第一章 前言
第一節 研究背景
1.1.6. Pseudomonas aeruginosa 之MexEF-OprN多重藥物輸出幫浦
在先前的研究報導中指出S. maltophilia 之SmeVWX多重藥物輸出幫 浦 與 P. aeruginosa 之 MexEF-OprN 多 重 藥 物 輸 出 幫 浦 相 似 度 最 高
（Crossman, et al.,2008）[6]。 在P. aeruginosa菌中具有11個屬於RND家 族之多重藥物輸出幫浦，分別是MexAB-OprM（Li, et al., 1995）[20]、 MexCD-OprJ （Poole, et al., 1996）[21]、MexEF-OprN（Köhler, et al.,1997）
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[22]、MexGHI-OpmD（Aendekerk, et al., 2002 ; Sekiya, et al., 2003）[23, 24]、 MexJK-OprM（Chuanchuen, et al.,2002）[25]、MexMN（Mima, et al., 2005）
[26]、MexPQ-OpmE（Mima, et al., 2005）[26]、MexVW-OprM（Li, et al.,2003）
[27]、MexXY-OprM （Masuda, et al., 2000）[28]、TriABC-OpmH（Mima, et al., 2007）[29] 和MuxABC-OpmB 幫浦（Mima, et al., 2009）[30]
。
MexEF-OprN 多重藥物輸出幫浦在一般的實驗室生長條件下是不表
現或是表現量很低（Maseda, et al., 2000）[31]，其功能也與內生性之抗藥 性無關，這項發現與其他之 P. aeruginosa RND-type 的多重藥物輸出幫浦 不同。但是在 P. aeruginosa 的過度表現之 nfxC-type 突變株中，此多重藥 物輸出幫浦卻能將 quinolones 類、 chloramphenicol 和 trimethoprim 等藥 物排出去（Köhler, et al.,1997）[22]。mexEF-oprN operon 的調控與其他的多重藥物輸出幫浦不同，可被屬 於 LysR 型轉錄調控因子 MexT 調控蛋白 正調控。 mexT 基 因位於 mexEF-oprN operon 上游，並與 mexEF-oprN 基因相同的方向進行轉錄。
而調控蛋白 MexT 的過度表達可誘導 mexEF-oprN operon 的表達，並減少 OprD 的表達（Ochs, et al., 1999）[32]。
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第二節 研究目的
在臨床上，受細菌感染之病人一般都會投予抗生素來治療，然而，
長時間使用抗生素下容易使細菌產生突變，進而產生抗藥性。
S. maltophilia 屬好氧性革蘭氏陰性桿菌，為一種重要的院內感染菌，
其特徵在於對許多抗生素都具有抗藥性（如：β-actam 類、aminoglycoside、
quinolone…等），因此，常常造成臨床治療與院內感染管制上的困難。
本論文的研究主題是模擬臨床投予藥物的治療來探討投藥後產生突 變之 S. maltophilia 菌對藥物具有抗藥性之情形。在先前的研究中也曾指 出利用高濃度之抗生素來篩選細菌不僅容易使細菌突變會對所使用之抗 生素具有抗藥性，更是容易會對其他種類之抗生素也具有抗藥性之現象。
因此，利用一高濃度抗生素 chloramphenical 來篩選本實驗室所分離之 S.
