蝴 中華民國入十四年六月

私立中山醫學院生物化學研究所碩士論文

Master Thesis , ^1盟stitute of Bioche臨istry

Chang Sha盟品質edical and De盟tal College

藏紅酸與去氫棍子甘抑制癌 促進作用分子機制之研究

Anti-如臨or Activity a盟d Mechanism of Action of Crocetin and Ge詛iposide

指導教授:王朝鐘教授 (Chau-Jo且g Wang)

劉哲育副教授 (Jer闢，Yuh Li的

研究生:鄭自君 (Tzu嘲Chun Che盟的

中華民國入十四年六月

IIIII"~I蝴Ili師11111111

本論文為中山醫學院授予理學碩士學位之 s泣備條件之一，

經中山醫學院生物化學研究所碩士論文考試委員會審查合 格及口試通過 o

考試委員

商立臺灣大學醫學院

生化研究所教授

私立中山醫學院

生化研究所教授兼所長

(本論文指導教授)

私立中山醫學院 生化研究所副教授 (本論文指導教授)

林仁;昆博士

非作〉予合

王朝鐘博士

主訓話

劉哲育博士

手iψ?

誌謝

終於畢業了!除了無限的喜悅，還要惑謝一路上伴我成長的家人 及良師益友，讓我踏實的完成研究所的課業及碩士論文，並且更有信 心在研究的領域繼續前進。

…謝謝母親及兄姊的支持鼓勵，使我無後顧之憂的在中山奮門。

一一謝謝王朝鐘老師對我研究的啟發，在論文實驗上玖玖不倦的指 導，並且時時關懷我的身體健康，教導我為學處世的正確的態度及方 法，使我得以順利的完成研究所學業。

…謝謝劉哲育老師在實驗方法、技巧上耐心的指導，並帶領我走

入訊息傳遞的研究領域。

呵呵謝謝台大毒理所郭明良老師、生化戶斤黃為L唐學長以及詞時期的

研究夥伴:淑于、乃成、子膏、處雲及王紹文學長等，在我接觸分生 實驗之初給予我技術上的指導及幫助，讓我勇敢的踏出第一步。

--謝謝寄生蟲科李秀雄老師及徐玲玉老師在實驗場地及實驗設備 上的借助，讓我順利完成分生部份的實驗。

一謝謝玉玲學姐、小珮、妙真、周秀琴小姐於實驗、課素及生活 上道義的支持，孟適時的安撫我情緒的低潮與控折，使我平淡的研究 生活增添了許多的歡樂。

一謝謝正忠、五凱、玉美常常研究至深夜，因而點亮了中山的夜

晚，讓我無懼黑暗降臨與野狗咆埠，安心的完成許多實驗。

一最後仍要謝謝中山生化所的師長及同學們，在這兩年的求學過 程中的指導與共同切磋學悶，息我良多。

謹以此論文獻給關愛我的家人及所有協助我的良師益友。

中華民商入十四年六月

目錄

縮寫表... 1

第一部份藏紅酸封癌促進作用的分子機制之研究... ... 2

中文摘要 ...3

英文摘要 ...4

第一章緒論 ...5

第一節藏紅酸在醫藥治療上背景介紹..... ... ... ...‘ ...6

第二節 TPA 的癌促進作用... 7

第三節研究動機...... .11

第二章材料與方法....... ... .."... ... ... ... ... ...口 第一節實驗材料...12

第一節實驗方法....... ..." ... ... ... ". ... .... ...印 第三章結果...... ... ... ... ... ... ...,. .... ...泣 第四章討論..."..... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ...兒 園表及說明 ...38

第二部份去氫槌子甘與戊乙昌盛去氫槌子甘對痞促進作用的分子機制 之研究...... ... ... ... ... .... ... ...幻 中文摘要 ...54

英文摘要...... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ....仿 第一章緒論 第一節去氫棍子甘與戊乙蘊去氫主l孟子甘在醫藥治療上背景介紹 ...57

第二節研究動機...... ... ... ... ...兒

第二章材料與方法 ...59 第三章結果...... ... ... ... ... ...ω 第四章討論...... ... ... ... ... ... ... ...

...“

圖表及說明 ...70 參考文獻... ... ... c.... ... ...“

(Ac)sGP AFBl APl APS CCT cA1víP DEPC EDTA EGTA FBS GAPDH GP MOPS ODC PDBu PKA PKC PMSF PSN PTK SDS TCA

TE孔但D

TPA Tris

縮寫表

penta母cetyl geniposide aflatoxin B ¹

activation protein 1 ammonium persulfate crocetm

cyclic 3'5'-adenosÍne monophosphate diethylpyrocarbonate

dthylene diamine tetraacetic acid N

fe叫ta叫1 bov叮m senun

glyceraldehyde hydrogenase geniposide

morpholinopropane sulfonic acid

orr立thine decarbm可lase

phorbol dibutyTate protein kinase A protein kinase C

phenylmethylsulfonyl fluoride

penicellin-streptomycine-neomycine protein tyrosine kinase

sodium dodecyl sulfate.

的chloroacetic acid

N，土FNJt，NN'

12-自.0-幢t記et甘radecanoy抖1-13-acetate.

T ris(hydroxymethyl)-aminomethane

第一部份

藏紅酸對癌促進作用的分子機制之研究

-2-

中文摘要

藏紅酸分離自中禁槌子的種子萃取物，在結構上鳥類胡蘿蔔素的 衍生物。本實驗室過去的研究發現藏紅酸具有抑制由 TPA誘導產生的

老鼠皮膚癌的效泉，本篇貝11 史進一步探討藏紅援抑制 TPA癌促進作用 的機制。我們以 TPA 單獨處理老鼠的纖維母細胞們IH 3T3) 時， protein

kinase C 會從細胞質轉位到細胞膜。將細胞預先處理60 及 120μM 的藏

紅酸 15 分鐘可以抑制被TPA誘導至細胞膜上的 PKC 活性，活性降低的

百分比為 50%及66% '但是藏紅酸並不會影響 PKC 的蛋白質量。事先 處理藏紅酸的分鐘也可以抑制約 25%PDBu與PKC 結合的能力。里JTPA 誘增的 PKC 活性而磷自主化的受質之一 :80kDa蛋白的量可以被預先以

30 、 60及 120μM處理的藏紅駿抑制達 77% 、 84%及91% 。而由 TPA誘 導的 C-Jl泊， c-fos 的表現也可以被藏紅駿有效的抑制。由本為結泉我們 推論藏紅酸抑制 TPA誘發的癌促進作用的分子機轉可能經由抑制 PKC 傳導而降低 c-.J凹的‘fos原致癌基茵的表現。

-3-

Abs甘誨的

Crocetin is a carotenoid isolated from the seeds of Gαrdeniα jωminoides. Our previous experiments found that it is a potent inhibitor of tumor promotion induced by 12-0個tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) in mouse skin. When mouse fibroblast cel1s (NIH 叮叮 were treated with TP A alone, protein kinase C (PKC) translocated from the cytosolic fraction to the particulate fraction. Pretreatment with 60 and 120μ 恥1 crocetin for

的 min inhibited TPA個induced PKC activity in particulate fraction by 500/0, and 66% did not affect the level of PKC protein. Pretreatment of cel1s with crocetin inhibited the

[3H]中horbol

dibutyrate (PDBu)-binding capacity of PKC by -25%. The increase in TPA-induced PKC subs甘ate

80kDa phosphorylation could be inhibited by the pretreatment of crocetin ( 30多 60 or 120μM) in intake fibroblast cells by 77, 84, or 91%,

respectively. Suppression of the TPA- induced c-jun and c-fos gene expression by pretreatment of crocetin in mouse fibroblast cel1s was also found.These findings suggest the inhibition of crocetin on TPA-induced tumor promotion via a mechanism which inhibits c-jun/c-fos gene expresslOn 伽oughPKC signaling .

