試驗方法乃參考 M. Herrmann et al., 1994(37) 之方法。此研究得知 Apoptosis 會引起細胞 DNA 鍵結產生斷裂, 因而產生 DNA 碎片。而 這些 DNA 碎片(fragments)可在 electrophoretic DNA gels 形成清楚的 ladder。故觀察 gels 上 DNA 碎片產生的 ladder, 可瞭解試劑是否會引 發 Apoptosis 現象。
取 4 X 1O5細胞培養於 10 cm dish 中並加入 10 ml RPMI-1640 培 養液， 於 37°C, 5% CO2 的培養箱中 48 小時後，吸棄培養液後，
加入新的培養液，由於濃度為 LD50 的試驗藥物毒性太強 , 一小時即 可使 50%細胞致死 , 不適合做長時間觀察 , 所以加入 100μl濃度稀 釋為 1/5LD50 的試驗藥物，於 37°C, 5%CO2的培養箱中分別培養 l, 6, 12, 24 及 48 小時 ; 以及濃度稀釋為 1/10LD50 的試驗藥物，於 37°
C, 5% CO2的培養箱中分別培養 6 及 48 小時後，吸棄培養液後，並用 PBS 洗一次, 進行以下流程圖中之步驟 :
以 2% agarose gel跑膠 留下沉澱物並乾燥之 以轉速 12000rpm離心15分鐘
用75% 酒精(alcohol) 潤溼
加入 1/2 體積 10 M 醋酸氨(ammonium acetate) 和 2.5 體積 100%乙醇 (ethanol) (or 1/10 體積 3M NaOAC pH5.2 和 2.5 體積 100% ethanal)
在 攝氏-80 度C 至少 1小時 或 攝氏-20 度C 隔夜 加入 蛋白酵素K(proteinase K) 至最終濃度 2.5μg/μl
在攝氏 37度 C 處理 至少 2 小時 上清液調入 1% SDS
以RNA酵素A(RNase A )在攝氏56度C處理 2 小時 (最終濃度為 5μg/μl)
用1600G force(約3000rpm)離心5分鐘 然後收集上清液
細胞樣本用 lysis buffer 50μl 處理 10秒鐘 用 PBS沖洗後取下細胞放入高速離心機
以轉速 3000 rpm離心 15分鐘
以 100bp DNA ladder 為 referenced ladder , 最後結果於螢光下照相觀 察。
肆、結果
一、初步實驗
1、 口腔鱗狀細胞癌細胞株 :
為了找到最適當之細胞數和處理時間 ，以 OC2 細胞進行 MTT 方法分析細胞毒性。首先以不同細胞數 3X104、4X104、5X104、 6X104、8X104、1X105以作用兩天、四天 ，測其吸光值 ，希望吸光 值≦2 ;結果發現無論處理幾天，其吸光值均隨細胞數增加而增高 ， 處理結果以 4X104/ml 細胞數兩天能得到 1.545±0.067 之吸光值 ， 且細胞與吸光值有線性關係之存在 ;由此結果決定以處理兩天細胞 4X104/ml 作為實驗試劑對細胞毒性研究的條件(Table 4)。
二、根管充填劑對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性
本實驗以 0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mg/100μl 五種濃度分別以 前述細胞數和處理時間分析
l、Canals
Canals 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應(Dose-dependent)的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算
出其 powder 成份、liquid 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細 胞致死濃度(LD50) , 分別為 0.11、0.25、0.04 和 0.65 mg/l00μl ( Table 5 , Figure l）。
2、Canals-N
Canals-N 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成 濃度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 powder 成 份、liquid 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度 (LD50) , 分別為 0.14、0.41、0.06 和 2.95 mg/l00μl ( Table 6 , Figure 2）。
3、Tubi-seal
Tubi-seal 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成 濃度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 accelerator 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別 為 0.22、0.24 和 0.84 mg/l00μl ( Table 7 , Figure 3）。
4、Sealapex
Sealapex 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃
度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 base 成份、
catalyst 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 1.61、3.04、0.07 和 1.96 mg/l00μl ( Table 8 , Figure 4）。
5、Vitapex
Vitapex 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其充填物、24 小 時後之充填物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 0.40 和 1.00 mg/l00μl ( Table 9 , Figure 5）。
6、AH26
AH26 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃度 效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 resin 成份、混 合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 3.58、
0.03 和 0.36 mg/l00μl ( Table 10 , Figure 6）。
7、AH plus
AH plus 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 paste A 成
份、paste B 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度 (LD50) , 分別為 3.60、0.30、0.39 和 0.55 mg/l00μl ( Table 11 , Figure 7）。