maltophilia 菌株 KJ 後得一突變株 KJ09C，並經過抗生素感受性試驗得知 KJ09C 菌株具有多重抗藥性現象。
此外，有研究指出用此策略篩選到之突變株經常會過度表現多重藥 物輸出幫浦。因此，想要進一步探討 KJ09C 菌株產生多重抗藥性是否與 多重藥物輸出幫浦過度表現有關外，並分析此過度表現多重藥物輸出幫 浦之每一基因在抗藥性中的貢獻與所扮演之角色，進而提供在臨床上治 療受 S. maltophilia 感染而長使用此抗生素可能會引起此套多重藥物輸出 幫浦過度表現之資訊。
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第二章 研究方法
第一節 研究設計
本研究論文之第一部份是先利用高濃度之 chloramphenicol 抗生素篩
選到一 MDR 突變菌株 KJ09C，並利用 qRT-PCR 和抗生素感受性試驗來 證明此突變株 KJ09C 是過度表現 SmeVWX 這套多重藥物輸出幫浦
（multidrug efflux pump）。接著 對於 S. maltophilia K279a 之 SmeVWX 多 重藥物輸出幫浦作生物資訊的分析。接著利用 promoter-xylE transcription fusion assay 的策略來評估 smeRv 基因與 smeU1-V-W-U2-X operon 之間 371-bp 之 intergenic region 內 smeRv 基因與 smeU1-V-W-U2-X operon 之 啟動子的調控方式。
本研究論文之第二部份是探討 smeU1-V-W-U2-X operon 中每一個基 因在突變菌株 KJ09C 中所扮演的角色。構築pKJΔSmeRv、pKJΔSmeU1、
pKJΔSmeVW、pKJΔSmeU2 以及 pKJΔSmeX 之質體，然後利用基因替換
（gene replacement）的策略，將欲突變之基因 deletion，形成 KJ09CΔSmeRv、
KJ09CΔSmeU1、KJ09CΔSmeVW、KJ09CΔSmeU2 以及 KJ09CΔSmeX 突 變株，並利用 qRT-PCR 方法分析所刪除基因及其下游基因之 RNA 表現 量，並與其相對應之 parent strains KJ09C 及原生菌株(wild type) KJ 進行 抗生素感受性試驗。此外，利用過度表現系統將 smeU1、smeU2 和 smeX
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基因過度表現，來釐清 smeU1-V-W-U2-X operon 中每一個基因在突變菌株 KJ09C 中所扮演的角色。
第二節 研究材料
2.2.1 本論文所構築與分析之質體與菌株列於表 1。
2.2.2 PCR 引子
實驗中所使用的 PCR 引子序列皆詳列於表 2，其中 stock solution concentration 為100 Μm；而 working concentration 為 10 μM。
2.2.3 培養基
本 實驗使用的培養基購自 MDBio, Inc. （參照 Sambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 所記載之配方）。
1. Luria-Bertani broth（LB）：每 1 公升的水中含 10 g tryptone
5 g yeast extract 10 g NaCl
pH: 7.0±0.05
2. Luria-Bertani agar（LA）：Luria-Bertani broth 成份中額外加入 1.5% agar.
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3. Mueller Hinton Ⅱ Agar：每 1 公升的水中含 2 g beef extract
17.5 g acid hydrolysate of casein 1.5 g starch
17 g agar
2.2.4 實驗藥品
本實驗菌種所使用的藥品購自 Difco Laboratories 或 Accumedia manufacturers, Inc. 而其他的化學藥品及有機溶劑則購自 E. Merk, J. T.
Backer Company、Severva Frvafeinrobiochemica、Boehringer mannhrim GmhH Biochemical 、Pharmacia、Sigma Chemical Company、Biosolve 及 日本和光藥廠。限制 酶以及其它酵素是購自TaKaRa Shuzo Co. Ltd.、New England Biolabs （ NEB ）、 promega company 和 Bethesda Research Laboratories。T4 DNA ligase 購買自 promega Co.。
2.2.5 抗生素
所有抗生素皆購自 sigma 公司，並依照實驗所需配置成適當濃度，並詳 列於表 3。
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2.2.6 試劑與緩衝溶液
1. 質體 DNA 抽取之試劑
抽取質體 DNA 之技術是利用 alkaline lysis method 進行，所需試劑如下：
（1） Solution Ⅰ：10 mM EDTA（pH 8.0），50 mM Glucose 及 25 mM Tris-HCl（pH 8.0）。