"吽a

第一章緒論

.主也，明

月3 品

根據衛生著統計資料顯示，近年來惡性腫瘤高居圈人十大死因 之首，一般人皆談癌色變，而癌症的發生並非一疏而成的。流行病 學的研究顯示百分之九十的癌症起因於環境中的化學致癌物，而致

癌的過程必須經過三大步驟: (i) .Initiation: 細胞受到化學致癌物或其代 謝物的傷害。 (ii).Promotion: 此階段受損傷的細胞受癌促進西子攻 擊?而加強了訊息傳遞，或活化不同的致癌基因促使細胞分裂速率

改變。 (iii) .Progression: 刺激持續進行，造成基因結構改變或功能異 常，最後導致生長加速、細胞轉型而形成惡為質細胞。因此形成癌 症須要頗長的時間，我們只要能避免玟癌物的攻擊乳抑制癌促進作 用，則可防止癌症的發生(1)。

本篇實驗採用最常使用的一種癌促進劑， TPA~ 誘發自子 (2) , 利用 TPA促癌的分子機制為模式，探討棍子成分中藏紅酸對 TPA誘 發PKC訊息傳遞及活化原致癌基因的影響。

-5胸

第一節藏紅設在醫藥治療上背景介紹

藏紅呂立(Crocetin) 是中禁梭子 (Gardeniajωminoid Ellis) 的主要成分 之一，其結構屬於類胡蘿蔔素之衍生物 (fig. 1.) ，早期用來作為食用

色素，常被添加於糖泉、甜點、冰棒或飲料中，使食品呈現橘紅

色。梳子在漢禁中廣泛使用於黃蓮解毒湯、茵陳萬湯、力口味逍遙

散、補肝散等約 47 齊~(3 ， 4) 。槌子萃取物可以降低四氣化碳引起的毒 性及急性肝損傷 (5) 。過去的研究顯示藏紅酸能夠抑制受病毒感染所 引起的雞腫瘤 (6) ，降低腫瘤細胞在老鼠體內的增殖(7) ，藏紅吾友尚可

抑制 C6 腦瘤細胞血癌細胞T立-60 的生長分化 (8， 9) ，此外多種惡病質 細胞如子宮頸癌細胞(HeLa) 、肺部腺瘤細胞A549 '及SV40 感染的肺

纖維母細胞 VA13 皆可被藏紅酸透過抑制其RNA polymerase II 活性而 抑制核授、蛋白質之合成 (10) 。

本實驗室的研究證實藏紅酸可以降低化學致癌物Af1ato治n Bl 所 誘導產生的致肝癌作用(1 1) ，亦有效的提高肝中 GST 、 GSH及GSH­

PX等解毒酵索活性，抑制Af1at。如1 B1-DNA加成物的形成(12， 13) ，最

近的研究以 B[a]P為 initìator

'

TPA$;promoter 塗抹在CD輔 1 mìce 皮膚上

可導致orinìthine decarboxylase(ODC) 活性增加，並形成皮膚乳頭狀腫 瘤 (s組n popilloma) ，藏紅酸可以抑制 70-80% 由 TPA 引起的瘤促進作

用，及約的%的發炎反應(1 4) 。

“6-

第二節 TPA 的癌促進作用

壹、 TPA 的來源

TPA 全名為 1 之間。-Tetradecanoyl Phorbol-13 咀Acetate(Fig.2) ，是從

Croton Tiglium 的種子提鍊的己荳泊中萃取出的一種 phorbo1 ester ⁰ (2)

在典型的老鼠皮膚癌二階段促癌實驗中， phorbol ester可以促使已被 initiation 的皮膚癌化提前，並 f吏腫瘤數目增加(1 5) 。而以細胞株為模 式的研究中: TPA 可以促進 NIH 3了3 及 C3日 10T 1I2 細胞的轉型作用

(transformation) (16,17) ⁰ TPA~ 一種很強的痞促進物質，本身不具致 癌力，但可以促進化學致癌物的致癌作用，在癌促進研究的系統中 廣泛使用於致悉機轉及抑制禁物阻斷路徑的探討。

貳、 TPA 引起Protein

Ki

nase C 活化的機制

在許多細胞實驗系統中得知 phorbol ester會造細胞內生化現萃的 改變(1 8) 。例如:加強生長因子、荷爾蒙、 EGF receptor 、Insulin 及

insulin-like growth factor receptor 等之表現，並可以使 ODC 、

plasminogen activator 、 glycoprotein 、 calcitonin.. .等基因表現加強，而 這一系列的反應大多 J潔白 phorbo1 ester 造成鈣離子的流動及PKC 的活 化作用。

PKC 由肌醇磷脂 (inosítol phospholipid) 分解而來，在穿透細胞膜 的訊息傳遞系統上扮演相當重要的角色 (20) ，在此系統中，當外來

物與膜上相關接受器作用後?導致具特異性的 phospholipase C (PLC)

去水解 phosphatidylinosito 1-4， 5也iphosphateσIP2) 產生Ínositol

-7-

triphosphate

(IP 3 ) 及diacylglycerol (DAG)

^,

IP3 溶解於細胞質促使財存

的鈣離子釋放而增加細胞中鈣濃度，親脂性的 DAGJJ'J 留在膜上，此 時細胞質內的 protein kinase C 會移動到細胞膜上與 DAG 、鈣、磷脂 質形成複合體 (fig.3.) (20) ，當 PKC 轉位至IJ 膜上時會造成細胞內特殊 蛋白質如 :p80/87 kDa ' 68kD a 立足 Marcks 等的磷酸化而引起訊息傳遞 (18) 。

PKC 的結構包函具 protein kinase ì:舌性區約 50kDa及調節區約 30-

35kDa '調節昆含有結合位置，可與 DAG 、鈣、磷脂質結合。 TPA 的部分結構與 DAG 類似，囡此刺激細胞後可迅速與 PKC 結合而啟動 下游的相關反應 (21) 。

參、 TPA與鈣離子在訊息傳遞過程中之關係

加入血清、 PDGF 、 PGF

2α

(prostaglandin

F

2α) 等生長自子處理纖 維母細胞會在很短的時間內造成鈣離子的流動，而引起細胞內鈣離

子的濃度的改變 (22) ，但是這種現家並不會發生在EGF或 TPA處理的 細胞 (23 ，24) ⁰ TPA在訊息傳遞過程中的角色類似 DAG 的作用，雖然 造成 PKC 的活化，但是也會抑制 PIP

2

^{的水解酵素}phospholipase C 的 活性(25) ，囡此 thrombin透過G protein 中 G

q

^、

^G

^{泣而活化PLC 的傳遞會}

被TPA阻斷(26 , 27) ，例如:在血小板活化的系統，會由於TPA 的加 入而抑制 thrombin 引起鈣離子的釋放(28) 。

“8-

肆、 TPA與厚、致痞基因 c-jun及c-fos 的關係

所謂原致癌基因 (protooncogene) 是指存在於正常細胞的一段基 函，平時有正常的生理功能，但當外界有系種刺激時可激發其大量

表現，基因過度活化的結泉使細胞變形或增生，亦可能因為毒的感 朵而使系段基因被插入為失導致生成融合蛋白質而參與癌症的形成

(29) 。

1987年 Maki 在小雞白發性肉瘤細胞中分離出一種反轉錄病毒，

其中含有一段具有轉形能力的基函，命名為 v-jun(30) ，其蛋白產物 的 C 端與酵母菌轉錄自子 GCN4 的 DNA 結合展具有相當高的相似 性，而在正常細胞中也存在著一段相對庭、的 c-j unJ，?-、致癌基函，其基 因產物為構成轉錄茵子AP-1(Activator protein 1) 的成員，執行細胞內 的轉錄作用 (31) 。

而 v-fos 最早是從鼠類的反轉錄病毒 osteosarcoma virus 中所分離 出來的，正常細胞中亦有相持應、的 c-fos原致癌基因具有調節轉錄的

功能 (32) ⁰ c-fos 基園的表現是細胞受刺激後早期的反應， c-fos 基囡 的表現受其上游三個調節區控制，此三個區域分別為 (i).TATA

Box ' (ii).c-fos 基本表現調控晨，色含一段受 cA孔。調控的昆域，

(CRE)及一段GC rich 的序列， (iii). 加強表現區，此監舍一段封稱序歹IJ DSE' 又稱TR丘，主要受到生長因子、 TPA 、氧化物....等刺激而表 現(33) 。

TPA誘導基因大量轉錄是構成痞促進作用的重要因素， c-fos 5'端 的特定序列 5心TGAG/CTCA-3 即~TP A response element(TRE) ，受 TPA刺激後加強表現的區成 (34) ⁰ TRE 受到 TPA刺激導致 fos gene 表 現， TPA刺激，使c主os 增加?且PKC 又使c-Jun蛋白的 C 端去磷駿化而活 化，促使AP-1 以 JunlFos形式存在 (35) ⁰ Foe與 Jun 以 Liucine Zipper 的結

哺9-

構組成複合體， C-Jilll 基因又受 AP-l 的轉錄調節而變續活化， AP-l

復隨Jilll及Fos 蛋白在細胞內含量的消長而漸漸改變其組成， c-fos 表 現隨時向而降低時， J叮叮os 的組合被取代以 Jilll 的同質體或異質體

(如 :J也11)/J

un,

^{J unB/ J} illl) 的形態與 AP-l 結合區呈結合 (35 ， 36) ，因此 TPA 透過 AP-l 的轉錄活化達到癌促進作用的效果

-10-

第三節研究動機

本實驗室最近的研究發現以 B 凶P為 initiator ' TP A為 promoter 塗抹 在 CD仆ITllce 皮膚上可導致。吐白thine decarboxylase(ODC) 活性增加，

