EA : Ethyl acetate
圖 65、Fr.C 之分劃流程圖
第三章 藥理試驗方法
第一節 抗過敏、抗發炎作用
一、肥大細胞（mast cell）的去顆粒作用(56)
肥大細胞之製備：大鼠（Sprague-Dawley, 250-300 g）頸部放血 後，將 10ml 含肝素之 Tyrode’s 溶液注入鼠腹腔內，按摩 1-2 分鐘並 取出腹腔液，經 38%牛血清蛋白之 glucose-free Tyrode’s solution 離 心，沉澱細胞經清洗後，懸浮成 1-1.5 × 106 cells/ml，並測定細胞存活 率。
（1）組織胺（histamine）釋放反應之測定(57)
將肥大細胞懸浮液方別與 DMSO 或檢品溶液於 37℃培養三分鐘 後，各別加入 compound 48/80（10 µg/ml）與之作用，經十五分鐘後，
加入冰浴過之 Tyrode’s solution 終止反應，混合液經離心（1000 xg）
十分鐘後，將上清液取出，測其所含之組織胺。利用 o-phthaldehyde 聚合後，以螢光分光光度計在 350/450 nm 處來測量所含之組織胺的 量。
（2）ß-glucuronidase 釋放反應之測定(57)
同 histamine 釋放反應之處理後，將所得含 ß-glucuronidase 之上 清液，利用 phenolphthalein-ß-D-glucuronide 作為受質，以分光光度計 在 550 nm 測量所含之 ß-glucuronidase 之活性。
二、嗜中性白血球（Neutrophils）的去顆粒作用(58)
pentobarbital（60 mg/kg, i.p.）麻醉後，由腹腔動脈抽血，與 dextran 混合靜置，經 Ficoll-hypaque 離心後，使 neutrophil 與其他血液細胞 分離，並在低張溶液（0.05%）除去紅血球，將細胞以包含 0.25% bovine serum albumin 之 saline（1.75%）清洗，並懸浮於 Hank’ balanced salt solution（HBSS）成 2 × 106 cells/ml 其中包含 90-95%之 neutrophils。
（1）ß-glucuronidase 釋放反應之測定(59)
將嗜中性白血球懸浮液分別與 DMSO 或檢品溶液於 37℃培養三 分鐘後，各別加入 fMLP（1 µM）與之作用，經四十五分鐘後，加入 冰浴冷卻過之 Tyrode’s solution 終止反應，混合液經離心（1000 xg）
十分鐘後，將上清液取出，利用上清液中之 ß-glucuronidase 與 phenolphthalein-ß-D-glucuronide 反應後以分光光度計在 550 nm 測量 所含之 ß-glucuronidase 之活性。
（2）lysozyme 釋放反應之測定(60)
同 ß-glucuronidase 釋放反應之處理後，將所得含 lysozyme 之上 清液，利用 Micrococcus lysodeikticus 作為受質，經由分光光度計在 450 nm 測量 lysozyme 之活性。
第二節 抗細胞增殖作用
一、癌細胞的培養
本實驗用的 HL-60 血癌細胞，這些癌細胞平常均培養於含有 10
~ 20%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基，並加入 kanamycin (100
µ
g/ml)，penicillin (50µ
g/ml)，及 streptomycin (50µ
g/ml) 以防細菌污 染。培養於含 5%二氧化碳的細胞培養箱，當培養前及實驗時，會取
出少量癌細胞，再加色素錐藍 (trypan blue)，並於顯微鏡下觀察，確 定細胞之死亡或存活，計算癌細胞總數。取定數的 HL-60 細胞，要 先以 phosphate buffered saline (PBS) 清洗 2 ~ 3 次，才可完全取出，
以做進一步的實驗。
二、MTT proliferation assay(28,29)
將 HL-60 cells (2 × 104)培養於 24-wells 培養皿使最後體積為 1ml/
well；每 well 中加入各種檢體於溫度 37℃、溼度 95%、5% CO2 的培 養箱中培養固定時間之後, 分別取出作 MTT-proliferation assay 實驗。
首先自每 well取出已去除培養基之50
µ
l細胞液置入 96-well plate 中，加入 10µ
l MTT solution 於 37℃培養箱中放置 4 小時。接著用 DMSO (150µ
l/well )溶解細胞中之紫黑色顆粒，最後以 ELISA Reader 於波長 570 nm 的條件下測得 OD570 值，其值與 control OD570求百分 比值為 proliferation (%)。【一】化合物Ⅰ：docosane 1. 白色臘狀
2. TLC：Rf = 0.91 (benzene) 3. EIMS m/z (%)：（圖 5）
