pGAPZαC

GS115、 KM71 pPIC9K

BEVS

sf9

pENTR/SD/D-TOPO (一)、大腸桿菌表達系統質體

pET23a 質體大小為 3666 bps，並帶有 T7 promoter、 T7

terminator、 bla 基因 (Ampicillin 的抗性基因)、 6 個 Histidine-tag。

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transfection kit 和 BaculoDirect Baculovirus expression system 來生產 病毒，用以感染 sf9 細胞表達蛋白。

BacVector3000 transfection kit(購自 Novagen)

在昆蟲細胞以共轉染的方式將帶有目標基因的 pTriEX-EK/LIC 換置到修飾過的三切病毒質體上，可得到重組昆蟲桿狀病毒。

pTriEX-EK/LIC 質體大小為 5124 bps，並帶有 T7 promoter、 p10 promoter、 CMV promoter、分泌性訊號序列 IgG、 bla 基因

(Ampicillin 的抗性基因)、 10 個 Histidine-tag。因為具有 T7、 p10、

CMV 依序為大腸桿菌、昆蟲細胞、哺乳細胞等系統的啟動子，因此 可在這三種表達系統中使用。

BaculoDirect Baculovirus expression system (購自 Invitrogen)

另外，我們也使用 BaculoDirect Baculovirus expression system，利 用 Phage λ recombinant in E.coli 的特異性重組位點做為設計，將帶 有目標基因的 Entry clone (pENTR/SD/D-TOPO) 置換到 expression clone 中 (附錄十、附錄十一)， expression clone 帶有 polyhedri promoter，可生產重組昆蟲桿狀病毒，再將重組昆蟲桿狀病毒感染 sf9 細胞，收集含蛋白的細胞 (此套系統為胞內分泌)。

pENTR/SD/D-TOPO 質體大小為 2601 bps，並帶有特異性重組位 點 attL1、 attL2、 Tn903 基因 (Kanamycin 的抗性基因)。

pTriEX-EK/LIC T7、p10、CMV SFM-900II pENTR/SD/D-TOPO 置換後為 polyhedrin SFM-900II 四、質體 DNA 製備

將帶有 pGEMT-hTreH1 以及 pGAPZαC-hTreH2 的 DH5α 分別 接種到 3 ml LB (含有 100 μg/ml Ampicillin) medium 以及 3 ml LLB (含有 25 μg/ml Zeocin) medium 中，隔夜培養，離心 3000 rpm 10 分 鐘，除去上清液留下沉澱菌體，操作 Mini Plus TM Plasmid DNA Extraction System Kit (VIOGENE)，以抽取質體 DNA。

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表二 A)。接著以說明書上的建議進行第一次的 PCR (流程參考表三

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Components Volume (μL)

PCR product 2

dATP (25 mM) 1

DTT (100 mM) 0.5

T4 DNA polymerase (2.5 U/μL)

T4 DNA Polymerase 10X buffer

ddH2O 5.3 expression clone 中，才可生產出重組昆蟲桿狀病毒。Expression clone C 端上有 6 個 Histidine-tag 方便之後使用陰離子交換樹脂 Ni²⁺

resin 進行基因表達後的蛋白質純化。

pENTR/SD/D-TOPO-hTreH1 和 pENTR/SD/D-TOPO-hTreH2 質

體的構築是利用拓譜酶的作用來完成的 (附錄十二) ，整個質體大小

為 4212 bps 和 4119 bps。

首先將李桂禎老師實驗室的林志信學長所建構之

pGEMT-hTreH1 以及 pGAPZαC-hTreH2 以 PCR 的方式放大，

primer 設計 (表一 C) 參考了 pENTR/SD/D-TOPO 說明書中的方

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抽取大量 pENTR/SD/D-TOPO-hTreH1 和

pENTR/SD/D-TOPO-hTreH2 質體，以 TE buffer, pH=8.0 回溶成濃度 約 125 ng/μL，將此建構好的質體稱為 Entry clone。

Components Sample Positive control BaculoDirect linear DNA (a vial) 10 10 pENTR-CAT control (100 ng/μL) -- 1

七、 DNA 定序分析

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phenol/chloroform 法去除雜蛋白，利用酒精沉澱得到高濃度之 linear

DNA，保存於 -20℃ 備用。 pGAPZαC 以限制酵素 AvrII 切成 linear 管，隨後藉由酒精沉澱法收集高濃度之 DNA。經由 phenol/chloroform 法去除蛋白之樣本，加入樣本體積 1/10 的 3 M 醋酸鈉，與 2.5 倍

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Bacvector3000：共轉染 co-transfection 的方法如下：

取 2 ml 約為 2.5 × 10⁵ cell/ml 健康的 sf9 cell 於 T25 flask，放置 1~2 小時待細胞貼到盤上。根據操作說明修改共轉染時各溶液的體 積，以下為修改後加入的體積：

solution A Volume (μL)

pTriEX-EK/LIC-hTreH1/pTriEX-EK/LIC-hTreH2 2 Triple cut virus DNA BacVecor3000 2

SFM-900II medium 6

Final volume 10

solution B Volume (μL)

Nuclease-free Water 8

Insect GeneJuice® Transfection Reagent 2 養液換置成 Grace's Insect Medium, Unsupplemented(without

supplements, FBS, or antibiotics)，放置 15 分鐘待細胞貼到盤上。並將 A、B 兩試劑輕拍混和，在室溫下靜置 25~35 分鐘。

solution A Volume (μL)