並形成皮膚乳頭狀腫瘤 (s垣n popilloma) ，藏紅喜交可以抑制 70且 80% 的 痞促進作用，及約 80% 的發炎反應(1 4) 。

為了探討 Crocetin抑制 TPA 引起老鼠皮膚腫瘤可能的分子機制，

我們根據已知 TPA 所引起細胞內的各種可能的反應加以深討，本部 份將重點放在TPA 引起protein kinase C 活性的路徑加以深討。

-11-

第二章 材料與方法

第一節 實驗材料

安、禁品試劑:

1 下列產品購自美國 Sigma化學 2: 司

Phenylmethylsulfunyl floxide (PMSF) 歹 Guanidinium thiocyanate^, Sodium citrate,Sarcosyl, 2-mercaptoethan仗， Sodium acetate, F ormaldehy咐，

formamide, Ethidium Bromide, Bromophenol blue, Xylene cyanol,

Glycerol^, Ficoll (Type 400 pharmacta)^, Polyvinylpyrolidion^, Bovine serum albumin (fraction V), Salmon sperm DNA' Sucrose, Triton-lOO,

Leupept

in,

Histon Hl (Type 阻 -S)， Phosphatidyl-serir嗨， 1 ，2EDioieirL

Crocet

in,

Morpholinopropane sultonic acid (MOPS), N,N,N\N'- tetramethyl ethyenediamide (EGTA) , 12-o-te甘adoconoylphorbol-13 圓

acetate (TP A), DiethylpyrocarbonuteρEPC)， Trichloroacetic acid (TCA), Ampicilline, Isoamylalcohol ⁰

2. 以下蔡品購白德國 E.Merck'Ä司:

diaminete甘aacetic acid (EDTA), DEAE cellulose, Ethanol ⁰

3. 以下產品購自美密 Bio-Rad去司:

protin assay dye reagent^, Acrylamide^, Bis-acryl缸白白，

Ammoniumpersulfate, N^,N^,N^,N -tetramethyl ethylenediamide(TEMED) Glycine, Sodium dodecyl sulfate (SDS), N-C parer, Zeta paper, T泣s­

HClo

-12也

4. 以下產品購自美麗 Boenringer Mannreim (B M)'Ä司

QIAGEN kit, EcoRI , Pst 1 ⁰

5. 以下產品購自德國 GffiCO 'Ä司:

D恥伍 medium， Fetal Calf serum, L-glutamin, Trypsin占DTA， Penicellin- streptomycine-neomycine (pSN), HEPES 。

6. 下列產品購自美國Amersham去司:

[γ32p]ATP，

[a 32p]dCTP, eH]PDB

u,

X-rayfilm ⁰

7 下歹IJ 產品購自美商 Oncogone Science位司:

Random primer labeling system 。

-13-

貳、常用緩衝溶液及培養液之百己製:

1.Phosphate buffer saline (PBS)

0.15卸fNaCl

2.7mM KCl

1. 5m卸fKH₂P0₄ 8.1mMNa2HP04

2.SSC(20X) :每去升合下列成份

173.5g NaCl

88.2g Sodium citrate

3. Denhardt's solution (50X) :每 100 ml 令下列成份

5g Ficoll 400

5g Polyvinylpyrolidone 5gBSA

以上成份均勻溶解後以 0 .45μm 的過;這膜過連一次，再以 0.22μm 的 過濾膜過濾一次，分裝成小包裝，財存於-70⁰C '待用。

4.D恥1EM

取出可配製-'h'升的 D恥1EM粉末?加入3.屯的疾酸氫銷?先;容於 'J 、於 一去升的去離子水中，調 pH 至 7.3 0 加去離子水至-'h'升，過濾滅

圈。

-14-

5.L8 medium :每 2 升合下列成份

10g Bacto-tryptone 5g Bacto-yeast extract 5g NaCl

6.LB plate with ampicil1in :

每"h升 LB medíum加入 15g agar '同樣用 NaOH調 pH 至 7.5 '再高壓滅 菌，待溫度降至 55-C 後，加入適量的 ampicillin使濃度成 50μ g/ml ⁰ 搖勻後，在每個 100mm pe的 dish{~lJ 入約 25甜的 medium '當 agar 挺自 時，可係存在4⁰C 下約一個月。

7.RNArum也19buffer(lOX) : 4M Guanídiníum thíocyanate 25mM Sodium Ci甘ate pH7.0 0.5 % Sarcosyl

O.lM 2-mercaptoethanol

250 g Guanídiníum thiocyanat 5容在 293ml 的 DEPC 水加入 1M Sodium citrate 13.2 ml在加入 10% Sarcosyl 26.4 ml '的。溶解後於室財存 3個

月，使用前再加2呵mercaptoethanol 。

8.Electrode buffer(5X) : 1 "h升緩衝液含有

15.12g Tris pH8.3 72g Glycine

5gSDS

-15個

9.Protein transfer buffer :每 1 升含有

15.12g Tris pH8.3 72g Glycine

100 ml Methanol

10.TBST buffer :每 1 升含有

12.1g Tris pH7.4 1 ml Tween-20 9gNaCl

-16-

參、常用儀器材料:

倒立顯微鏡 :Nikon Diaphot 300

細胞培養箱 :Nuaire AutoFluo C02 Water-Jacked Incubator

無菌操作台 :Nuaire Type 必也 3 Nu425-400

旋渦採盪器 :Thermo也Bath601 A

蓋格計數器 :Series 900 mini-monitor

乾浴槽 :Fisher Scientific dry Bath

採盪 7}之浴糟 :Yihdem shaker bath BT 150

超音波洗淨器 :Branson 8210

組織研磨棒 :Eyela Mazelaz

加熱攪拌器 :Coming StirrerlHotplate

烘箱 :Memmert 9 Tensit 3

高遠離心機 :Sigma 2k15

超高遠離心機 :BeckmanTL100

水平式電泳槽 :Bio-Rad DNA sub Cells

垂直式電泳槽 :Bio-Rad Protein II xi

電源、供應器 :Bio-Rad computer power supply Mode13000 Xi pH meter:Jenco microcomputer moed16200

閃烽計數器:AlokaLSC-900

X光感片:Am\Vfsham x-ray autoradiography fihn

感光夾 :Okamotyo 8x10

高壓殺菌宣告 :Tomin TM 322

-17-

天平 :Me位lerAE 240

光譜儀:Hitachi u3210 Spectrophotometer

硝化纖維紙 :Bio-Rad Zeta-Probe Membrane 162-0159 Bio-Rad Nitrocellulose menbrane 162-0115

NA-45膜 :Schleicher and Schuel

共輒焦雷射掙瞄電子顯微鏡: Zeiss LSM 410

-18-

第二節實驗方法

安、細胞培養:

老鼠纖維母細胞Nll叮叮培養於含 10% FCS-DI'v伍 medium( GrnCO )

的 80cm^{2 培養瓶中 內含} 100 unit/m1 penecillin; 100μglm1

Streptomycin; 18μglml neomycin及2mM的 L-glutamin ( GrnCO ) ，將培 養瓶置於37⁰C ;待細胞長滿，將培養基抽乾，先以 PBS 清洗細胞表層 兩次後，加入 1ml' 0.05% T:rypsin-0.02% EDTA '把細胞從培養瓶打 下再加入 10ml DI'v1E medium '將細胞均勻化，留少許的細胞在原培養 瓶繼續培養。其餘的細胞依實驗目的不同，均勻的分配到不同大小的 培養血，或是種到新的培養瓶中繁殖。

貳、細胞內蛋白磷酸化反應 (38， 39)

A. 細胞的前處理

種細胞於6-well培養且上，每個 well 含5X 10

⁵個細胞，細胞長滿後 換以0.5% FCS D恥1E medium進行Serum starvation 24 小時，再將培養基 移去，以 PBS 清洗兩次，加入 0.5m1不合磷酸根離子的 Dìv伍 medium

( phosphate free medium )再加 200J.lCi/m1 Pi 至每一well '於37⁰C 下培養 3.5 小時，終止反應前以各種濃度的 crocetin 前處理 15 分鐘後再加入 TPA處理20 分鐘。