310 (M+, 0.3)、203 (2.6)、189 (3.1)、175 (3.2)、155 (3.6)、141 (4.39)、
111 (20.4)、97 (31.5)、85 (35.5)、71 (54.4) 4. IR (KBr) cm-1（圖 6）
2955、2920、2851、1462、1377、1265 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)（圖 3）
0.89 (t, J = 5.9 Hz, 3H)、1.26 (CH2)、1.56 (CH2) 6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)（圖 4）
13.9、19.5、29.5、31.7
【二】化合物Ⅱ：methyl hexadecanoate 1. 油狀物
2. TLC：Rf = 0.64 (benzene) 3. EIMS m/z (%)：（圖 8）
270 (M+, 12.5)、239 (4.3)、227 (7.2)、199 (3.8)、185 (3.9)、171 (3.6)、
157 (1.2)、143 (13.4)、87 (67.5)、74 (100) 4. IR (KBr) cm-1（圖 7）
2925、2856、1744、1242、1173 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 9）
0.87 (m, 3H, H-16)、1.25 (13 × CH2)、1.5~1.7 (m, 2H, H-3)、2.30 (t, J
= 7.62 Hz, 2H, H-2)、3.66 (s, -OCH3) 6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 10）
13.9 (C-16)、22.4~31.7 (13 × CH2)、33.9 (C-2)、51.2 (-OCH3)、174.1 (C = O)
【三】化合物Ⅲ：methyl oleate
1. 黃色油狀物
2. TLC：Rf = 0.75 (benzene) 3.EIMS m/z (%)：（圖 11）
296 (M+, 3.7)、264 (12.2)、222 (6.9)、180 (8.0)、110 (12.9)、97 (27.0)、
83 (27.3)、69 (50.5)、55 (100)
4. IR (KBr) cm-1（圖 12）2924、2859、1740、1462、1246、1173 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 13）
0.89 (t, J = 6.3 Hz, 3H, H-8)、1.28~1.30 (11 × CH2)、1.56 (m, 2H, H-3)、2.01 (m, 4H, H-8 and H-11)、2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H, H-2)、3.67 (s, -OCH3)、5.35 (t, J = 5.3 Hz, 2H, H-9 and H-10)
6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 14）
13.9 (C-18)、22.4~31.7 (13 × CH2)、33.9 (C-2)、51.2 (-OCH3)、129.8 (C-9, C-10)、174.2 (C = O)
【四】化合物Ⅳ：methyl linoleate 1. 淡黃色油狀物
2. TLC：Rf = 0.70 (benzene) 3. EIMS m/z (%)：（圖 15）
294 (M+, 13.2)、263 (7.6)、135 (11.5)、123 (24.2)、109 (34.9)、95 (60.3)、81 (85.2)、67 (100)、55 (76.2)
4. IR (KBr) cm-1（圖 16）
2925、2856、1737、1459、1366、1250、1173 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 17）
0.89 (t, J = 6.5 Hz, 3H, H-18)、1.31 (7 × CH2)、1.62 (m, 2H, H-3)、2.05 (m, 4H, H-8 and H-14)、2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H, H-2)、2.77 (m, 2H, H-11)、3.67 (s, -OCH3)、5.35 (m, 4H, H-9, 10, 12, 13)
6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 18）
13.8 (C-18)、22.3~31.3 (11 × CH2)、33.9 (C-2)、51.2 (-OCH3)、127.7、
127.8、129.8、130.0 (olefinic carbon)、174.2 (C = O)
