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柒、圖及表
圖 一 、pFlag-TC-HepsinhWT 、pFlag-TC-HepsinhR162A
*
、pFlag-TC-HepsinhS353Y*
、 pFlag-TC-HepsinhR162AS353Y**質體示意圖。(*)標記為胺基酸R162A突變 、 (*)
標記為胺基酸S353Y突變、 (**)標記為雙點突變型 (RS) 的Flag-TC-Hepsin 質體。圖二、Flag-TC-Hepsin 質體自動序列定序分析圖，A. pFlag-TC-Hepsin-WT 為野生型。
B. pFlag-TC-Hepsin-R162A 為活化點突變型。C. pFlag-TC-Hepsin-S353Y 為活 性區突變型。D. pFlag-TC-Hepsin-RS 為活化點及活性區雙突變型。
A.
B.
圖三、細胞群落生成能力實驗。將2000 顆細胞種於 6 小格培養皿培養 10 天後細胞 群落生成情形。A. 細胞群落形成的情形。B. 細胞群落形成的效率，計數 6 小格培養皿形成之細胞群落數，以NT:未轉染之 HeLa 細胞數 (680 顆)為 100
%，此為三個實驗組。
圖四、細胞群落生成能力實驗。將20,000 顆 HeLa 細胞與 soft agar 混合種於 6 小格 培養皿培養16 天後形成之細胞群落數。A. 未轉染之 HeLa 細胞，B. WT 細胞，C.
R162A 細胞，D. S353Y 細胞，E. R162AS353Y 細胞。(n=3)
圖五、表現Hepsin 融合蛋白之 HeLa 細胞生長速率實驗。未轉染之 HeLa 細胞之 細胞數每隔24 小時以等比例增加，穩定表現 WT 細胞生長速率降低。
圖六、第34 天老鼠腫瘤的生長情形及腫瘤大小。
圖七、將表現野生型及突變型Hepsin 的 SK-hep1 細胞株於第一天時，以每個 培養皿1000 顆的數量培養，並每四天更換培養基，於第十四天後固定並已結 晶紫染色觀察並照相。(n=3)