-19個

B. 細胞內容物之萃取:

反應後培養且這支置冰上，小心抽出含有凹的培養基，以 Washing

Buffer ( 0.15M NaCl ' 20mM Tris pH7.5 )清洗三次。加入冰冷的 5%

TCA 萃取 10 分鐘，重覆此動作兩次，使細胞中游離磷酸根流出細胞 外。再以 Washing buffer清洗兩次多隨後加入 1 00~1 Lysis buffer( 10mM

NaH2P04 ' 5mM PMSF ' 10mM EDTA ' 5mM EGTA ' 10mM NaF '

100mM sodium pyrophosphate ' 10/0 Triton X-1 00 ' 0.15M NaCl ' pH7.5 )

至每一 well '讓細胞在冰上與 lysis buffer作用 30 分鐘。將細胞 j容破後吸 出，置入 1.5ml離心管中，以吟， 00旬， 4⁰

C

'離心 10 分鐘，將sample 上 清液取出，按著將上清液以 100⁰C 煮沸 10 分錯，再以 12， 000g離心 10 分 錢後，抽出上清液，加入2 倍體積的 acetone 置於咽鈞。C 沉澱至隔天，再

以 12， 000g離心，除去 acetone上清液，蛋白質沉澱以 PBS 溶解。

c. 蛋白質定量:

取5~1溶液加入Bio-Rad protein assay dye 200~1 '補蒸餾水至 1ml '

於室溫反應 10 分鐘 ， ì吋 595nm 吸光值，以 bovin serum albumin 為標準 液換算蛋白質濃度。再取20峙的蛋白質樣本?加入等體積的兩倍 SDS

protein loading buffer ( 100mM Tris pH6.8 ' 50mM 2-mercaptoethanol ' 4% SDS ' 0.2% bromophenol blue ' 20% glycerol )

，於 100

⁰

C 煮沸 5 分鐘

後，迅速放回冰上，等待loading ⁰

“20-

D. 蛋白電泳:

(40)

將電泳玻片洗淨，烘乾擦拭乾淨後，利用約 0.75mm spacer $;閑時 裝好電泳片，製備 separating gel '取 10ml 30% acrylamide/0.8% bis 7.5ml ' 1.5M Tris-HCl pH8.8 ' 12.5ml d

2

^{日20 ' 100μ1} 10% AmmonÍum persulfate (AP) 及 12μ1 TEl'v包D' 混合均勻後迅速倒入電泳片中， I直到 波晶距離 well 約 1.5cm處為止，加入去離子水，覆蓋液晶，待膠體凝自

後，將上層的水倒掉，再開始製備 stac祖ng gel '其配方為 2.6ml 30%

acrylamide/0.8% bis ' 2.5ml 0.5M Tris-Hc1 pH6.8 ' 6.1ml d₂H₂0 ' 50μi AP 及 10μ1 TEMED '混合均勻後，將電泳齒梳插入電泳片中，倒入 stac組ng gel '若有氣泡，則上下移動齒梳，使氣泡離開 gel '待 stacking gel疑囝後，拔掉齒梳，周二次水清洗well數次，準備 loading sample ⁰

用毛細管 tips將蛋白質樣本小心的加至每個 wel1中。用塑膠滴管取

一倍的 SDS 電泳緩衝液( Tris 0.025M ' pH8.3 ' glycine 0.192M ' SDS 0.10/0) .J 、心的將每一個 well填滿，避免樣品被激出，將上、下電泳槽加 入一倍的 SDS 電泳緩衝液至電導線被蓋過為止。將電 J潭、供應器與電泳 槽相連，打聞電源。開始時以 15mA的電流跑 Stacking gell直到色帶跑

至 Stac垣nggel 與 Separating gel 的交界處，調整電流為 30mA '當色帶跑 至底線時，才停止電泳。

將跑完電泳的膠片取出，於其背面附上 5 層 3ÌV岱f 的波、紙後，在電

泳土方蓋一層係鮮膜，放入膠體乾烽機， 80⁰C 下真空加熱 30 分鐘。依 膠片上輻射的強度決定X光惑片( Amersham )的感光時間，將膠體與 X 光感光底片放入曝光夾後，置於-70⁰C 曝光。至預定時間時在暗房將 X 光片從曝光夾中取出?浸入顯影液中漂動數分鐘?待影像呈現通

-21-

當，立即放入自來 7位中使反應停止，將水分f盡量滴乾後，浸入定影液 10 分鐘然後用自來水沖洗X 光片 5 分鐘，時、乾，即可判讀結泉。

參、 [3明PDBu與細胞膜結合能力的測試(41)

種 5 X 10^5的NIH3T3 細胞至 6-well 培養血中，至細胞長滿後，換以

0.5% FCS D:l\住 medium在37⁰C 下培養24 小時，進行 Serum starvation 0 將 上述培養基抽乾以 PBS 沖洗，換以 0.5ml 不合 FCS 的 DI'v伍 medium '然後 每刮目 wells~ 一組加入不同濃度的 crocetin處理 15 分鐘後，再於每一個

well 中加入O MCi 的 e月PDBu

(

20凶吐)處理 5 分鐘。將每一組細胞再分為

兩組，其中一組加入 2μM 的 TPA( ißIJ 非專一性結合) ，另一經不加

TPA( ißIJ 1旱的數位為 eH]PDBu 的總結合量) ，再於37⁰C 培養5 分鐘，待反 應結束，用冰冷的 PBS 沖洗細胞兩次。每一 well加入 1ml ' 1N 的 NaO日，

將細胞溶破，將此細胞 j容出液收集至閃練計數瓶，再加入 1ml lN 的 HCl

使待 ißIJ;夜呈中性，然後加 lml 的閃練計數 j夜 5ßIJ 定其放射量。將每組沒有 加 TPA 的扣除加了 TPA 的數值，即為細胞與 e月PDBu特異結合的量。

肆、 Protein

Ki

nase C 的活性測定(是2)

A. Protein Ki盟ase C 的萃取

種植連當數目的 NIH3T3 細胞於直徑 100mm 的培養旦中，待細胞長主

入分滿後 Serum Starvation 36-48 小時，每三盤一組，加入不同濃度的 crocetin處理的分鐘，再加入 TPA培養的分鐘，用 PBS buffer洗兩次，再

用 buffer A ( Tris 20mM ' pH7.5 ' 2mM EDTA ' O.5mM EGTA ' 0.3M Sucrose ' 2mM PMSF ) ，將細胞舌IJ 下來，用均質機磨約 20 下?此均質液

個22-

在 4⁰C 下以 100， 000g轉遠離心 1 小時，離，心後所得的上清液先時存於-70

。C 冰箱，此即為 cytosolic fractions 0 沉澱部份則加入buffer B (即合 0 .3%

Trito凶(-100 之buffer A ) 1ml '用起者波震盪器震愛數次，接著;水浴 l 小 時，加入 buffer A 2ml 使 Trito的(-100 的濃度為 0 .1% '然後用超高遠離 心， 100,000 g' 4

vC

'離，心 1 小時，所得之上清液部份即為 particulate 企action '買?存於-70⁰C ⁰

B.

Protein Kinase

C 的純1t:

利用 DEAE cel1ulose 來純化 Protein Kinase C '先將DEAE-Celllulose

以 20mM pH7 .4的 Tris buffer 處理，然後填充約 1 'Ä'分高至直徑。 .5 'Ä'分

高的玻璃管柱中，用 wash bu芷er ( Tris-HCl 20mM pH7.4 ' EDTA 2mM ' 2-mercaptoethenol 50m恥l' EGTA 0.5mM ' PMSF 2mM ' Leupeptin

25μg/ml ) 10ml 沖洗，倒入已萃取出的 cytosolic 或 particulate 之Protein

kinase C 粗萃取液，接著用 12闊的 washing buffer 沖洗，再用 Elucted buffer( 即合 120mM KCl 的 washing buffer ) 0.25ml 沖洗，最後用 0.5ml 的

Elucted buffer 沖洗，並收集沖出液，此即為純化後之PKC 。再利用 Bio­

Rad 595 Protein assay kit來測定蛋白質含章，並以 alb叮叮n~stand位d來定 量。

峭23 崎

C. Protei盟Ki且ase C 活性的湖定 (43)

PKC 活性的測定利用 PKC 催化 [γ32p]ATP 的 phosphate 轉移至Histone 上， 來測定 PKC 的活性，反應首先將實驗組試劑( 5μM Tris-HCI pH7.4 ' 2μM MgClz ' 0.75μg 1,2diolein ' 10jJ.g Leupept泊， 10μg

phosphatidylserine ' 0 .3 5μM CaClz ' 0 .1 2μ孔1 EGTA ' 40μg Lysine耐rich

Histone ' 5 jJ.M A TP , 400fM

[γ32p]A

TP ; ( 4000cpml pmole

)加入試管中

j r，和均勻。

好照組部分則以 2mM Tris取代 phosphotidyl-serin 及 1 ， 2 diolein '再加 入由 DEAE cellulose 純化出來的 sample 50凶，最後加入以 20mM pH 7.4