1. 白色柱狀結晶（chloroform/methanol）
2. m.p.：261-263℃
3. TLC：Rf = 0.38 (benzene) 4. EIMS m/z (%)：（圖 20）
426 (M+, 16.1)、411 (5.8)、341 (4.1)、302 (11.5)、273 (21.9)、246 (15.2)、205 (18.2)、163 (25.1)、123 (60.9)、109 (61.3)、95 (87.2)、
69 (100)
5. IR (KBr) cm-1（圖 19）
2925、2871、1713、1459、1389、1266、1096、1019 6. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 21）
0.73 (s, 3H, H-24)、0.87 (s, 3H, H-25)、0.89 (d, J = 5.1 Hz, 3H, H-23)、0.96 (s, 3H, H-29)、1.01 (s, 6H, H-30,26)、1.05 (s, 3H, H-27)、
1.18 (s, 3H, H-28)、1.22~1.79 (m)、2.23~2.38 (m) 7. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 22）
6.6 (C-23)、14.4 (C-24)、17.7(C-25)、18.0 (C-7)、18.4 (C-26)、20.0 (C-27)、22.0 (C-1)、27.9 (C-20)、29.7 (C-17)、30.3 (C-12)、31.6 (C-29)、31.9 (C-28)、32.2 (C-15)、32.5 (C-21)、34.8 (C-30)、35.1 (C-11)、35.4 (C-19)、35.8 (C-16)、37.2 (C-9)、38.0 (C-13)、39.0 (C-22)、39.4 (C-14)、41.0(C-6)、41.3 (C-2)、41.9 (C-5)、42.6 (C-18)、
52.9 (C-8)、58.0 (C-4)、59.2 (C-10)、212.9 (C-3)
【六】化合物Ⅵ：ß-sitosterol and stigmasterol (2:1)
1. 白色針狀結晶（chloroform/methanol）
2. m.p.：138.5-140℃
3. TLC：Rf = 0.37 (chloroform) 4. EIMS m/z (%)：（圖 25）
414 (M+, 5.4)、412 (M+, 3.6)、271 (2.7)、255 (4.0)、213 (4.9)、159 (7.9)、145 (2.4)、119 (10.3)、105 (16.9)、91 (22.3)、81 (33.8)、69 (49.0)、55 (100)
5. IR (KBr) cm-1（圖 24）
3211、2940、2871、1466、1374、1050 6. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 26）
0.68 (s, 3H, H-18)、0.76~0.94 (m)、0.97 (s, 3H, H-19)、1.01~2.29 (m)、
3.52 (m, 1H, H-3)、5.05 (dd, 1H, J = 15.1, 8.1 Hz, H-22)、5.12 (dd, 1H,
J = 15.1, 8.1 Hz, H-23)、5.35 (d, 1H, J = 4.8 Hz, H-6)
7. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 27）
11.6、11.7 (C-18)、12.0 (C-29)、18.5 (C-21)、18.8 (C-26)、19.2、19.6、
20.8 (C-19, 27, 11)、22.8 (C-28)、24.1 (C-15)、25.2 (C-28)、25.8 (C-23)、28.0、28.7 (C-16)、28.9 (C-25)、31.4 (C-2)、31.7 (C-7, 8)、
33.7 (C-22)、35.9 (C-20)、36.3 (C-10)、37.0 (C-1)、39.5 (C-12)、42.1 (C-4, 13)、45.6 (C-24)、49.9 (C-9)、55.8 (C-17)、56.5 (C-14)、71.6 (C-3)、121.5 (C-6)、129.0 (C-23)、138.1 (C-22)、140.5 (C-5)
1. 綠色固體
2. TLC：Rf = 0.56 (chloroform : ethyl acetate = 5：1) 3. FABMS m/z (rel. int.)：（圖 29）637 [M+H]+
4. IR (KBr) cm-1（圖 30）
3195、2925、2856、1744、1713、1667、1297、1165 5. UV (CHCl3)λmax：（圖 31）