圖八、表現 Hepsin 融合蛋白之肝癌細胞株生長速率實驗。未轉染之肝癌 細胞株每隔24 小時以等比例增加，穩定表現 hepsin 會降低細胞生長速率。
圖九、活體內 hepsin 穩定表現 SK-Hep1 細胞株之腫瘤生成能力實驗
A圖：第一次腫瘤生成能力之實驗結果，於第七週時，SK-Hep1/hepsin-mycWT19與SK-Hep1 細胞腫瘤生成能力無差異，p=0.066；
SK-Hep1/hepsin-mycRS40較SK-Hep1 細胞腫瘤生成能力差，p=0.043。
B圖：第二次腫瘤生成能力之實驗結果，於第 11 週時，SK-Hep1/hepsin-mycWT19與SK-Hep1 細胞腫瘤生成能力無差異，p=0.345；
SK-Hep1/hepsin-mycRS40與SK-Hep1 細胞腫瘤生成能力無差異，p=0.053。
A. B.
﹡為 p<0.05
圖十、小量誘導表現 GST-hepsin 融合蛋白 A 圖為 Coomassie blue 染色結果
◆為誘導表現的 GST-hepsin 融合蛋白，大小為 70kDa；
★為誘導表現的 GST 蛋白，大小為 26kDa。
B 圖為西方墨點法結果
1°Ab：mouse anti-GST monoclonal antibody（Zymed）1：10000 稀釋 2°Ab：goat anti-mouse HRP conjugated antibody（Chemicon）1：10000 稀 釋
圖十一、小量表現 mHepsin（SRCR）與 mHepsin(extracellular)基因重組蛋白 A 圖為 mHepsin(SRCR)小量表現之 coomassie blue 染色結果，
★為誘導表現出來的蛋白，1~7 為不同 clone 的菌。
B 圖為 mHepsin(extracellular)小量表現之 coomassie blue 染色結果，
◆為誘導出來的蛋白，1~6 為不同 clone 的菌。
Lane 1 為 Origami B(DE3)pLysS total lysate
圖十二、以自己 pack 的 GSH 親和力管柱純化 GST-hepsin 融合蛋 白之 coomassie blue 染色結果
箭號所指為 GST-hepsin 融合蛋白的位置， 所指為小於 GST-hepsin 大小的蛋白質。
No.1 No.2
No.3 No.4
圖十三、免疫 GST-hepsin 小鼠之血清抗體專一性實驗
No.1~4 分別為不同編號的免疫小鼠。lane1~4 為SK-Hep1/hepsinRS40的細胞 總蛋白量 10μg 2 倍序列稀釋作為抗體偵測的抗原，並以第二次boost後所 採的小鼠血清 1：1000 稀釋偵測。No.2 的C為以anti-hepsin(Cayman)偵測 10μg的SK-Hep1/hepsin-MycRS40的細胞總蛋白量的對照組。箭號所指為 hepsin位置，約為 45 kDa。
圖十四、本實驗室先前利用野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠進行腫瘤細 胞轉移實驗(與中研院陶祕華老師合作)，經尾靜脈注射黑色素瘤細胞(B16F1) 21 天 後，黑色素瘤細胞轉移至肺及肝臟情形(上圖為肺；下圖為肝)。實驗動物為 8-12 週 母鼠。
圖十五、本實驗室先前利用野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠進行癌細胞 轉移實驗(與中研院陶祕華老師合作)，經尾靜脈注射黑色素瘤細胞(B16F1) 21 天後，
黑色素瘤細胞轉移至肺及肝臟數量計數統計。其中基因剔除小鼠腫瘤肝轉移數高於 野生型數十倍(左圖為肺；右圖為肝)。實驗動物為 8-12 週母鼠。
圖十六、本實驗室先前利用野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠進行腫瘤細 胞轉移實驗，經脾臟內植入黑色素瘤細胞(B16F1) 14 天後，黑色素瘤細胞轉移至肝 臟情形。基因剔除小鼠腫瘤肝轉移仍較為嚴重。實驗動物為8-12 週母鼠。
圖十七、小鼠存活率實驗。本實驗室先前利用野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-) 分別以尾靜脈或脾臟注射腫瘤細胞入小鼠體內，記錄觀察小鼠死亡時間。實驗動物為8-12 週母鼠。
.
圖十八、本實驗室先前利用野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠進行肺癌細 胞株細胞轉移實驗(與中研院陶祕華老師合作)，經尾靜脈注射腫瘤細胞(B16F1) 21 天後，腫瘤細胞轉移至肺及肝臟情形(由左至右分別為野生及基因剔除小鼠肝、野生 及基因剔除小鼠肺)，實驗動物為 8-12 週小鼠。
圖十九、本實驗室利用電子順磁共振譜儀(EPR)分析，脾臟內植入黑色素瘤細胞 (B16F1) 8 及 24 小時後，野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠肝臟一氧化氮 生成情形。上圖為EPR分析圖形。若肝臟中具一氧化氮即可測得一氧化氮與注射入 小鼠體內的DETC及硫化鐵標定金屬形成的結合物，在g=2.04 處產生三個波形。下 圖依EPR圖形換算數值比較強度。
圖二十、利用螢光標定腫瘤細胞，分別計數比較脾臟內植入黑色素瘤細胞(B16F1) 8、24 及 72 小時後，野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠肝臟肝臟不同區域 入侵癌細胞的自體凋亡數目。圖中綠色細胞為螢光標定黑色素瘤細胞，紅色細胞則 為螢光染色標定自體凋亡細胞。
表一、利用螢光標定腫瘤細胞，分別計數比較脾臟內植入黑色素瘤細胞(B16F1) 8、
24 及 72 小時後，野生型(Hepsin+/+）及基因剔除(Hepsin-/-)小鼠肝臟肝臟不同區域入 侵癌細胞的自體凋亡數目。所有數值以100 倍視野下計數五個數值總合，每個值各 取4 隻老鼠平均。