的 Tris 稀釋的 [i

²

p]ATP

200 f mole '

50μ1( 2μCi

)

，將各組反應液混合均 勻於 30

⁰

C 下，水浴 3 分鐘，迅速加入 1μg/μ1

BSA

50μi 及冰的 20%TCA

( Trichloric acetic acid ) 1ml 終止反應，以 0 .45μ血的過波、膜過法，最後以 3ml 的 1 0/0 TCAì:先5 次，將過濾、膜夾入塑膠小管，加入2ml 的閃爍計數 液?用 β-counter測定放射計量。

D.PKC 酵素比活性(

specific

ac說vity) 的計算

將實驗紐扣除對照、組cpm值，除以反應、時標定總放射劑量，再乘以

1000 f mole '得到的數值除以各組樣本的蛋白質含量及反應時間， PKC

活性以 p mollmg/minlt 單位表示。

-24-

伍、西方點墨吸潰法分析PKC 的轉位作用(是o '是3)

取 50μg PKC 萃取液加入 5μi 得 20% SDS ' 0.5 ).l1 的 2-mercaptoethanol 及 5μ1 loading dye ( 50 % glycerol ' 0.025 % bromophenol blue )混合均勻， 100

。C 加熱 5 分鐘使蛋白質變性，然後loading 至 10% 的 SDS PAGE( 參考前述

蛋白電泳的方法)。

電泳完畢後，將膠體浸入冰冷的 elestrotransfer buffer 10 分鐘，將膠體 平鋪在一張浸淫的 Whatman 3~必d濾紙上，然後再將預先浸 j瑩的硝化纖維 紙蓋在上面，再蓋上一張浸;愛的必心f 濾紙，用玻璃棒趕走其間的氣泡，

然後裝入 transfer holder 內，再產於事先裝滿甘ansfer buffer( 25mM T郎"

HCl ' pH8.3 ' 0.192M glycine ' 0.1 % SDS )的 eles甘0甘ansfer ta址( Hoefer )

以 4⁰C ' 100mA進行電轉移。

電轉移過夜後，將硝化纖維紙取出浸入 1 ml/cm 含有 3% 胎牛血清的

TBST:緩衝液( 10mM Tris丑CI ' pH8.0 ' 150mM NaCl ' 0.05%Tween-20 ) ，在室溫下搖動2 小時，然後以 TBST緩街液清洗兩次，每次 10 分鐘。加 入PKC antobody ( 100的購自 Promega 的 PKC antibody溶於含0.5% 胎牛血 清的 TBST 緩街液)於室溫下與硝化纖維紙作用 3.5 小時，再以 TBST 緩衝 波清洗兩次，每次 10 分鐘。與 primary antibody 作用後的硝化纖維紙再進 一步與 secondary antibody ( alkaline phosphatase-conjugated goat anti mouse

IgG' 約 0 .2μg/ml5容於合0.5% 胎牛血清的 TBST緩衝;夜)於室溫下與硝化纖 維紙作用 1 小時。

再以 TBST緩衝液清洗三次?每次 10 分鐘?最後將硝化纖維紙浸入受 質緩衝液 [20ml 受質緩街液( 100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgClz )加上7mg的Nitorbluete甘azolium( NBT )及5 mg的 5-bromo-4-cbùoro-

-25個

3-indolylphosphate( BCIP )]進行呈色反應，約 10-30 分鐘待色帶出現後再 用蒸餾水終止呈色反應並清洗之。

陸、北方點墨、吸潰法

A.DNA探針的製備:

c-jun mRNA 的 DNA:J家針是從pHJl 9 質體經限制酵素 PstI及EcoRI 切 耳又一段長約 1.lkb 的 DNA 片段，此段DNA 乃是相封於 c-Jun 蛋白的 DNA 結合區的去氧核甘駿序列 (44，45) , c-fos mRNA 探針則是用限制韓素Pst 1

從 pfos-1 質體切除的 DNA 片段 (46)' GAPDH mRNA 的 DNA探針是由 pIB I3 0 質體上，經PstI切下的一段長約 1 .25kb 的 DNA 片段，為此實驗中 所用的 intemal contro 1 (47) 。

本實驗是以英閻福盟主:司出品的 QIAGEN plasmid DNA抽取系統純

化plasmid DNA 0 取自;態培養基上單一菌落，接種於 5甜的 LB 培養液

(一升培養液中合 10g Bacto-trypton ' 5g Bacto-yeast extract ' 5g NaCl pH7.5 '每毫升的 LB medium 50Jlg的Ampicillin ) , 3

TC

' 的 o rpm' 過夜 培養，再以 1ml 菌液接入相間培養液的 Oml' 同樣條件下過夜培養後回

收。

將菌 r夜裝入離心管中，以 400。中m 離心 20 分鐘，倒掉上清液加入

10ml buffer P1 ( RNase A 100ug/ml ' 50mM Tris爛HCl ' 10mM EDTA pH8.0) ，使菌體完全懸浮之後加入 buffer P2 ( 200rnM NaOH ' 1 %SDS )

蓋上離心管萃，輕輕的搖晃離心管，使之均勻混合，在室溫下反應、 5 分 鐘，然後一邊搖晃離心管一邊加 10 ml 的 buffer P3 ( 2.55M KOAc '

翩26也

pH4.8 )在 4⁰C 下，轉遠大於 12， 000g 離心 30 分鐘，另外以 5ml buffer QB( 750mM NaCl ' 50mM MOPS '的 %ethanol ' pH7.0 ) )中洗 QUIGEN

column '使其離子平衡，再加入上述離心後的上清液，以 10 ml buffer

QC ( 1.0M NaCl ' 50mM MOPS '的% etham仗， pH7 ， 0) 沖 QUIGEN-pack- 100 兩次，再用 5ml 的 buffer QF ( 1.2M NaCl ' 50mM MOPS '的%

ethanol ' pH8.0 )將 DNA 沖出，加入 0.5倍 DNA 沖出液體積的 ispropanol '

在室溫反應至少 15 分鐘以泣， 00旬， 4⁰C '離，心 30 分鐘。

用 70 %酒精清洗DNA pell哎，再次的離心，倒掉上清液，將DNA~容 於適量的 TE buffer( pH8.0 ) ，測量A260/A2 80 的吸光鐘。先擬定要反應的 DNA及核酸限制酵素(l ur立印g)體積，由此計算 reaction buffer 的用量，並 用水補足反應體積，於37⁰C 下反應 1.] 、時以上，再以的。C 加熱 10 分鐘終

止反應，取 1μg DNA (約 1-2μ1) 以電泳按 i~'J 反應是否完全?再以 DEAE

cellulose membrane 回收DNA 片手丈(48) 。

剪裁大 .J 、通當的 membrane' 先以 10mM EDTA 洗 10分鐘，再以 0.5N NaOH洗5 分鐘，接著以無菌水快洗數次， 4⁰C 財存備用。再製備 0.8%

agarose gel '製備方法如下:稱取 0.2旬的 agarose '加入 30ml 的 0.5X TBE' 以微波加熱溶解，冷卻;至約 60^VC ' 加入20μi 的 EtBr ⁰

將agarose倒入置於水平台上之鑄膠模內，待膠體凝函，小心拔掉齒 梳，將膠體放入合 0.5 倍 TBE 緩衝液的電泳槽中，至 TBE 緩衝液蓋過膠

體。將反應完的 DNA加入十分之一倍體積的 DNA loading buff哎，注入繆 體的 well 中?以 5V/cm 進行電泳，以紫外光按視。當 DNA跑至適當距離

時，將活化後的 NA-45 membrane插入所要分離的 DNA前方( i丘正種處) 繼續電泳，以紫外燈確定DNA吸附於NA-45膜上。

取出 NA-45膜，用無菌水沖洗附著在膜上的 agarose 0 除去無 DNA 部

-27-

分之NA-4 5 膜以增加回收率，將 NA-45 膜放入 eppendorf 中，加入 300μi

TEN buffer ( 10rnM Tris pH8.0 ' O.lM NaCl ' 1rnM

EDTA) 在的。C 下加熱

30 分鐘，取出上述 TEN buffer '再加入 300Jll TEN '繼續在的。C 下加熱 30 分鐘?將膜置於 uv 燈下，確定 DNA 是否完全釋出，若尚未完全釋出身j 重覆以上步驟至 DNA 完全釋出為止。