226、294、369、434、526、598、653 6. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 32）
-1.68 (s, -NH) 、0.38 (s, -NH)、1.62 (m, 3H, H-181)、1.82 (t, 3H, J = 7.6 Hz)、2.31 (m, 2H, H-171a、H-172a)、2.62 (m, H, H-172b)、2.98 (m, H, H-171b)、3.40 (s, 3H, H-21)、3.64 (s, 3H, H-134)、3.69 (s, 3H, H-174)、
3.73 (s, 3H, H-121)、4.03 (q, 2H, J = 7.6, H-81)、4.14 (m, H, H-17)、
4.49 (m, H, H-18)、5.58 (s, H, C-132-OH)、6.24 (dd, 2H, J = 11.6, 1.3 Hz, H-32b)、6.38 (dd, 2H, J = 17.8, 1.3 Hz, H-32a)、δ 8.01 (dd, 2H, J = 17.8, 11.6 Hz, H-31)、8.62 (s, H, H-20)、9.69 (s, H, H-10)、10.41 (s, H, H-5)、
11.12 (s, H, H-71)
7. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 34）
11.8 (C-21)、12.2 (C-121)、18.8 (C-81)、19.1 (C-82)、22.5 (C-181)、
30.9 (C-171)、31.3 (C-172)、50.1 (C-18)、51.6 (C-17)、51.8 (C-174)、
53.3 (C-134)、88.6 (C-132)、93.7 (C-20)、101.9 (C-5)、106.4 (C-10)、
107.2 (C-15)、123.4 (C-32)、127.5 (C-14)、128.3 (C-31)、131.9 (C-2)、
132.5 (C-11)、132.7 (C-7)、136.6 (C-4)、137.6 (C-12)、137.7 (C-3)、
143.4 (C-1)、146.9 (C-9)、150.7 (C-6)、150.7 (C-13)、159.0 (C-8)、
165.0 (C-16)、172.3 (C-19)、173.6 (C-133)、174.0 (C-173)、187.4 (C-71)、191.8 (C-131)
【八】化合物Ⅷ：methyl 132-hydroxy-(132-S)-pheophorbide a
1. 墨綠色固體
2. TLC：Rf = 0.52 (chloroform : ethyl acetate = 5：1) 3. FABMS m/z (rel. int.)：（圖 38）623 [M+H]+
4. IR (KBr) cm-1（圖 39）
3434、2917、2848、1737、1706、1621、1158、1050 5. UV (CHCl3)λmax：（圖 40）
210、279、407、504、532、610、665 6. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 41）
-1.84 (s, -NH) 、0.31 (s, -NH)、1.60~1.72 (m, 6H, H-82,181)、2.31 (m, 2H, H-171a、H-172a)、2.58 (m, H, H-172b)、2.8 (m, H, H-171b)、3.21 (s, 3H, H-71)、3.42 (s, 3H, H-21)、3.64 (m, 2H, H-81)、3.67 (s, 6H, H-134, 174)、3.74 (s, 3H, H-121)、4.17 (m, H, H-17)、4.51 (m, H, H-18)、5.51 (s, H, C-132-OH)、6.18 (dd, 2H, J = 11.5, 1.1 Hz, H-32b)、6.28 (d, 2H, J = 17.8 Hz, H-32a)、δ 7.98 (dd, 2H, J = 17.8, 11.5 Hz, H-31)、8.65 (s, H, H-20)、9.41 (s, H, H-5)、9.57 (s, H, H-10)
7. 13C-NMR (CDCl3,50 MHz)：（圖 43）
11.0 (C-71)、11.9 (C-21)、12.1 (C-121)、17.2 (C-82)、19.2 (C-81)、22.4 (C-181)、29.5、30.9 (C-171)、31.2 (C-172)、50.1 (C-18)、51.6
