BaculoDirect - pENTR/SD/D-TOPO - 人類海藻糖水解酶重組蛋白之表達

將 hTreH1 基因從 pGEMT 以及 hTreH2 基因從 pGAPZαC 以 PCR 的方式放大。得到 pENTR/SD/D-TOPO-hTreH1 (請參考圖十五) 和 pENTR-SD-D/TOPO-hTreH2 (請參考圖十六) 兩種質體。並轉型至 one shot TOP10 E.coli 細胞內，做為保存。昆蟲細胞表達出來的

transfection control plasmid 共轉染到 sf9 細胞中當成實驗的控制組 Gbiosciences Insect Cell –PE LB 破菌緩衝液處理細胞，跑 SDS-PAGE 分析，不管是 hTreH1 還是 hTreH2 都以不可溶的形式表達在細胞 pellet 中 (圖二十二 A、 B、 C)。

0.05 % N-lauroyl sarcosine 的 20 mM sodium phosphate buffer 回溶內聚體中被不可溶蛋白包覆住的可溶蛋白，在添加 0.2 % 的 N-lauroyl

四、 hTreH1 酵素受質專一性與 Validamycin A 的抑制實驗 (一)、 hTreH1 酵素受質專一性

依據方法十三、(一) 進行 hTreH1 酵素受質專一性，人類海藻糖水解酶在不同的受質反應 60 分鐘下，海藻糖在反應後全部消耗完，

轉成葡萄糖，而其他雙糖包括麥芽糖、蔗糖和乳糖，反應後葡萄糖生成量明顯少於受質海藻糖所生成的葡萄糖量 (圖二十七)。

(二)、 hTreH1 與 Validamycin A 的反應

依據方法十三、(二) 進行 Validamycin A 對人類海藻糖水解酶活性的抑制影響，結果顯示隨著 Validamycin A 的濃度增加，其人類海藻糖水解酶活性逐漸下降，當 Validamycin A 濃度從 20 nM 提升至 20000 nM 時，其抑制率由 17.60 % 上升至 100 % (圖二十八)，其 IC50 為 105.41 nM。

們的目標蛋白，因此我們希望可以藉由換置不同 P. pastoris 的宿主

sarcosine 中可溶蛋白的量有提昇，但是活性測試上顯示其為不具功

Deoxynojirimycin、 Validamycins、 Validoxylamines、 Trehazolin、

Salbostatin、 Calystegin B4 目前已經被證實對真菌、昆蟲、線蟲海藻糖水解酶是有效的抑制劑。而本實驗室黃胤榮學長曾進行

Validamycin A 對豬腎海藻糖水解酶活性的抑制影響，其實驗發現隨著 Validamycin A 的濃度增加，其豬腎海藻糖水解酶活性亦逐漸下降，其 IC50 為 62.74 nM (酵素量為 435 ng)。因此我們以此已知的海藻糖水解酶抑制劑 Validamycin A 進行抑制劑實驗，結果發現隨著

Validamycin A 的濃度增加，其人類海藻糖水解酶活性逐漸下降，當 Validamycin A 由 20 nM 增加至 20000 nM 時，其抑制率由 17.60 % 上升至 100 %，其 IC₅₀ 為 105.41 nM (酵素量為 20 ng)，由於本實驗所使用的酵素量為豬腎海藻糖水解酶 1/20 以下，因此顯示 Validamycin A 對人類海藻糖水解酶的抑制活性高於對豬腎的海藻糖水解酶抑制活性。

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表一、 Primer 設計 (A) E. coli

Forward primer： AAGAAGGAGATATACATATGCTACCCCCACCC TGTGAGAG

Reverse primer： TTGTCGACCCGGGAATTCTTTGAGGTCAGCCG GTCACCAT

(B) BEVS- Bacvector3000

Forward primer： gacgacgacaagATGCTACCCCCACCCTGTGAGAGT G

Reverse primer： CTATGGTGACCGGCTGACCTCAccgggcttctcctc

Forward primer： ccaccatgCTACCCCCACCCTGTGAGAGTG Reverse primer： GACGTCGACTGAGGTCAGCCGGTCACC

