜酶的原因可能是 Toyopearl DEAE-650M 膠體屬於弱陰離子交換樹脂，與大分子洋菜酶結合力弱，導致洋菜酶很快就被沖下來；Toyopearl QAE-550C 膠體屬於強陰離子交換樹脂，與大分子洋菜酶結合力強，得提高 NaCl 的濃度才能沖提下來。

當使用通氣 1 vvm 的粗洋菜酶進行 ToyopearlQAE-550C 膠體進行離子交換層析時，得到兩個活性區域，第一區為 53 與 46kDa 與洋菜

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酶，在 0% NaCl 濃度沖提下來；第二區為 56kDa、46kDa 與 35kDa 洋菜酶，以 50~60% 1M NaCl 沖提下來。在蘇家彥的實驗中(蘇，2005)，

他以 60%以上的 NaCl 濃度沖提也得到 55kDa、46kDa 與 39kDa 洋菜酶，跟本實驗結果一樣，但是他的純化實驗並沒有在 0% NaCl 濃度得到任何洋菜酶，可能原因是本實驗在整個純化過程有加入 EDTA 抑制蛋白酶作用，而他的實驗沒有加入 EDTA，導致 0% NaCl 時洋菜酶被蛋白酶分解。

顏嘉怡學姐的報告(顏，2002)中有提到菌株 S3PY 洋菜酶有八種

－175、89、82、70、58、50、46、40kDa，本實驗純化出耐熱的 53kDa 洋菜酶可能就是她的 50kDa 洋菜酶。

本實驗使用 Sephacryl S-100 HR 與 Toyopearl HW55F 兩種膠體對通氣 0 vvm 發酵槽粗酵素液的離子交換層析產物第 III 組進行膠體過濾。Sephacryl S-100 HR 膠體得到的結果是有兩個活性區域，第一個區域是 58~80kDa；第二個區域為 32~58kDa，顯示 58~80kDa 的洋菜酶沒有進入膠體，直接流出；Toyopearl HW55F 膠體得到的結果是有四個活性區域，但四個活性的活性染圖譜皆為 58~80kDa，顯示洋菜酶有流進膠體，但沒有分開。Toyopearl HW55F 膠體第一與第二個小波峰可能是膠體填充時有氣泡造成縫隙，導致樣本很快就流出來。

Sephacryl S-100 HR 膠體用於 1~100kDa 的分子，而 Toyopearl HW55F

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膠體用於 1~700kDa 的分子。所以要分開離出 80kDa 的洋菜酶，可能要使用分離範圍在兩者之間的膠體，例如 Sephacryl S-200 HR。

第四節、Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶定性

將通氣 0 vvm 發酵槽粗細酵素液離子交換層析產物第 I 組得到的 53kDa 洋菜酶熱處理 1 小時活性還有 99%，12 小時後活性還有 80%

以上，該酵素擁有熱穩定性。這和蘇家彥學長的結果有出入(蘇，2005)，

他的報告指出 55kDa 洋菜酶熱穩定性差，他的 55kDa 洋菜酶是以 60%

以上濃度的 NaCl 沖提下來。本實驗離子交換層析用 0%與 50%兩種 NaCl 濃度進行沖提時，皆可得到五十多 kDa 的洋菜酶，因此假設有兩種相同分子量的洋菜酶。

當使用通氣 1 vvm 發酵槽粗細酵素液純化後的產物進行熱穩定測試後，第 I 組洋菜酶 1 小時活性還有 80%，12 小時後活性還有 40%；

第 II 組 55kDa 混雜的洋菜酶 1 小時活性只剩下 32%，三小時後不到 10%，12 小時後活性還有完全失活，此洋菜酶是以 50~60%的 NaCl 沖提下來，與蘇家彥學長的實驗結果一樣(蘇，2005)。

通氣組與不通氣組離子交換第 I 區熱穩定性都很高，兩者活性染圖譜都有 53kDa 洋菜酶，兩者差別在通氣組離子交換第 I 區比不通氣組離子交換第 I 區在 46kDa 處多一條條帶，導致在相同活性中通氣組

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離子交換第 I 區沒有不通氣組離子交換第 I 區純，所以活性通氣組離子交換第 I 區熱穩定性比不通氣組離子交換第 I 區差。這說明耐熱的 53kDa 洋菜酶發酵時是否通氣都會出現，只是不通氣的環境下得到的純度會比通氣的環境高。

第五節、水解產物分析

本實驗進行 12 小時洋菜酶水解洋菜糖後，只有不通氣洋菜酶粗酵素液、其離子交換層析第 III 組與 GE Sephacryl S-100 HR 膠體過濾層析產物第 I 組在新洋菜二糖對應位置有藍點。這些樣本皆有 80kDa 的洋菜酶，與邱世明學長的結果吻合(邱，2011)，因此判斷 80kDa 洋菜酶可以製造新洋菜二糖。GE Sephacryl S-100 HR 膠體過濾層析產物第 II 組在 24 小時後也在新洋菜二糖處對應出藍點，原因可能是該樣本也有 80kDa 洋菜酶，只是活性較弱，或是 32kDa 洋菜酶。離子交換層析第 I 組洋菜酶在 12 小時後有新洋菜八糖的藍點，24 小時後藍點卻消失了，證實它可以分解新洋菜八糖。