(C-17,174)、53.2 (C-134)、88.8 (C-132)、93.4 (C-20)、97.7 (C-5)、104.0 (C-10)、107.4 (C-15)、122.6 (C-32)、126.7 (C-13)、128.8 (C-31)、129.2 (C-12)、131.5 (C-2)、136.0 (C-4, 7)、136.3 (C-3)、137.6 (C-11)、141.8 (C-1)、144.9 (C-8)、149.6 (C-14)、150.8 (C-9)、155.1 (C-6)、162.2 (C-16)、172.2 (C-19)、172.6 (C-173)、173.8 (C-132)、191.8 (C-131)
1. 透明油狀物
2. TLC：Rf = 0.61 (chloroform : ethyl acetate = 1：1) 3. EIMS m/z (%)：（圖 47）
312 (M+, 1.0)、281 (4.2)、263 (3.7)、256 (2.4)、199 (4.4)、137 (14.7)、
123 (24.3)、111 (39.4)、97 (50.0)、83 (65.9)、71 (84.7)、57 (100) 4. IR (KBr) cm-1（圖 48）
3262、2936、2859、1459、1373、1072、1026、899 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 49）
0.83~0.88 (m)、1.03~1.59 (m)、1.96 (m)、2.33 (br, H, -OH)、3.53 (dd, H, J = 7.2, 11.2 Hz)、3.71 (dd, H, J = 3.2, 11.2 Hz)、4.20 (dd, H, J = 3.2, 7.2 Hz)、4.97 (s, H)、5.13 (s, H)
6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 51）
19.5 (C-19,18)、22.4 (C-16)、22.5 (C-17)、24.2 (C-9)、24.6 (C-13)、
25.3 (C-5)、27.7 (C-15)、37.2 (C-12)、32.5 (C-11)、32.6 (C-7)、32.8 (C-4)、36.6 (C-6)、37.1 (C-10)、37.2 (C-8)、39.1 (C-14)、65.4 (C-1)、
74.8 (C-2)、110.3 (C-31)、148.5 (C-3)
【十】化合物Ⅹ：1,2-dihydroxypropyl hexadecanoate
1. 白色針狀結晶（n-hexane/chloroform）
2. TLC：Rf = 0.43 (chloroform : ethyl acetat = 1：1) 3. EIMS m/z (%)：（圖 56）
331 (M+H +, 2.0)、299 (9.9)、270 (5.3)、257 (10.6)、239 (27.6)、134 (38.1)、112 (32.5)、98 (80.2)、74 (50.7)、57 (100)
4. IR (KBr) cm-1（圖 55）
3160、2917、2851、1732、1470、1181、1046 5. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz)：（圖 57）
0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)、1.26 (12 × CH2)、1.63 (m, 2H)、2.07 (t, br, C3-OH)、2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H)、2.51 (d, br, C2-OH)、3.63 (m, 2H, H-3)、3.94 (m, H, H-2)、4.19 (m, 2H, H-1)
6. 13C-NMR (CDCl3, 50 MHz)：（圖 59）
13.9 (CH2CH3)、22.4~33.9 (14 × CH2)、63.1 (C-3)、64.9 (C-1)、70.0 (C-2)、174.1 (C = O)
7.COSY：（圖 58）
0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) 1.26 (12×CH2)
1.63 (m, 2H) 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H) 3.63 (m, 2H, H-3) 3.94 (m, H, H-2)
3.94 (m, H, H-2) 4.19 (m, 2H, H-1) 8.HMQC：（圖 60）
0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) 13.9 (CH2CH3) 1.63 (m, 2H) 24.7 (CH2) 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H) 33.9 (CH2) 3.63 (m, 2H, H-3) 63.1 (CH2, C-3) 3.94 (m, H, H-2) 70.0 (CH, C-2) 4.19 (m, 2H, H-1) 64.9 (CH2, C-1)