DNA探針的製備:

c-jun mRNA 的 DNA:J家針是從pHJl 9 質體經限制酵素 PstI及EcoRI 切 耳又一段長約 1.lkb 的 DNA 片段，此段DNA 乃是相封於 c-Jun 蛋白的 DNA 結合區的去氧核甘駿序列 (44，45) , c-fos mRNA 探針則是用限制韓素Pst 1

從 pfos-1 質體切除的 DNA 片段 (46)' GAPDH mRNA 的 DNA探針是由 pIB I3 0 質體上，經PstI切下的一段長約 1 .25kb 的 DNA 片段，為此實驗中 所用的 intemal contro 1 (47) 。

本實驗是以英閻福盟主:司出品的 QIAGEN plasmid DNA抽取系統純

化plasmid DNA 0 取自;態培養基上單一菌落，接種於 5甜的 LB 培養液

(一升培養液中合 10g Bacto-trypton ' 5g Bacto-yeast extract ' 5g NaCl pH7.5 '每毫升的 LB medium 50Jlg的Ampicillin ) , 3

TC

' 的 o rpm' 過夜 培養，再以 1ml 菌液接入相間培養液的 Oml' 同樣條件下過夜培養後回

收。

將菌 r夜裝入離心管中，以 400。中m 離心 20 分鐘，倒掉上清液加入

10ml buffer P1 ( RNase A 100ug/ml ' 50mM Tris爛HCl ' 10mM EDTA pH8.0) ，使菌體完全懸浮之後加入 buffer P2 ( 200rnM NaOH ' 1 %SDS )

蓋上離心管萃，輕輕的搖晃離心管，使之均勻混合，在室溫下反應、 5 分 鐘，然後一邊搖晃離心管一邊加 10 ml 的 buffer P3 ( 2.55M KOAc '

翩26也

pH4.8 )在 4⁰C 下，轉遠大於 12， 000g 離心 30 分鐘，另外以 5ml buffer

用 70 %酒精清洗DNA pell哎，再次的離心，倒掉上清液，將DNA~容 於適量的 TE buffer( pH8.0 ) ，測量A260/A2 80 的吸光鐘。先擬定要反應的 DNA及核酸限制酵素(l ur立印g)體積，由此計算 reaction buffer 的用量，並 用水補足反應體積，於37⁰C 下反應 1.] 、時以上，再以的。C 加熱 10 分鐘終

止反應，取 1μg DNA (約 1-2μ1) 以電泳按 i~'J 反應是否完全?再以 DEAE

cellulose membrane 回收DNA 片手丈(48) 。

剪裁大 .J 、通當的 membrane' 先以 10mM EDTA 洗 10分鐘，再以 0.5N

時，將活化後的 NA-45 membrane插入所要分離的 DNA前方( i丘正種處) 繼續電泳，以紫外燈確定DNA吸附於NA-45膜上。

取出 NA-45膜，用無菌水沖洗附著在膜上的 agarose 0 除去無 DNA 部

-27-分之NA-4 5 膜以增加回收率，將 NA-45 膜放入 eppendorf 中，加入 300μi

TEN buffer ( 10rnM Tris pH8.0 ' O.lM NaCl ' 1rnM

EDTA) 在的。C 下加熱

30 分鐘，取出上述 TEN buffer '再加入 300Jll TEN '繼續在的。C 下加熱 30 分鐘?將膜置於 uv 燈下，確定 DNA 是否完全釋出，若尚未完全釋出身j 重覆以上步驟至 DNA 完全釋出為止。

將 j容於 TEN buffer 的 DNA 以等體積的 phenol: chlofonn:IAA (isoamyl alcohol) = 25:24:1 抽取兩次，加 2.5倍體積酒精沉澱，於-20⁰C 靜置隔夜，

或於-70⁰C 靜置 1 ， J 、時，真空乾漂(但不可太乾，否則 DNA將不易溶解) ,

溶於適量無菌水中異于放於輛20⁰C 備用。

探針的來涼為 C-J Ull、 c-fos和 GADPH之mRNA 的 DNA' 深針的製備是 利用Amersham "h司出品的 Multiprime DNA labeling systems 製造，其捧 作步驟如下:取 1μg specific DNA探針，加入7-16μl水中 (DNA加水的總 體積等於 17μ1 )在 100⁰C 下進行變性反應( Denaturation ) 2 分鐘，再放置 冰上5 分鐘。

依序加入 5μ1 concentrated reaction buff哎， 5μ1 random primer '再加標 記的 dNTP各4凶， 5 叫世ts klenow enzyme 及5μ1 [α32p]dCTP( . .50μCi) 均 勻混合。在37⁰C 下反應、至少 1 小時，加入5凶， 0.5M EDTA ( pH8.0 )來停 止反應。標熾DNA深針的分離利用 gel fil仕ation的原理(49) ，先取 1ml 的注 射針筒將其底部塞入適量的玻璃棉，加入已被 TEN buffer 平衡的