(A). 為了在 E. coli 表達 hTreH1 隨機突變所設計的 primer。底線的 是限制酶切位。

(B). 大寫的部分為目標基因，小寫的部分為欲黏合的位置。

(C). 大寫的部分為目標基因，小寫的部分為 entry clone 上拓譜酶辨識的位置，底線的是限制酶切位。

表二、 PCR 加入的成分

Taq DNA polymerase 10X buffer with MgSO

4 1

ddH2O 6.4

Taq DNA polymerase 10X buffer with MgSO

4 5

ddH2O 36.5

Final volume 50

表三、 PCR 條件 (A) E.coli- 第一次 PCR

No. of Cycles Reaction Temperature (℃) Time (mins)

1 Hot-start 92 3

Denature 92 1

Annealing 55 1.5

Extension 72 5

1 Elongation 72 10

1 Save 4 ∞

(B) E.coli- 第二次 PCR

No. of Cycles Reaction Temperature (℃) Time (mins)

1 Hot-start 95 3

Denature 95 0.3

Annealing 62 0.5

Extension 72 2

1 Elongation 72 10

1 Save 4 ∞

No. of Cycles Reaction Temperature (℃) Time (mins)

1 Hot-start 94 5

Denature 94 0.5

Annealing 54~64 0.5

Extension 72 2

1 Elongation 72 5

1 Save 4 ∞

(D) BEVS- BaculoDirect

No. of Cycles Reaction Temperature (℃) Time (mins)

1 Hot-start 94 5

Denature 94 0.5

Annealing 62 0.5

Extension 72 2

1 Elongation 72 5

1 Save 4 ∞

圖一、 hTreH1 and hTreH2 alternative sequences

把兩種 isoforms 的序列仔細的檢查後發現， hTreH gene 表達出 pre-mRNA 發現 alternative splicing，造成 hTreH2 少了一組 exon6，

並使其中一個胺基酸 W 並成了 C。

(A)

(B)

圖二、以 glucose assay 分析在大腸桿菌表達隨機突變 hTreH1 活性以 1 % 隨機突變 hTreH1 基因，接到 pET23a 上在 BL21 (DE3) 表達，取純化後的蛋白反應 2 小時的活性測試。

(A). 突變株 1~40 號的活性。

(B). 突變株 41~80 號的活性。

(WT： wild type； NC： negative control)

圖三、 pGAPZαC-hTreH1 重組質體圖

pGAP 為驅動外源基因轉錄的啟動子， α factor 為一分泌性訊 號序列， hTreH1 為本研究所選用之重組蛋白， Sh ble 為 Zeocin 的 抗性基因， pUC ori 片段為保存於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質 體自行複製的起點。

圖四、 pGAPZαC-hTreH2 重組質體圖

pGAP 為驅動外源基因轉錄的啟動子， α factor 為一分泌性訊 號序列， hTreH2 為本研究所選用之重組蛋白， Sh ble 為 Zeocin 的 抗性基因， pUC ori 片段為保存於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質 體自行複製的起點。此為本實驗室永資陵學姊所構築的質體。

圖五、 pPIC9K-hTreH1 重組質體圖

pAOX 為驅動外源基因轉錄的啟動子， α factor 為一分泌性訊號 序列， hTreH1 為本研究所選用之重組蛋白， bla 為 Amp 的抗性 基因， Tn903 為 Kan 的抗性基因， HIS4 可做為轉型株的篩選。

(A)

(B)