將 j容於 TEN buffer 的 DNA 以等體積的 phenol: chlofonn:IAA (isoamyl alcohol) = 25:24:1 抽取兩次，加 2.5倍體積酒精沉澱，於-20⁰C 靜置隔夜，

或於-70⁰C 靜置 1 ， J 、時，真空乾漂(但不可太乾，否則 DNA將不易溶解) ,

溶於適量無菌水中異于放於輛20⁰C 備用。

探針的來涼為 C-J Ull、 c-fos和 GADPH之mRNA 的 DNA' 深針的製備是 利用Amersham "h司出品的 Multiprime DNA labeling systems 製造，其捧 作步驟如下:取 1μg specific DNA探針，加入7-16μl水中 (DNA加水的總 體積等於 17μ1 )在 100⁰C 下進行變性反應( Denaturation ) 2 分鐘，再放置 冰上5 分鐘。

依序加入 5μ1 concentrated reaction buff哎， 5μ1 random primer '再加標 記的 dNTP各4凶， 5 叫世ts klenow enzyme 及5μ1 [α32p]dCTP( . .50μCi) 均 勻混合。在37⁰C 下反應、至少 1 小時，加入5凶， 0.5M EDTA ( pH8.0 )來停 止反應。標熾DNA深針的分離利用 gel fil仕ation的原理(49) ，先取 1ml 的注 射針筒將其底部塞入適量的玻璃棉，加入已被 TEN buffer 平衡的

Sephadex G-50於針筒內，將此針筒放入的甜的塑膠離心管內，在室溫下

以 1600g( 3000rpm )離心 3 分鐘書在加入 100μi 的 TEN buff缸，重覆離，心數 次，直至lJG回到留在針筒的體積約 0.9加i為止，另取一根塑膠管，先放入去

蓋的1. 5 ml 塑膠離心管，再將填充好G-50 的針筒放進去?加入 50μ1 TEN

buffer 於前述已標幟的 DNAJ家針中，混合均勻後全部加入針筒內?重覆

-28 個

上述的離心步驟。小心的取出去萃的1. 5 mI 塑膠離心管，取 1μ1加入 3mI 閃煒計數 l'夜， ì如j 量 32p 的 cpm佳，將其餘樣品， J 、心蓋好，放於♂ OOc 財存。

B. TotaI RL~A 的抽取(50)

先將NIH 3T3 cells 種於 100mm 的培養且中，待細胞長滿後進行serum

starvation 24 小時，加入各種濃度的 crocetin處理細胞的分鐘，再加入

TPA處理細胞 60 分鐘抽取c-jun mRNA '或將細胞以 TPA 處理細胞 30 分 鐘，抽耳叉c-fos mRNAo 細胞處理完畢後，吸掉mediwn '再用冰冷的 PBS 沖洗細胞兩次。

加入 2ml 的 Solution D ( 4M Guanidiniwn thiocyna肘， 25mM Sodiumcitrate ' 0.50/0 Sarcosyl ' O.1M 2-mercaptoethanoI

)至每一個培養

血，以 micro-pipetman 將細胞全完全打下，直入 5mI無菌 PP 塑膠管中依 次加入 0.2ml Sodium acetate ( 2M, pH4.0 ) ,

O

.4mI ' 1: 1 的 CHCh:

isoamylalcohol及2別的 phenol '用力搖晃幾秒，放到冰上靜置 1 分鐘，重 覆搖晃及靜置 20 分鐘，以 12000g' 4⁰C '離心 20 分鐘。

吸水層到新的制悅，加入等體積的 isopropanol 混合均勻，產於-20⁰C 下 1 小時，再以 12000g , 4⁰C '離心 20 分鐘，倒乾液體，以 0.5mI solution D 溶解沉澱物，重覆 isopropanol 沉澱及離心，最後用 75% 酒精清洗，向 上條件籬，心後將液體拍乾?加入 40凶， lmM ' EDTA 溶解， iß'J O.D

A260/A2 80' 計算RNA 的濃度及純度。

耐29-

C.RNA 電泳

以 1 .2%的 Agarose gel (每 100ml 合agarose 1 誨， 10ml ' 10倍RNA

nmning buffer:

O

.2M MOPS ' 10mM EDTA ' 50rru\1 sodium acetate '

pH7.0 多 l .2 %f ormaldehyde )分離 Total RNA '取20峙的 RNA樣本加入 25μ1 RNA denature buffer ( 2μ1 ' 5 倍. RNA nmning buffer ' 3.5μi formal吐ehyde ' 10μ1 forma1mide ' 1μ1 1 Jlg/μ1 EtBr) 於的。C 加熱 15 分鐘後，

立封置於冰浴冷卻，每個樣品中加十分之一體積的 loading buffer ( 0.4%

xylene cyanol ' 0.4% bromophenol blue ' 50% glycerol ' 1mM EDTA ) ，電 泳槽中倒入 RNA nmning buffer 使膠體剛好被覆蓋住，將上述準備好的 RNA樣品注入well 中，以 5V/cm' 進行電泳，至 leading dye跑到膠體長度 之四分之三處，停止電泳，以拍立得相機在紫外光的照射下拍攝R封A 的

電泳圈。

將RNA 膠體浸泡 50mM NaOHlI0mM NaCl 中 30 分鐘， 100 mM T郎"

HCl 中 30 分鐘 ， i吏RNA上的 formaldehyde被去玲。剪取與膠體大， J 、相同的

硝化纖維紙及扎位在洛紙，前者以 2 倍 SSC buffú ( 0.3M NaCl ' 0.03M sodium citrate )浸泡，後者以 20倍 SSC buffer浸泡，取適當淺槽，以玻鴉

片或其他文架，橫架於榜上，剪一條此心f波、紙放置文架上，兩端垂下，

接觸淺槽底部，於淺槽中倒入20倍 SSC buffer使波體深約 1cm' 蓋過品也在 波、紙下垂部份，使毛細現象充分進行。

再將膠體產於蓋有漣紙的支架上，勿夾入氣泡，把硝化纖維紙置於 膠體上，再將浸濕之濾紙置於硝化纖維紙，將氣?包趕走，於波、紙上覆一 疊吸水紙?再於其上蓋一片玫漓，並放置約 500 克的重物於玻璃片上。

在室溫下轉印 24 小時後畫下每一個 well 的位置?以兩張;蓮、紙夾住轉印

刁。"

膜，於 80⁰C 真空烘烤兩小時後，保存於乾埠處。

D. 雜交反應

將烘烤好的硝化纖維紙以 2倍 SSC buffer浸濕，捲入 Hybridization tube

中，倒入 2 倍 SSC buffer 使其展開，將 2 倍 SSC{jlJ 出，換入 hybridization

solution [6X SSC, 10X Denhart's reagent (50X Denhart's reagent 合 0.1%

Ficall ' 0.1 % bovine serum albumin ' 0.1 % polyvinyl pyrrolidone )

,

0.1 %SDS ' 50% fonnamide ' 50~g/ml denatured salmon spenn DNA ] ，直

入hybridization

oven ' 42⁰C

'反應 4-24 小時，取適量探針於95

⁰

C 加熱 5 分

鐘使其 dena何時，將 denature 後的尿針先置冰上 5 分鐘，再加入

prehybridization solution 中，繼續於位。C 下反應、 16-24 小時。將

hybridization solution倒出，依序加入 2X SSC / 0.1% SDS ; 0.5X SSC / 0.1% SDS 及 O.IX SSC / 0.1 %SDS 各於位。C 漂洗20 分鐘，直到游離的兩 位素漂流乾;爭為止。將硝化纖維紙取出用蓋革計數檢測是否有具特異性 強度的放射線帶出現，將雜交成功的硝化纖維紙以係鮮膜包好並排除水 氣，固定於感光夾中，於暗房中產入適當大小的 X 光片，再將感光夾置

於-70⁰C 冰箱，在-70⁰C壓片時間身1 dJ放射線強弱洪定 'X光片感光的結泉 由 Denstrometer定量。

-31 個

第三章結果

第一節 Croce出抑制由 TPA誘發細胞內的磷酸化作用

以 crocetin 前處理細胞 15 分鐘，再加入TPA處理細胞20 分鐘，觀 察細胞內蛋白磷酸化改變的情形。由 Fig.4.， TPA處理細胞後，使細 胞內蛋白質其誘發 80KDa protein 的磷竣比約為好照組的 30倍，以