在通氣組樣本中，離子交換層析第二組在新洋菜二糖處有藍點，

在蘇家彥與邱士明學長的報告中，32kDa 的洋菜酶會水解新洋菜六糖、

八糖產生新洋菜二糖(蘇，2005；邱，2011)，該樣本有 32kDa 的洋菜酶，所以會產生新洋菜二糖。

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第五章參考文獻

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(57)

48

圖一、洋菜酶的 Enzyme kinetic

將洋菜酶與不同濃度基質agarose反應，將反應速率隨產物濃度

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

0 0.5 1 1.5 2

速率umol/min

基質濃度(g/L)

Michaelis-Menten 方程式

^Vmax=0.026 K_m=0.201

0 20 40 60 80 100 120

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1/V

1/S

Lineweaver-Burk plot

K_m=0.201

(58)

49

圖二、以發酵液進行 SDS-PAGE 電泳活性染

取多份20μl的發酵液進行SDS-PAGE，將SDS-PAGE膠體切割後分別與0.5%

agarose膠體反應2、6、8小時，滴上碘液後觀察agarase分布結果。

(59)

50

圖三、運用含 gelatin 的 SDS-PAGE 膠體觀察蛋白酶分子量：(a). 0.0385% gelatin gel, (b). 0.05% gelatin gel, (c). 0.1% gelatin gel； Lane 1. Prestained protein marker P7708S, Lane 2. 洋菜酶粗酵素液 0.025g/ml, Lane 3. 洋菜酶粗酵素液 0.025g/ml + Protease inhibitor cocktail P8465, Lane 4. 洋菜酶粗酵素液 0.025g/ml + 0.1M EDTA

(60)

51

圖四、在不同溫度下，各種抑制劑對 Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶分子 量的變化：(a).4℃培養、(b). 30℃培養。

Lane 1. Prestained protein marker P7708S Lane 2. Agarase(控制組)

Lane 3. Agarase(未做任何處理)

Lane 4. Agarase + Protease inhibitor cocktail P8465(sigma) Lane 5. Agarase + pepsin A

Lane 6. Agarase + chymysin

Lane 7. Agarase + Roche inhibitor Lane 8. Agarase + EDTA 0.1M

(61)

52

圖五、在不同溫度下，不同濃度 EDTA 對 Alterococcus agarolyticus S3PY 洋菜酶 分子量的變化：(a).4℃培養、(b). 30℃培養。

Lane 1. Prestained protein marker P7708S Lane 2. Agarase(控制組)

Lane 3. Agarase(未做任何處理)

Lane 4. Agarase + Protease inhibitor cocktail P8465 Lane 5. Agarase + EDTA 0.3M

Lane 6. Agarase + EDTA 0.2M Lane 7. Agarase + EDTA 0.1M Lane 8. Agarase + EDTA 50mM Lane 9. Agarase + EDTA 25mM

(62)

53

圖六、發酵時間對 Alterococcus agarolyticus S3PY 粗洋菜酶活性的影響

圖七、發酵時間對 Alterococcus agarolyticus S3PY 粗洋菜酶比活性的影響

0 1 2 3 4 5 6 7

0 1 2 3 4 5

粗酵素活性(Unit/g)

酵素濃度(mg/ml)

發酵時間對粗酵素液活性的影響

培養36hr 培養48hr

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

0 1 2 3 4 5

酵素比活性(Unit/mg)

酵素濃度(mg/ml)

發酵時間對比活性的影響

培養36hr 培養48hr

(63)

54

圖八、在不同發酵時間下，Alterococcus agarolyticus S3PY洋菜酶粗酵素液分子量 的變化：

Lane 1. Prestained protein marker P7708S、Lane 2. 酵素濃度100mg/ml、Lane 3. 酵素濃度50mg/ml、Lane 4. 酵素濃度25mg/ml、Lane 5. 酵素濃度12.5mg/ml

(64)

55

圖九、通氣量對 Alterococcus agarolyticus S3PY 菌株生長的影響

將Alterococcus agarolyticus S3PY進行0vvm、0.5vvm與1vvm三種通氣量培養，

測OD660觀察菌株生長隨時間狀況

圖十、通氣量對 Alterococcus agarolyticus S3PY 發酵液活性的影響

將Alterococcus agarolyticus S3PY進行0vvm、0.5vvm與1vvm三種通氣量培 養，將發酵液進行酵素活性測試，測OD450觀察發酵液活性隨時間的變化

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 12 24 36 48 60 72 84

OD660

培養時間(h)

Alterococcus agarolyticus S3PY菌株培養

通氣(0 vvm) 通氣(0.5 vvm) 通氣(1vvm)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0 12 24 36 48 60 72 84