（2） Solution Ⅱ：1% SDS 及 0.2 N NaOH。
（3） Solution Ⅲ：3 M potassium acetate（pH 4.8）及 5 M glacial acetic acid。
2. 染色體抽取之試劑
(1). STE buffer : 10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl 及 1 mM EDTA（pH 8.0）。
(2). Proteinase K（10 mg/ml）。
3. Agarose gel 電泳之試劑
(1). TAE running buffer : 預先配製 50X 濃度的 TAE buffer ，取 242 g Tris base ， 57.1 ml galacial acetic acid ，100 ml 之 0.5 M EDTA
（pH 8.0），加水至 1 L 。使用時加水稀釋至 0.5X，濃度為 40 mM Tris-acetate ，1 mM EDTA（pH 8.0）。
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(2). 6X loading dye：溶劑中含 0.25% xylene cyanol，30% glycerol，
0.25% bromophenol blue。
(3). Staining buffer：於染盆中先加入少許之蒸餾水，再加入 5 μl 的 ethidium bromide（EtBr）、1 ml 1 mM EDTA（pH 8.0）及200 μl RNAse A，最後再加蒸餾水至總體積為 150 ml，充份混合。於使 用時染盆中約含有 0.5 μg/ml ethidium bromide。
4. C23O（Catechol 2,3-dioxygenease） 活性測試所需試劑 (1). Sodium phosphate buffer, 0.1M pH 7.5 預先配製
Solution A : 27.2 g KH2PO4 per liter（0.2 M）
Solution B : 45.6 g K2HPO4 per liter（0.2 M）
然後再以 solution A 39 ml 搭配 solution B 61 ml 之比例，使其 pH 值為 7.0，最後加去離子水至總體積為 200 ml 即完成。
(2). Assay buffer
取 200 ml 0.1 M pH 7.0 sodium phosphate buffer，加上 60 ml 去 離子水，再加入 40 ml acetone，配製成 400 ml assay buffer。
(3). 0.1M catechol
秤取 1.1 g catechol 溶至 100 ml assay buffer，使其完全混和溶解。
最後保存於 4℃冷藏備用。
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2.2.7 儀器設備
1. 聚合酶連鎖反應器 2. 恆溫培養箱
3. 恆溫乾浴器 4. 離心機 5. 電泳設備 6. 分光光度計
7. 即時定量聚合酶連鎖反應器 8. 超音波細胞破碎機
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第三節 實驗方法
2.3.1 菌種的培養與保存
1. 短期保存
將實驗用菌株培養於不含抗生素的 Luria-Bertani agar（LA）固態培養基 中，置於 37℃隔夜培養後，放置 4℃保存 5~7 天，予以備用。
2. 長期保存
將本實驗所用的菌株培養於含有合適抗生素濃度的 Luria-Bertani broth（LB） 培養液中，37℃震盪隔夜培養。視菌種的生長速度，在生 長對數期間（log phase）取 0.7 ml 的菌液並加入 0.3 ml 87％無菌 glycerol ， 混合均勻存放於抗凍管中，並在管上貼上標籤註明編號、菌種名稱和製 作日期，存放於-80℃備用。
2.3.2 洋菜膠體電泳分析（agarose gel electrophoresis）
秤取適量之 agarose powde 加入 0.5X TAE buffer 中，利用微波爐加 熱使之溶解，agarose 的濃度依欲分析之 DNA 片段大小而定。一般使用 濃度範圍約 0.8%~2.0%（w/v）。等 agarose 溶液降溫至 50℃~60℃時將之 倒入鑄膠槽並插上齒梳（comb）。待 agarose 溶液冷卻凝固後緩慢拔除齒
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梳，即完成 agarose gel 製作。
將 agarose gel 置於水平式電泳槽裝置，並加入 0.5X TAE buffer 至淹 蓋過 gel 為止。把欲分析之 DNA 樣品與 6X loading dye 以 5：1 混合之 比例混勻後，加入 agarose gel 的溝槽（well）內。開啟電源，以 5V/cm 的電壓進行電泳，泳動的時間視 DNA 片段長度而定。待分離完畢後，將 agarose gel 置於含 ethidium bromide（0.5 μg/ml）的染盆中染色 10~15 分 鐘後，再置於紫外燈箱中觀察 DNA 泳動的位置並與 DNA marker 比對，
以評估 DNA 片段的大小及濃度。
2.3.3 DNA 之製備
1.質體 DNA 之抽取