不同濃度( 30， 60 及 120μM) 的藏紅酸前處理分別抑制 TPA誘發

80kDa protein ' 77.1 ' 83.9及 9 1. 2% 。顯示 crocetin對於TPA 引發的 細胞內 80kDa蛋白的磷酸化現家有很強的抑制作用。而 80kDa蛋白 為 PKC 的受質 (18) ，因此我們進一步探討藏紅酸背PKC 的影響。

第二節 Croce說B 降低TPA所誘發的 PKC 的活性

由第一個實驗我們證實 PKC 的受質磷酸化會受到 crocetin 的影 響，因此我們進一步將 120μM 的 crocetin前處理細胞的分鐘，再加 入 TPA 1 OOng/ml ~別處理的，的及30 分鐘後再分別收集 cytosol及 partic吐ate 的細胞萃取液測定 PKC 活性，結泉處理TPA15 分鍾的實

驗是且被 crocetin抑制的效呆最明顯 (fig.5.) 。於是我們繼續以 30 、 60 及 120μM 的 crocetin處理NIH3T3 細胞 15 分鐘，再加入TPA 100ng/ml

處理的分鐘，同樣的測定 cytosol及particulate 的細胞萃取液的 PKC 活性 (fig.6.) ⁰ crocetin確實可降低膜上 PKC 的活性，且呈抑制效泉

與劑量成正比，在 crocetin 濃度 120μM及60μM 皆具有統計上的意

豈是 -

我

-32喝

第三節 Croce說睡不會抑制 TPA誘發的 PKC轉位作用

crocetin抑制 PKC 的活性是否藉著降低細胞質的 PKC 轉位至細胞 膜上的量而或低活性呢?為了確定這個現象我們將 i~'jPKC 活性前

的細胞萃取物以 SDS PAGE 分離其蛋白質，並利用 αfonn 的 PKC 抗體測定細胞質及細胞膜上的 PKC 含量，由 fig.7. 可以明顯看出 來，對照、組的 PKC 幾乎都留在細胞質，而曾被 TPA處理過的組別 的 PKC 則大部份皆轉位到耳其上了。囡此推論PKC 活性的改變不是 徑由轉位作用而抑制。

第四節 Croce組誼會于擾 TPA與PKC:結合的能力

由以上實驗我們知道crocetin可能透過降低PKC在膜上的的活性 而抑制 TPA 的癌促進作用，這種抑制的效應、是否經由 crocetin干擾

TPA 與膜結合?因此本實驗採用油標定的 phorbol ester與細胞作 用，觀察 crocetin 是否會造成競爭性的抑制，由 Table 1 的結果可

知?以 60及 120μM處理細胞後，約降低29%

'

24%e日]PDBu與細

胞的結合能力。

第五節 Croce位B抑制 TPA所阻斷thro臨bin誘導釋放的鈣

離子含量

Thrombin會透過 G protein傳遞訊息，其造成鈣離子的釋放作用 會被 TPA 所抑制 (26，27) 。我們利用雷射共統焦電子顯微鏡觀察 Fluo-3 捕捉受 thrombin刺激造成細胞內質網釋放大量鈣離子或被 TPA F.斷的情形 o Thrombin加入對照組細胞後約的秒鈣離子開始

樹33-

釋放至細胞質，甚至進入細胞核。以前處理的分鐘 120μM 的戴紅 梭，再注入 100

n

g!

ml TP

A 分別處理細胞的分鐘、 20 分鐘、 25 分 鐘，觀察鈣的變化。我們以具有螢光亮度的細胞數目除以視野下

細胞總數，換算為鈣釋放百分比，作國 σig.8) ，在 TPA加入 20 分 鐘時， crocetin 抑制效泉最好σig.9， 10) 。接著我們以不同濃度的藏 紅酸處理細胞，再以 TPA處理20 分鐘，結果 60μM及 120μM 的戴紅 酸皆可使部份鈣離子再度被釋出 (Fig.11) ，更確定 crocetin抑制 TPA 的癌促進作用經由 PKC 的路徑。

第六節 Croce說E抑制 TPA誘增 cdHB?C圖fos 臨RNA的表現

Fig12. 顯示 crocetin前處理細胞的分鐘，再加入TPA 60 分鐘可以 誘發 c-jun mRNA 表現至最大量，將 c尹m mRNA 的表現量化以

GAPDH

mRNA 的量校正之後，可知以 30 、 60 及 120μM crocetin 對 TPA誘發的 c-jun mRNA 的表現分另付Cp 制 26.7% ' 28.9% 及74.3% 。類 似的結泉在 Fig13 ，TPA處理 30 分鐘誘發的 c-fos mRNA 表現上。鈞、

60 及 120μM crocetin 對 TPA誘發的 c-fos mRNA 的表現分別抑制 5 .4

% '29% 及44.2% 。

-34-

朵、細胞內鈣離子釋放的觀察( 26會27

)

A. 細胞的前處理:

種 10⁴個細胞於 35 mm 培養盤中，以 0.5% FCS DMEM 進行 Serum

Starvation 24 小時，將螢光 ~JFluo-3 50時溶於25μlDMSO 中，並與等體積 的 25% Pl旺。也c acid混合均勻，取2μi加入 O .5ml Dìv伍M 中，以此置換細 胞的培養基，於 37⁰C ' CO

z

^{培養箱培養}30 分鐘，再以充填過氧氣的等張

溶液( 140mM NaCl ' 2mM CaClz ' ^4.6mi\1 KCl ' 10mM glucose 及 10mM

HEPES ' pH 7.4 ) ，清洗三次，最後以 lml該溶液覆蓋細胞，加入 crocetin 於室溫下前處理的分鐘，再加入TPA作用，找出抑制效果最好的時間。

B. 以共統;最電子顯微鏡觀察鈣離子的釋放

將培養盤固定於共統焦電子顯微鏡觀察臺，先在可見光下調蟄焦聚 及適當的視野，然後將光源、固定系統轉換至雷射光波長 488nm 的條件，

並設定光澤每十秒掃描一次且連續觀 iß'1150 秒，直接將結果顯示於螢光 幕，電腦條件設定完成後，以直徑 lmm 塑膠管 ffv 針頭延長線，用 1ml 針

筒先吸入前述等張緩街液 100抖l 再抽取微量空氣，接著吸入 10凶 5迎世U 10μl 的 thrombin '將塑膠延長管接上事先由定於培養且周圍可深入細胞

液晶中的小塑膠管上，啟動先前設定條件的同時以針俺小心的注入

thrombin '並且以針筒反覆吸抽約 4 、 5 次，將連續掃描得到的影像存檔

並以電腦直接照像。接著以 crocetin~çp 會~TPA 最佳的時間再以不同濃度 crocetin與細胞作用?觀察crocetin與 TPA 、鈣離子的關係。

“ 35四

第四章討論

本實驗室最近由動物實驗模式證實 crocetin可預防 TPA 對 CD-l 老 鼠皮膚癌的促進作用(1 4) ，但其分子機制仍然未知。在這一部份實 驗，以老鼠纖維母細胞NIH3甘為材料，證實 crocetin可以明顯的抑制 TPA 所誘發 80kDa 蛋白質磷政化，及PKC 的活性， crocetin也會降低 [.)H]PDBu與細胞結合的能力，在基囚的層面， crocetin抑制 TPA 所誘

發的 c-Jun及c-fos 的表現量。

PKC 可以藉著 DAG 、 phorbol ester 、及其它 tumor promoter 的作用而 活化， PKC 透過階梯式的磷酸化作用造成細胞的增殖分裂及各種基茵

的表現(43) 。我們利用 PKC 的活化劑 (TPA)誘發PKC產生轉位作用，無 法被 crocetin 所抑制，但 PKC 磷酸化的受質 80kDa 蛋白質可大部份被

crocetin所抑制，且有劑量的依存性。 80kDa 蛋白，在許多纖維母細胞 的訊息傳遞研究中，被當成PKC 活化的指標 (51 ， 52) ，由這個結果可誰

知， TPA誘發PKC 的表現受到 crocetin 的影響。雖然 PKC 被 TPAì~舌化後 轉位的愛沒有因 crocet血的加入而減少，但細胞膜上PKC 的活性卻有意

義的降低 σig.5.) ，這與 curcumm 抑制 PKC 活性的情形相同 (53) 。由 e月PDBu與細胞結合的測試可知 crocetin抑制 PKC 活性的機轉約有百分 之二十五來自 crocetin與 TPA競爭而干擾 TPA對PKC 的活化。

此外由共統焦電子顯微鏡的觀察，正常情況下 thromb也可在很短的 時間造成鈣離子由內質綱釋放至細胞質內， thrombin透過G protein 活化

phospholipase C 造成鈣的游離， TPA才中學作hospholipase C 的功能，使鈣 不能被釋放(27，28) 。在高濃度的 crocetin前處理下， TPA對thrombin 的~