圖六、以 SDS-PAGE 分析 SMD1168/pGAPZαC-hTreH2 表達 hTreH2 蛋白的結果

(A). 於 P. pastoris SMD1168 中表達 3 天和 7 天。

(B). 於 P. pastoris SMD1168 中表達 3 天和 4 天。圖為濃縮 20 倍 的結果

(Lane M： maker； Lane NC： negative control； Lane SMD1168：

host)

(A)

(B)

圖七、以 SDS-PAGE 分析 X33/pGAPZαC-hTreH2、

GS115/pGAPZαC-hTreH2、 KM71/pGAPZαC-hTreH2 表達 hTreH2 蛋白的結果

(A). 於 P. pastoris 的 X33、 GS115、 KM71 表達 3 天，圖為濃縮 20 倍的結果。

(B). 於 P. pastoris 的 X33、 GS115、 KM71 表達 4 天，圖為濃縮 20 倍的結果。

(Lane M： maker； Lane h2： hTreH2； Lane NC： negative control；

Lane X33： host； Lane GS115： host； Lane KM71： host)

圖八、以 SDS-PAGE 分析 SMD1168/pGAPZαC-hTreH1 純化 hTreH1 蛋白的結果

以硫酸銨沉澱方式濃縮蛋白，經透析後純化跑 SDS-PAGE 的結果。

(Lane M： marker； Lane S：濃縮後的 medium； Lane F： flow through； Lane W： wash； Lane R： eluted resin)

圖九、以 SDS-PAGE 分析 GS115/pPIC9K-hTreH1 和 KM71/pPIC9K-hTreH1 表達 hTreH1 蛋白的結果

pPIC9K-hTreH1 於 P. pastoris 的 GS115、 KM71 表達 3 天 (Lane M： maker； Lane 1： clone1； Lane 2： clone2； Lane 3：

clone3； Lane NC： host)

(A)

(B)

圖十、以 SDS-PAGE 分析 GS115/pPIC9K-hTreH1 和

KM71/pPIC9K-hTreH1 表達 hTreH 後，檢測細胞 pellet 的結果 (A). 於 P. pastoris GS115 表達 hTreH1 3 天，取 pellet 破菌以

SDS-PAGE 分析

(B). 於 P. pastoris KM71 表達 hTreH1 3 天，取 pellet 破菌以 SDS-PAGE 分析

(Lane M： marker； Lane S： supernatant； Lane P： pellet)

圖十一、以 glucose assay 分析 SMD1168/pGAPZαC-hTreH2 的活性 以 glucose assay 分析 hTreH2 於 P. pastoris SMD1168 中表達 3 天後的活性。培養液加入受質，反應總體積為 50 μL 受質海藻糖終濃度為 4 % ，作用 0、 2、 6 小時後測活性。圖為濃縮 20 倍的結果。

(SMD1168： host； NC： negative control)

(A)

(B)

(C)

圖十二、以 HPLC 分析 SMD1168/pGAPZαC-hTreH2 的活性培養液加入受質，反應總體積為 50 μL 受質海藻糖終濃度為 4

% ，作用 0、 2、 6 和 12 小時後測活性。圖為濃縮 20 倍的結果。

(A). 分析 hTreH2 於 P. pastoris SMD1168 中表達 3 天後的活性。

(B). 分析 hTreH2 於 P. pastoris SMD1168 中表達 4 天後的活性。

(SMD1168： host； NC： negative control) (C). 圖 A 於 HPLC 的圖譜。

圖十三、 pTriEX-EK/LIC-hTreH1 重組質體圖

CMV、T7、p10 為驅動外源基因轉錄的啟動子， IgM 為一分泌 性訊號序列， hTreH1 為本研究所選用之重組蛋白，bla 為 Amp 的 抗性基因， pUC ori 片段為保存於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質 體自行複製的起點。

圖十四、 pTriEX-EK/LIC-hTreH2 重組質體圖

CMV、T7、p10 為驅動外源基因轉錄的啟動子， IgM 為一分泌 性訊號序列， hTreH2 為本研究所選用之重組蛋白， bla 為 Amp 的 抗性基因， pUC ori 片段為保存於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質 體自行複製的起點。