Cellfectin ® II Reagent 8

Grace's Insect Medium, Unsupplemented (without supplements, FBS, or antibiotics)

100

solution B Volume (μL)

LR recombination reaction 10

Grace's Insect Medium, Unsupplemented (without supplements, FBS, or antibiotics)

100

將反應好的試劑滴加到 6-well 盤中，置於 27℃ 培養箱 3 小時，

移除轉染的培養液，加入 2 ml 新鮮的 SFM-900II 培養液並加入

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Lysis buffer

Lysis buffer(10 mM Tris-HCl, pH=8.3, 0.45 % tritonX-100, 0.45 % tween-20, 50 mM KCl)

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High titer virus stock 10

Proteinase K (6 mg / ml in water) 1 N-lauroyl sarcosine 0.2 % 回溶內聚體，可以使某些原本被不可溶的蛋 白質包覆的可溶蛋白，慢慢的回溶出來且具有活性 (Peternel et al., 2008)。

因此我們將昆蟲桿狀病毒表達載體系統表達出來的蛋白以

26 液直接利用固定化金屬親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC) 純化；大腸桿菌表達系統和 BaculoDirect 則 需要先破細胞，再將上清過固定化金屬純化管柱。

其條件如下： 1 ml His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 10 ml binding buffer (20 mM sodium phosphate buffer pH=7.0、 0.5M NaCl) 平衡管住，加入蛋白質粗萃取液 5 ml，再以 10 ml binding buffer 洗去雜蛋白，最後加入 10 ml Elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer、 0.5 M NaCl、 0.5 mM imidazole、 pH=7.0)，

將目標蛋白從管柱沖離下來，並收集具有目標蛋白的部分，利用濃縮

1.高效能 96 孔盤型式蛋白質的純化

phosphate buffer、 0.5 M NaCl、 20 mM imidazole、 pH=7.0) 2 ml，

流洗 1 分鐘後，離心 2,000 rpm、 15 秒來移除 binding buffer，將 filtration Plate 置於 collection plate (Promega) 上，並加入 elution buffer (20 mM sodium phosphate buffer、 0.5 M NaCl、 0.5 mM

imidazole、 pH=7.0) 100 μL 於 filtration Plate 的孔內，放在搖晃台上

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十一、 hTreHs 蛋白質分析 (一)、蛋白質電泳

1.蛋白質電泳試劑：

(a) 40 % (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (Bioshop）。 (b) Ammonium persulphate (APS)：10 % (w/v) 溶液。

(c) SDS solution：配置 10 % (w/v) 溶液保存於室溫。

(d) Stacking gel buffer：配置 0.5 M Tris-HCl 溶液 pH=6.8。

(e) Resolving gel buffer：配置 1.5 M Tris-HCl 溶液 pH=8.8。

(f) Tris-glycine electrophoresis buffer：含 0.025 M Tris、0.192 M glycine 與 0.1 % SDS，pH=8.3。

Stacking gel 倒滿並插齒梳，待膠凝固後拔除齒梳，並將玻璃片組從 製膠器上拿出。

4. 5X SDS sample buffer 製備與電泳條件：

(a) 40 % (w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (Bioshop) (b) 25.6 % β-mercaptoethanol

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品 BSA (10 μL) 於 96 孔盤內反應 10 分鐘，使用 ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reader 測定波長 595 nm 吸 光值，製作出標準曲線，再使用同樣的條件測定樣品，代入標準曲線 公式中即可求出蛋白質濃度。

十二、 hTreHs 酵素活性分析

(一)、 HPLC (High-performance liquid chromatography)

於 50 μL 的反應體積中，加入 25 μL hTreHs，添加於 25 μL 8 % 的海藻糖中 (終濃度為 4 %)，於 37℃ 反應實驗所需要的時間。反 應後，以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘終止酵素反應。

而後將樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 20 μL 的樣品以 HPLC；管柱： SUGAR SZ5532；

管柱恆溫箱： 60℃；流速： 1 ml /min；偵測器： RI2000 Refractive index detector；幫浦： SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 acetonitriled ： ddH2O ： formicacid=75 ： 25 ： 1；分析時間： 15

與標準品相同滯留時間下之訊號峰面積帶入上述之標準曲線後，即可

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trehalose、maltose、sucrose、lactose，於 37℃ 反應 60 分鐘，經先 前的實驗中已確定反應時間為此酵素量下的線性範圍內。 別為 0、0.02、0.2、2、20、200、2000、20000 nM Validamycin A (VA)，

於 37℃ 反應 3 小時。經先前的實驗中已確定反應時間為此酵素量 下的線性範圍內。

反應後，以聚合酶連鎖反應器於 95℃ 反應 10 分鐘終止酵素反 應，以 HPLC 分析結果，依照以下公式計算出抑制百分比 (Inhibition,

%) 後，帶入 SigmaPlot 繪圖軟體來計算出 50% 抑制濃度 (IC50, concentration of 50 % inhibition)。

肆、研究結果

一、 hTreHs 基因的分析

hTreH1 和 hTreH2 這兩型的基因在序列上只有 93 個鹼基對不 一樣，經過比對的結果發現這兩型基因是由於 Alternative splicing 的 作用，使得 hTreH2 基因少了一組外顯子，而造成這 93 個鹼基對的

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