斷放泉明顯的降低，因此croceti淵PKC抑制的效果除了笑自對protein

但36-

kinase C 的訊息傳遞的干擾亦有可能抑制 TPA 水解 phospholipase C 的能 力。

在基因表現的層面， C-Jun 、 c-fos mRNA也被 crocetin有殼的抑制，

c-Jun及c-fos 是細胞受到刺激最早期被活化的基函，比二基自藉著合成 A手 l 蛋白質，布達到轉錄活化的效泉 (54) ⁰ c-fos 及 c-Jun 可經由 PKC(55歹 56) 、 PKA(57)或過氧化物 (58， 59) 等訊息傳遞的路徑而被活化，

由前段討論的結泉及 TPA 誘發的 c-Jun 及 c-fos mRNA 的表現，可以被 crocetin 抑制現象，推 5ß'J TPA 造成 c-Jun 及 c-fos mRNA 的活化主要受 crocetin~Çp 會作rotein kinase C 的訊息傳導作用而形成。

此外，我們亦不能完全排除 crocetin 封 PK.i屯式過氧化物的影響。

crocetin鳥類胡蘿蔔素的衍生物，依其共車fé.電子可能產生的共振結構特 性(Fig.1) ，可能具有捕捉過氧化物造成自由奉的功能，早期的研究證 實類胡蘿蔔索中 Lycopene 能抑制自由基產生的連鎖反應而減少癌化作

用 (60) ⁰ crocetin 的抗氧化作用已被用於改善培養老鼠組織出血形成的

氧化作用 (61) 。

綜合本實驗的結泉，我們提出一個假設 (Fig.23) ，推 5ß'J crocetin在

TPA 的癌促進作用中可能的抑制位置。

“37-

Crocetin R ⁼ H (CCT)

Fig.l.Structure of Crocetine

-38-

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CH,OH

Pl1orbol ester

Fig.2.S加cture of a typical diacyìglycerol ( l-oleoyl-2閻部向19lycerol; left ) and the tumor promoting phorbol ester ( 12-0-te甘adecanoyl-13樹acetate，

TPA; right), TPA contain a diacylglycerol-like s甘ucture in its molecule, 的 sho\V11 by the dotted squares. [from Nishizuka, Y. ，(l 984)，在le role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion.

Nature, 308:693.]

-39-

可

01 cellular

Fig.3.Proposed sites of interaction of some examples of oncogenes with with the inositol phospholipid pathway. Gp, G protein; Ins, inositol;

鈍，

phosphotidylinositol.

(全om Chemical carcinogenesis and mutagenesis

, 1994,

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^Exp.Ph缸m.)

^p396.

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Fig.4.Upper, Effect of crocetin (CCT) on 80 kDa protein phosphorylation induced by TPA in NIH 3T3 cel1s. Lower, Quantitative graph ofupper figure, by densitometer, lane A : con甘01 group, lane B : CCT 120 j..!M, lane C: TPA 100ng/ml, lane D: TPA + CCT 30μM， lane E: TP A + CCT

60μM， lane F: TPA + CCT 120μ恥i

“41-

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Time (min.)

Fig.5.Time course of crocetin

120μM

pretreatment on TP A stímulation of activated protein kinase C (particulate

企action)

isolated from Nlli 3T3 cells. The values are

mean 土 SD;

n=4. *P<O.Ol; compared withTPA-

甘eated group.

也吽2-

Table 1.E在ect of crocetin(CCT) pretreated on [3H]-PDBu binding test in NIH 3了3 cells

Treatment Binding( dpm) % of inhibition

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p-54 uuhd BBM-hs DDUAF PP{l

LJL』TT

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4183 土 210^a

2969 ' 76b

3159 土 293

29.4 24.4

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bp<O.05; compared with [3H]-PDBu“甘eated group.

-43-

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1500

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500

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A

B C D E

F

G

Fig.6.Effect of crocetin (CCT) pretreatment on TPA stimulated

甘anslocation of activated protein kinase C (particulate fraction) isolated from NllBT3 cells. Lane A: con甘01 group, lane B: solvent control , lane C: CCT 120μM， lane D : TP A 100 ng/ml, lane E:

TPA + CCT 30μM， lane F: TPA + CCT 60μM， lane G :TPA+CCT 120J.lM. The values are mean 土 SD ~ n=4. *P<O. 0 1 ~ compare吐 with

TP A -treated grOUp.

-44-

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...

Fig.7.Westem blot analysis ofPKC. (A), Cytosol 企action. (B), Particular

合action . Lane A: normal controL 1組e B: solvent controL lane C:CCT 120^JlM, lane D: TPA 100 ng!ml, lane E:TPA+CCT 30^JlM, laneF : TPA + CCT 60μM， lane G :TPA + CCT 120μM.

-45-

Contro!

T?A 15' CCT令 TPA15

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1

20

(A)

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60

40 dpo的mwo-GZE3吉布心

the TPA

TPA+CCTon -induced release ^口1 100ng/ml pretreatment

of course

of

thrombin Fig.8.Time

effect

Ca²+

or

cells.

Nlli3T3

120 140 80 100

60 40

20 160

Time (sec) the

Corresponded to

(B) thrombin

after lffiage

Co們 trol TPA2白，

CCT+TPA 2口，

也一也呵呵

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120

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100

80

60

40

20 JFO的mwo苟且E33-cu

the percentage of calcium

Calcium (with cell the calculated

by

fluorescent formula:

release%

releasing and

140 160 120 80 100

60 40

(total cell 20

number) --;-

Time (sec) number) X 100% 。

120

一刊于一 Control

一含一 TPA25' 咱自去γ- CCT...TPA 25' 100

80

40

20 60

(C)

JPG的MHω-oggEO志心

were

15

甘eated

TPA CCT NIH3T3 then(A)

甘eated

TPA (C).

(A)-(C) pretreated

口1

and

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20 mm.

的mms

cells, TPA

160 140 120 100

Time (sec)

80 60 40 20

-46-

,treated 25 位立n.

Fig.9.CalcÌtun release image of the effect of TPA preatment 1 OOng!ml treatment 20min or TPA

pre汀ea加lent 20min w1th crocetÌn pre-

(A)

pretreatment 15min (B) on the thrombin-

induced Ca²+

releasing (A),

Con甘01 (B), TPA 100ng!ml (C), CCT

120~+ TPA 100 nglm1. (x 260)

(A)

(B)

Fig.lO.Zoom in the images offig.9.-C. (A),before thrombn stimuIated. (B), after thrombin stumuIated 40 seconds , the upper color band is a reference to quntify calcium binding

wi也 Fluo-3

fluorescence. (x 1060)

-48輛

(A) ¹⁰⁰

國 Control

<

企 CCT 120 uM

@ CCT 60 uM

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O 20 40 60 80 100 120 140 160

Time (sec) ( B) 100

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O 20 40 60 80 100 120 140 160

Time (sec)

Fig.11.Effects of CCT on the inhibition of thrombin-inducedCa²+ release by TPA 100 ng/ml. These datas correspond to the image after thrombin stimulation and calculate the quantity of calcium releasing percentage by following formula : Calcium release % = (with fluorescent cell number)

-7 (total cell number)

x

100% . (A), Blank or CCT prea出lent then thrombin-stimulated (B), pre甘eat 30 、 60 and 120μM CCT 15min in NIH3T3 cells , and TPA 100 ng/ml was incubated 20 min before thrombin stimulated.

-49-

A B C O E _• G

盤盤盤

^4時_C-Jun

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B C 0 ~ F G

Fig.12.Effect of crocetin (CCT) on TPA induced c-jun mRNA in Nlli 3T3 cells. Northem blotting analysis to quanti身 relative c-jun mRNA leve1.

Lane A: nonnal control, lane B: solvent con甘叫， lane C : CCT 120

μM， lane D: TPA 100 ng!ml, lane E: TPA+CCT 30μM， F: TPA+CCT 60JlM, lane G :TPA+CCT 120μ恥f

-50-

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Fig.13.Effect of crocetin (CCT) on TPA induced c-fos mRNA in NIH 3T3 cells. Northem blot analysis to quanti命 relative c-fos mR.L"\fA level

"- nh」

,- D B '- 4

Lane A: nOImal contr仗， lane B: solvent control, lane C: CCT 120μM，

lane D: TPA 100 ng!m1, lane E:TPA + CCT 30J.lM, lane F: TPA+CCT

60μM， lane G : TPA + CCT 120μM.

“51-