將含有質體之菌株培養於 3 ml 液態培養基中，可視情況加入合適濃 度之抗生素以預防污染。經 37℃震盪隔夜培養，視菌種的生長速度，在 生長對數期間（log phase）取出，分裝 至 1.5 ml eppendorf 中，以 12,000 rpm 5 分鐘離心，去除上清液後加入100 μl solution Ⅰ溶液，使菌體重新懸浮，
靜置於室溫中 5 分鐘。接著加入200 μl solution Ⅱ溶液，溫和上下倒置數 次後，置於冰上 5 分鐘。之後再加入150 μl solution Ⅲ溶液，上下倒置數 次後再置於冰上 6 分鐘。接著以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液取至 新的 eppendorf 中，再加入 1：1 之 phenol/chloroform 以 vortex 混合均勻，
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經 12,000 rpm 離心 5 分鐘後取上清液至另一 eppendorf 中，重複數次。使 溶液分界層無雜質後再加入等量之 chloroform 以 vortex 混合均勻，經 12,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液至新的 eppendorf 中加入二倍體積之 95
％酒精，用 vortex 混合均勻後靜置於冰上 10 分鐘。最後再以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，去除酒精後得沉澱之 DNA，待酒精揮發後用無菌之去離 子水回溶備用。
2. 染色體 DNA 之抽取
將菌株培養於 3 ml 液態培養基中，37℃震盪隔夜培養，視菌種的生 長速度，在生長對數期間（log phase），移至 1.5 ml eppendorf 中，以 8000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液後再到入剩餘的菌液離心 5 分鐘後，去除上 清液。加入 1 ml 之 1X STE buffer，並 vortex 使菌體重新懸浮，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，重複一次此步驟。去上清液後，先加入200 μl 1X STE vortex 均勻。接著緩慢加入40 μl 10％ SDS，慢慢上下倒置 eppendorf，
直至澄清。接著靜置 65℃ 30 分鐘，待降溫後加入 Proteinase K（2 mg/ml）
20 μl（final conc. 40 ng/ml）於 37℃作用 3~4 小時，接著加入 400 μl 1X STE buffer 放大體積。加入 1：1 比例之 phenol/chloroform 用 vortex 混合均勻，
以 12,000 rpm 離心 5 分鐘後取上清液至另一 eppendorf 中，重複此步驟數 次使溶液分界層無雜質。再加入等量之 chloroform 用 vortex 混合均勻，
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以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清液至另一 eppendorf 中加入二倍體積 之 95％酒精，用 vortex 混合均勻後置於冰上 10 分鐘，最後利用 tip 捲出 染色體晾乾，再加入無菌去離子水200 μl 回溶，以 65℃加熱 30 分鐘去除 DNase 後，置於 4℃保存備用。
3. DNA 片段之回收
DNA 片段的回收使用 GeneMark DNA Clean/Extraction Kit，將要分離 的 DNA 片段先以洋菜膠體電泳分離，於 EtBr 染色 10 分鐘，置於紫外線 箱上觀察。使用刀片將目標片段切取下來放入 eppendorf 中，加入700 μl Binding solution 置於乾浴器 65℃ 15 分鐘，時而上下倒置搖晃直至膠體 完全融化。再吸取溶液至 Kit 所提供之 Spin column 中，此 Spin column 下接 Collection column，並以 12,000 rpm 離心 1 分鐘後再加入 700 μl Binding solution 並以 12,000 rpm 離心 1 分鐘。接著加入700 μl Washing Solution 12,000 rpm 離心 1 分鐘，重複此步驟二次。並再以 12,000 rpm 離 心 3.5 分鐘以將液體完全去除，接著打開 Spin column 蓋子等待 3 分鐘使 酒精揮發，最後加入適量無菌去離子水於 Spin column 中，靜置數分鐘後 以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，即得回收產物。回收所得之 DNA 保存於 4
℃備用。
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4. 切割反應
選擇合適的限制酶，配合廠商建議的緩衝溶液，和所建議之反應溫 度，進行 DNA 切割反應。反應時的 DNA 濃度約為1 μg/50 μl，而反應時 間則視選擇的限制酶而調整，完成後利用洋菜膠體電泳分析切割情形。
選擇合適的限制酶，配合廠商建議的緩衝溶液，和所建議之反應溫 度，進行 DNA 切割反應。反應時的 DNA 濃度約為1 μg/50 μl，而反應時 間則視選擇的限制酶而調整，完成後利用洋菜膠體電泳分析切割情形。