DNA之製備

1.質體 DNA 之抽取

將含有質體之菌株培養於 3 ml 液態培養基中，可視情況加入合適濃 度之抗生素以預防污染。經 37℃震盪隔夜培養，視菌種的生長速度，在 生長對數期間（log phase）取出，分裝 至 1.5 ml eppendorf 中，以 12,000 rpm 5 分鐘離心，去除上清液後加入100 μl solution Ⅰ溶液，使菌體重新懸浮，

靜置於室溫中 5 分鐘。接著加入200 μl solution Ⅱ溶液，溫和上下倒置數 次後，置於冰上 5 分鐘。之後再加入150 μl solution Ⅲ溶液，上下倒置數 次後再置於冰上 6 分鐘。接著以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液取至 新的 eppendorf 中，再加入 1：1 之 phenol/chloroform 以 vortex 混合均勻，

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經 12,000 rpm 離心 5 分鐘後取上清液至另一 eppendorf 中，重複數次。使 溶液分界層無雜質後再加入等量之 chloroform 以 vortex 混合均勻，經 12,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液至新的 eppendorf 中加入二倍體積之 95

％酒精，用 vortex 混合均勻後靜置於冰上 10 分鐘。最後再以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，去除酒精後得沉澱之 DNA，待酒精揮發後用無菌之去離 子水回溶備用。

2. 染色體 DNA 之抽取

將菌株培養於 3 ml 液態培養基中，37℃震盪隔夜培養，視菌種的生 長速度，在生長對數期間（log phase），移至 1.5 ml eppendorf 中，以 8000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液後再到入剩餘的菌液離心 5 分鐘後，去除上 清液。加入 1 ml 之 1X STE buffer，並 vortex 使菌體重新懸浮，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，重複一次此步驟。去上清液後，先加入200 μl 1X STE vortex 均勻。接著緩慢加入40 μl 10％ SDS，慢慢上下倒置 eppendorf，

直至澄清。接著靜置 65℃ 30 分鐘，待降溫後加入 Proteinase K（2 mg/ml）

20 μl（final conc. 40 ng/ml）於 37℃作用 3~4 小時，接著加入 400 μl 1X STE buffer 放大體積。加入 1：1 比例之 phenol/chloroform 用 vortex 混合均勻，

以 12,000 rpm 離心 5 分鐘後取上清液至另一 eppendorf 中，重複此步驟數 次使溶液分界層無雜質。再加入等量之 chloroform 用 vortex 混合均勻，

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以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清液至另一 eppendorf 中加入二倍體積 之 95％酒精，用 vortex 混合均勻後置於冰上 10 分鐘，最後利用 tip 捲出 染色體晾乾，再加入無菌去離子水200 μl 回溶，以 65℃加熱 30 分鐘去除 DNase 後，置於 4℃保存備用。

3. DNA 片段之回收

DNA 片段的回收使用 GeneMark DNA Clean/Extraction Kit，將要分離 的 DNA 片段先以洋菜膠體電泳分離，於 EtBr 染色 10 分鐘，置於紫外線 箱上觀察。使用刀片將目標片段切取下來放入 eppendorf 中，加入700 μl Binding solution 置於乾浴器 65℃ 15 分鐘，時而上下倒置搖晃直至膠體 完全融化。再吸取溶液至 Kit 所提供之 Spin column 中，此 Spin column 下接 Collection column，並以 12,000 rpm 離心 1 分鐘後再加入 700 μl Binding solution 並以 12,000 rpm 離心 1 分鐘。接著加入700 μl Washing Solution 12,000 rpm 離心 1 分鐘，重複此步驟二次。並再以 12,000 rpm 離 心 3.5 分鐘以將液體完全去除，接著打開 Spin column 蓋子等待 3 分鐘使 酒精揮發，最後加入適量無菌去離子水於 Spin column 中，靜置數分鐘後 以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，即得回收產物。回收所得之 DNA 保存於 4

℃備用。