第二章 材料與方法
2.2 DNA 萃取、擴增、定序和序列分析
2.2.1 DNA 萃取（DNA Extraction）
論文中的 DNA 萃取以商業化藥劑 DNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN, Valencia, California, USA）之流程萃取，萃取流程如下：
Ⅰ 取出部份保存於酒精之標本，以蒸餾水沖洗 2-3 回，並以吸水紙將樣本水
DNA 結合。電泳分析後，將膠體置於 UV 光暗箱中顯影，以數位擷取系統拍 攝影像，將影像列印。由電泳分析確認萃取成功後，萃取之總量 DNA（total DNA）放入-20℃冰箱作長期保存或放入 4℃冰箱短期保存。所得之總量 DNA 當作之後聚合酶連鎖反應模板。
2.2.2 基因擴增（Gene amplification）
：聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction；PCR）
將之前萃取基因組 DNA 為聚合酶連鎖反應模板，本實驗使用之引子
（primers）部份參考 Lin et al.（2001a）與 Freshwater et al.（1999），部份為針 對粉枝藻科屬種藻體設計之新引子，擴增粉枝藻科 rbcL 序列（表 2-4）和 LSU 序列（表 2-5）。
反應藥品： Autoclaved ddWater 13μl、5M Betaine 10μl、500mM dNTP 8μl、
5mM MaCl2 solution 6μl、PCR buffer 6μl、10mM Forward primer 2μl、10mM Reverse primer 2μl、Taq Polymerase（Ampli Taq）
1μl、和DNA 2μl，共 50μl。
反應設定：剛開始於 96℃進行 6 分鐘 DNA 變性（DNA denaturation），接著進 入 40-45 個循環，每一循環條件為 94℃ 1 分鐘 DNA 變性、42℃ 1 分鐘引子連結（Primer annealing）及 72℃ 1 分鐘 30 秒 DNA 合成
（DNA elongation），所有循環結束後，最後在 72℃進行 8 分鐘 DNA 合成，總反應時間約 4 小時。
將 PCR 產物經由膠體電泳分析（gel electrophoresis；1％ agarose gel in 1 x TBE at 200V for 20 min），同時添加 1-2μl 高濃度 ethidium bromide 使其與 PCR 產物之 DNA 結合。電泳後，將膠體置於 UV 光暗箱中顯影，以數位擷取 系統拍攝影像，將影像列印。由電泳分析確認 PCR 成功後，將 PCR 產物放 入-20℃冰箱作長期保存或放入 4℃冰箱短期保存。所得之 PCR 產物用於定序 反應。
表 2-4、粉枝藻科各屬種中，用於 rbcL 基因連鎖聚合反應及定序之擴殖引子。
引子編碼 合成方向 序列 資料來源
rbcL-F7
順式 5’-AAC-TCT-GTA-GAA-CGN-ACA-AG-3’Lin et al.
（2001a）
rbcL-F481
順式 5’-GTA-GAA-CGT-GAA-CGT-ATG-GAT-AAA-3’本研究
rbcL-F993
順式 5’-GGT-ACT-GTT-GTA-GGT-AAA-TTA-GAA-GG-3’Lin et al.
（2001a）
rbcL-R753
反式 5’-GCT-CTT-TCA-TAC-ATA-TCT-TCC-3’Lin et al.
（2001a）
rbcL-R1174
反式 5’-ATG-CAT-TTG-TCC-ACA-ATG-AAT-ACC-3’本研究
rbcL-Rsst
反式 5’-TGT-GTT-GCG-GCC-GCC-CTT-GTG-TTA-GTC-TCA-C-3’Lin et al.
（2001a）
表 2-5、粉枝藻科各屬種中，用於 LSU 基因連鎖聚合反應及定序之擴殖引子。
(* Freshwater et al.)
引子編碼 合成方向 序列 資料來源
LSU-F75 順式 5’-GAT-TGC-GTG-AGT-GGT-GGT-GTC-GCT-3’
本研究
LSU-F449 順式 5’-CCC-GAA-AGA-TGG-TGA-ACT-ATG-3’
Lin et al.
（2001 a）
X 順式 5’-GCA-GGA-CGG-TGG-CCA-TGG-AAG-T-3’
*
LSU-R878 反式 5’-TCA-TCC-CTT-ATC-GCC-AGT-TCT-GCT-3’
本研究
G 反式 5’-CAC-CAC-GTC-CTC-CTA-CTC-3’ * LSU-R1310 反式
5’-CGT-GGA-ACC-CTT-CCC-CGC-TTC-GCC-3’
本研究
28D 反式 5’-CTT-GGA-GAC-CTG-CTG-CGG-3’ * 28F 反式
5’-CAG-AGC-ACT-GGG-CAG-AAA-ATC-AC-3’
*
2.2.3 定序反應及基因定序（Sequencing Reaction and Sequencing）
在基因定序前需再一次進行聚合酶連鎖反應，此次反應稱為定序反應
（Sequencing Reaction）。目的將螢光標定的核苷酸 A、T、C、G 標定於先前 的 PCR 產物上。
定序反應藥品：BigDye 8μl、PCR product 8.8μl 和 10 pmol Primer 3.2μl，共 20μl。
定序反應設定：25-28 個循環，每一循環條件為 96℃ 20 秒 DNA 變性、50℃
20 秒引子連結及 72℃ 3 分鐘 30 秒 DNA 合成，總反應時間約 2 小時 30 分鐘。
反應結束後，將定序反應產物放入-20℃冰箱作長期保存或放入 4℃冰箱 短期保存。定序反應產物直接使用核酸自動定序儀（ABI prism 377 automatic DNA sequencer）定序。
2.2.4 親源關係分析（Phylogenetic analysis）
本研究由不同定序引子所得的 DNA 片段，先使用 Sequencher 4.0 電腦 軟體程式連接為一完整序列資料後，以 PAUP 電腦軟體程式的格式編排並以 肉眼檢查是否有誤。額外的 LSU 和 rbcL 序列是下載自 GenBank ﹙National Center for Biotechnology Information, NCBI﹚中已發表的相關基因資料作為親 緣關係比較及探討。
親緣關係樹的分析則是使用 PAUP 電腦軟體程式以鄰近連接﹙Neighbor-Joining; NJ﹚和最大儉約﹙Maximum-Parsimony; MP﹚的分析方法來建立親緣 關係樹。在鄰近連接樹的建立中，先用 MODELTEST 尋找最適當核苷酸取代 模式﹙nucleotide substitution model﹚，求得鄰近連接樹。在最大簡約樹的建立 中，選擇以 Heuristic Search 分析法，分析選擇以 500 次的重覆隨機搜尋最大 簡約樹﹙每一步驟以隨意的五個核心樹開始﹚。先前的 500 次的重覆隨機搜尋 簡約樹中，每一重覆保留前 15 個儉約樹。在樹的建立後，選擇 TBR ﹙Tree-Bisection Reconstruction﹚或 NNI ﹙Nearest Neighbor Interchange﹚檢定方式 檢定所得儉約樹的儉約性，求得最大簡約樹。完成之親緣關係樹狀圖，利用 bootstrap 分析方法 取 1000 次重覆檢驗 NJ 及 MP 樹，另外以 Decay Index 檢定 MP 樹，增加統計可信度。