圖十五、 pENTR/SD/D-TOPO-hTreH1 重組質體圖

attL1 和 attL2 為重組基因的特異位點， hTreH1 為本研究所選 用之重組蛋白， Tn903 為 Kan 的抗性基因， pUC ori 片段為保存 於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質體自行複製的起點。

圖十六、 pENTR/SD/D-TOPO-hTreH2 重組質體圖

attL1 和 attL2 為重組基因的特異位點， hTreH2 為本研究所選 用之重組蛋白， Tn903 為 Kan 的抗性基因， pUC ori 片段為保存 於 E.coli DH5α 細胞內，能使其質體自行複製的起點。

(A)

(B)

(C)

圖十七、以 SDS-PAGE 分析 Bacvector3000 生產目標蛋白的結果。

分析 Bacvector3000 生產的病毒液感染 sf9 在 27℃ 下表達 hTreH1 3 天的結果。

(A). 取培養液、破細胞的上清及 pellet。

(B). 以 Ni column 純化 PC 蛋白之結果。

(C). 以 Ni column 純化 hTreH1 之結果。

(Lane M： maker；Lane PC： plasmid control； Lane m： SFM-900II medium； Lane S： supernatant； Lane P： pellet； Lane F： flow through； Lane W： wash； Lane E： elution； Lane R₀： before purify；

Lane R： eluted resin)

圖十八、檢測 Bacvector3000 生產的 Baculovirus 病毒顆粒含量 Bacvector3000 生產的 Baculovirus 病毒液以 PCR 方式放大 hTreHs 的基因。hTreH1： 1599 bp； hTreH2： 1506 bp

(Lane M： maker； Lane m： SFM-900II medium； Lane PC：

plasmid control； Lane host： sf9 cell line； Lane C： positive control；

Lane h1： hTreH1； Lane h2： hTreH2)

(A)

(B)

圖十九、以 SDS-PAGE 分析在 27℃ 下 sf9 生產 Baculodirect P1~P3 病毒液的結果

(A). 生產 P1~ P2 virus 5 天，取 pellet 破細胞以 SDS-PAGE 分析。

(B). 生產 P3 virus 5 天，取 pellet 破細胞以 SDS-PAGE 分析。

hTreH1： 64 KD； hTreH2： 61 KD

(Lane M： maker； Lane PC： plasmid control； Lane NC： negative control； Lane S： supernatant； Lane P： pellet)

圖二十、以 SDS-PAGE 分析 Baculodirect P3 代的病毒液純化後的結果

將 plasmid control (PC)、 hTreH1、 hTreH2 之 P3 代病毒液通過 Ni column 進行純化。hTreH1： 64 KD； hTreH2： 61 KD

(Lane M： maker；Lane PC： plasmid control； Lane S：

supernatant； Lane F： flow through； Lane W： wash； Lane R0： before purify； Lane R： eluted resin)

(A)

(B)

圖二十一、以 SDS-PAGE 分析不同破菌方式破細胞的差異

以 M.O.I＝ 2.5 於 sf9 在 27℃ 下表達 hTreHs 3 天，以病毒 DNA 當成破菌緩衝液，並用不同破菌方式破細胞以 SDS-PAGE 分析。hTreH1： 64 KD； hTreH2： 61 KD

(A). 用超音波震破細胞。

(B). 放在冰上 30 分鐘破細胞

(Lane M： maker； Lane PC： plasmid control； Lane h1：

hTreH1；Lane h2： hTreH2； Lane S： supernatant； Lane P： pellet)

(A)

(B)

(C)

圖二十二、以 SDS-PAGE 分析不同時間下 BaculoDirect P3 桿狀病

在文檔中人類海藻糖水解酶重組蛋白之表達 (頁 51-0)