上述的離心步驟。小心的取出去萃的1. 5 mI 塑膠離心管，取 1μ1加入 3mI 閃煒計數 l'夜， ì如j 量 32p 的 cpm佳，將其餘樣品， J 、心蓋好，放於♂ OOc 財存。

B. TotaI RL~A 的抽取(50)

先將NIH 3T3 cells 種於 100mm 的培養且中，待細胞長滿後進行serum

starvation 24 小時，加入各種濃度的 crocetin處理細胞的分鐘，再加入

TPA處理細胞 60 分鐘抽取c-jun mRNA '或將細胞以 TPA 處理細胞 30 分 鐘，抽耳叉c-fos mRNAo 細胞處理完畢後，吸掉mediwn '再用冰冷的 PBS 沖洗細胞兩次。

加入 2ml 的 Solution D ( 4M Guanidiniwn thiocyna肘， 25mM Sodiumcitrate ' 0.50/0 Sarcosyl ' O.1M 2-mercaptoethanoI

)至每一個培養

血，以 micro-pipetman 將細胞全完全打下，直入 5mI無菌 PP 塑膠管中依 次加入 0.2ml Sodium acetate ( 2M, pH4.0 ) ,

O

.4mI ' 1: 1 的 CHCh:

isoamylalcohol及2別的 phenol '用力搖晃幾秒，放到冰上靜置 1 分鐘，重 覆搖晃及靜置 20 分鐘，以 12000g' 4⁰C '離心 20 分鐘。

吸水層到新的制悅，加入等體積的 isopropanol 混合均勻，產於-20⁰C 下 1 小時，再以 12000g , 4⁰C '離心 20 分鐘，倒乾液體，以 0.5mI solution D 溶解沉澱物，重覆 isopropanol 沉澱及離心，最後用 75% 酒精清洗，向 上條件籬，心後將液體拍乾?加入 40凶， lmM ' EDTA 溶解， iß'J O.D

A260/A2 80' 計算RNA 的濃度及純度。

耐29-C.RNA 電泳 RNA樣品注入well 中，以 5V/cm' 進行電泳，至 leading dye跑到膠體長度 之四分之三處，停止電泳，以拍立得相機在紫外光的照射下拍攝R封A 的

電泳圈。

將RNA 膠體浸泡 50mM NaOHlI0mM NaCl 中 30 分鐘， 100 mM T郎"

HCl 中 30 分鐘 ， i吏RNA上的 formaldehyde被去玲。剪取與膠體大， J 、相同的

硝化纖維紙及扎位在洛紙，前者以 2 倍 SSC buffú ( 0.3M NaCl ' 0.03M sodium citrate )浸泡，後者以 20倍 SSC buffer浸泡，取適當淺槽，以玻鴉

片或其他文架，橫架於榜上，剪一條此心f波、紙放置文架上，兩端垂下，

膜，於 80⁰C 真空烘烤兩小時後，保存於乾埠處。

D. 雜交反應

將烘烤好的硝化纖維紙以 2倍 SSC buffer浸濕，捲入 Hybridization tube

中，倒入 2 倍 SSC buffer 使其展開，將 2 倍 SSC{jlJ 出，換入 hybridization

solution [6X SSC, 10X Denhart's reagent (50X Denhart's reagent 合 0.1%

Ficall ' 0.1 % bovine serum albumin ' 0.1 % polyvinyl pyrrolidone )

,

0.1 %SDS ' 50% fonnamide ' 50~g/ml denatured salmon spenn DNA ] ，直

入hybridization

oven ' 42⁰C

'反應 4-24 小時，取適量探針於95

⁰

C 加熱 5 分

鐘使其 dena何時，將 denature 後的尿針先置冰上 5 分鐘，再加入

prehybridization solution 中，繼續於位。C 下反應、 16-24 小時。將

hybridization solution倒出，依序加入 2X SSC / 0.1% SDS ; 0.5X SSC / 0.1% SDS 及 O.IX SSC / 0.1 %SDS 各於位。C 漂洗20 分鐘，直到游離的兩 位素漂流乾;爭為止。將硝化纖維紙取出用蓋革計數檢測是否有具特異性 強度的放射線帶出現，將雜交成功的硝化纖維紙以係鮮膜包好並排除水 氣，固定於感光夾中，於暗房中產入適當大小的 X 光片，再將感光夾置

於-70⁰C 冰箱，在-70⁰C壓片時間身1 dJ放射線強弱洪定 'X光片感光的結泉 由 Denstrometer定量。

-31 個

第三章結果

在文檔中 蝴 中華民國入十四年六月 (頁 31-37)