發酵液活性(U/ml)

培養時間(hr)

Alterococcus agarolyticus S3PY發酵槽發酵液活 性

通氣量(0 vvm) 通氣量(0.5 vvm) 通氣量(1 vvm)

(65)

56

圖十一、發酵槽在不同的通氣條件下培養的產物：

Lane 1. Prestained protein marker P7712S、Lane 2. 通氣量 1 vvm、Lane3. 通氣量 0.5 vvm、Lane 4. 通氣量 0.5 vmm 加 0.05M EDTA、Lane 5. 通氣量 0 vvm 將 4 組樣本進行 SDS-PAGE 活性染，觀察不同通氣量中洋菜酶的分布

(66)

57

圖十二、丙酮沉澱與硫酸銨沉澱洋菜酶比較：

Lane 1. Prestained protein marker P7712S、Lane 2. 硫酸銨沉澱、Lane3. 丙酮沉澱。

將500ml錐形瓶酵素液分成250ml，分別進行硫酸銨沉澱與丙酮沉澱，再進行SDS-PAGE活性染，比較兩個沉澱效果。

(67)

58

圖十三、菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 粗洋菜酶(通氣 0 vvm)使用 Toyoperal QAE-550C 膠體進行離子交換層析，將層析產物做 OD280與酵素活性測定。

以每分鐘 0.5ml 的流速每管收集 5ml。第 60~240 管拉 NaCl 濃度梯度，由 0%

拉到 100% 1M NaCl，240 管以後持續以 1M NaCl 洗，共回收 300 管。

依據活性測定結果，將第I組：第8~44管、第II組：第81~94管、第III組：第 131~165管回收

圖十四、離子交換層析產物 SDS-PAGE 活性染測定。

1. Prestained protein marker P7712S、2. 硫酸銨沉澱後的粗酵素液(通氣 0 vvm)、

3. 離子交換層析第 I 組(8~44 管)、4. 離子交換層析第 II 組(81~94 管)、5. 離子交換層析第 III 組(131~165 管)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

0 50 100 150 200 250 300

管數

OD280

回收酵素液的活性(u/ml)

1M NaCl梯度濃度 (0~100%)

III

I

II

(68)

59

圖十五、菌株 Alterococcus agarolyticus S3PY 粗洋菜酶(通氣 1 vvm)使用 Toyoperal QAE-550C 膠體進行離子交換層析，將層析產物做 OD280與酵素活性測定。

以每分鐘 0.5ml 的流速每管收集 5ml。第 60~240 管拉 NaCl 濃度梯度，由 0%

拉到 100% 1M NaCl，240 管以後持續以 1M NaCl 洗，共回收 300 管。依據活性測定結果，活性最高的為第 I 組：第 19~55 管、第 II 組：第 153~171 管

圖十六、粗洋菜酶(通氣 1 vvm)離子交換層析產物 SDS-PAGE 活性染測定。1.

Prestained protein marker P7712S、2. 發酵槽粗酵素液(通氣 1 vvm)、3. 離子交換層析第 I 組、4. 離子交換層析第 II 組

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

0 50 100 150 200 250 300

酵素液活性U/ml

管數

回收酵素液的活性(u/ml)

1M NaCl梯度濃度 (0~100%)

(69)

60

圖十七、離子交換層析產物 SDS-PAGE 活性染測定，活性染反應 1hr，樣本活性調成 1 U/ml。1. Prestained protein marker P7712S、2. 離子交換層析第 I 組(通氣 1 vvm，濃縮後)、3. 離子交換層析第 II 組(通氣 1 vvm)、4. 離子交換層析第 I 組(通氣 0 vvm)

Alterococcus agarolyticus S3PY 耐熱大分子洋菜酶純化與定性

Alterococcus agarolyticus S3PY 耐熱大分子洋菜酶純化與定性

摘要

Abstract

目錄

第一章 前言

Pseudoalteromonas、Vibrio(Sugano et al, 1993)、 Streptomyces、

Agarivorans、Alteromonas、Cytophaga(Van et al, 1974)和 Bacillus 等

Bacillus sp. BI-3(Jiang Li et al, 2014)、Alterococcus agarolyticus

第二章 材料與方法

agarolyticus S3PY，接 300ml 菌液至發酵槽，以 45℃、200rpm 培養

第三章 結果

第四章 討論

第五章 參考文獻

Penicillium chrysogenum through optimization of environmental

Microbulbifer sp. SD-1. Fisheries and Aquatic Sciences. 14(3), 186-191.

Enzymes:Tools and Targets. Sterchi E, Stoker W (Eds.), Springer-Verlag,

Michaelis-Menten 方程式

Lineweaver-Burk plot

發酵時間對粗酵素液活性的影響

發酵時間對比活性的影響

Alterococcus agarolyticus S3PY菌株培養

第一章前言

第二章材料與方法

第三章結果

第四章討論

第五章參考文獻