各種測試藥物之 LD50 , 結果如 Table 12 表示。
三、Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和
AH plus 對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性 , 與作用時間之間的
關係
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 的 1/5 LD50 濃度混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株 , 均會造成時 間效應的細胞毒性。其中以 AH plus 在 6 至 12 小時間的變化較為明 顯( Survival %由 99.68% 降至 54.79% ) (Table 13, Figure8)。
四、Apoptosis 的觀察
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 等七種藥物 , 與口腔鱗狀細胞癌細胞株作用 1、6、12、24、48 小時後，每一種材料在膠上都沒有使細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應 (見照片 7, 8, 9, 10)。但若以上述七種藥物 , 用較低的濃度(1/10 LD50)
與口腔鱗狀細胞癌細胞株作用 6 及 24 小時後，每一種材料在膠上均 可使細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應(見照片 11)。所以 , 由以上的證 據顯示這七種藥物可能會破壞口腔鱗狀細胞癌細胞之 DNA 鍵結 , 引起 Apoptosis 現象。
五、顯微鏡下的觀察
照片 1-1 為口腔鱗狀細胞癌細胞顯微鏡下的觀察照片, 而照片 1-2 為加入 DMSO 後培養 1 小時之照片。照片 2, 3, 4, 5 是 Canals 之 Powder, Liquid, Mixed, 24hr after mixed, 濃度由低至高作用於口腔鱗 狀細胞癌細胞(OC2)後培養 1 小時之照片。其他試劑作用後於顯微鏡 下觀察呈現類似 Canals 之景象表現。
而其中有些試劑作用後於顯微鏡下呈現類似 Apoptosis 景象表現 (細胞濃縮, 細胞膜完整, 核內有濃縮顆粒)。例如口腔鱗狀細胞癌細 胞株(OC2) 經試劑萃取物 Mixed of Sealapex, 2.5mg/100μl 或 Paste of Vitapex, 2.5mg/100μl 處理後, 培養 1 小時產生類似 Apoptosis 景象(見 照片 6-1 及 6-2)。
伍、討論
牙科根管治療所用之充填劑的材料，大致可分為氧化鋅丁香油酚 基底 (ZOE-base)、氫氧化鈣基底 (Ca(OH)2-base)和樹脂基底
(Resin-base)，且各有其優缺點;本實驗乃研究其細胞毒性(Cytotoxicity) 及是否產生 Apoptosis 現象。
本實驗研究使用 DMSO 為溶劑是因其為常用之溶劑 , 其最終 濃度均小於 1%以下如此才不會造成細胞之傷害。
此研究使用 MTT 分析法之理由，有許多化學敏感分析可用於體 外之試驗，美國 National cancer Institue 以 tetrazolium
dye-based assay，用於篩檢藥物之方法，此種分析方法之細胞必須是 活的，當實驗試劑與細胞作用後，存活下來的活細胞的粒線體可將此 種水溶性黃色染料 MTT 經由粒腺體還原酵素作用還原下來，使其變 成不溶於水之紫色 MTT-formazan 產物，我們將 MTT-formazan 溶於 DMSO ，測其吸光值(38); Pumb(36)認為 MTT-formazan 的吸收光譜值 會受到細胞數與 PH 值的影響, Pumb(36)認為在細胞密度低時或是高 的 PH 值時，吸收的最大值是在波長為 560-570nm；在細胞密度高時 或是低的 PH 值時，吸收的最大值是在波長 510nm 和 570nm 上。本
試驗採用 570nm 波長來測試。
對於 MTT 分析法的評價有 Bean TA﹒et al. l995(40) 和 Schweikl H. et al.1995(41)認為，MTT 分析法在細胞毒性研究上較 colorimetric proliferation assay 和 Cr51 release assay 準確。也有學者指 出 MTT 還原酵素作用甚至可在細胞膜 Lysis 前即測出(44)。
Fuji et al(39) 指出 ，MTT 分析可因細胞種類之不同，培養時間 之差異或其他條件不同，而影響其結果，在我們的實驗中我們也分別 以不同濃度之細胞數與 DMSO 藥物作用作測試，結果發現不同之細 胞數與 DMSO 藥物作用間有線性關係。由 Table 4 得知以口腔鱗狀細 胞癌細胞 : 其細胞數為 4X104培養兩天後，DMSO 作用 l 小時之吸 光值 1.545±0.067 , 且細胞與吸光值有線性關係之存在 ; 以此條件 作為口腔鱗狀細胞癌細胞株研究之參考。
本實驗的吾人採用的材料分別是 :(1)氧化鋅丁香油酚基底充填 劑 (ZOE-base) 的 Canals、Canals-N 和 Tubi-seal，(2)氫氧化鈣基底充 填劑 (Ca(OH)2-base) 的 Sealapex , (3)樹脂基底充填劑 (Resin-base) 的 AH26 和 AH plus 的組成 A、組成 B、組成 A 和組成 B 的混合物、
組成 A 和組成 B 的 24 小時後混合物 , 以及氫氧化鈣基底充填劑 (Ca(OH)2-base) 的 Vitapex 的組成 A 和組成 B 的混合物、組成 A 和 組成 B 的 24 小時後混合物共二十六項。由結果發現這二十六項試劑
由低濃度到高濃度的測試物，吸光值隨濃度增加而遞減 ( Figure l-7），結果顯示 survivate rate 由高往下降 , 顯示高濃度樣品對細胞具 有較高的毒性。
這二十六項中 Tubi-seal 的 Base 和 AH26 的 Powder (LD50 均大 於 12.5 mg/100μl)，對口腔鱗狀細胞癌細胞，含較低的細胞毒性 (Table4-9)。
比較 LD50 發現 , 各組成 A 和組成 B 的混合物 , 細胞毒性大小 依次為 AH26 > Canals > Canals-N > Sealapex > Tubi-seal > AH plus >
Vitapex ; 而在組成 A 和組成 B 的 24 小時後混合物中 , 其細胞毒性 大小依次為 AH26 > AH plus > Canals > Tubi-seal > Vitapex > Sealapex
> Canals-N。除 Vitapex 外 , 本次實驗所有混合試劑的凝固時間 , 依 照廠商說明都在 24 小時以內 , 由以上這些結果顯示 : 即使經過足 夠時間的凝固反應 , AH26 和 AH plus 等樹脂基底充填劑的毒性反應 仍然比較高 , 這點可能值得我們在臨床使用樹脂基底充填劑時多加 考量。
另外, 所有混合物之毒性均較 24 小時後混合物為大 , 顯示剛調 拌好的混合試劑可能產生某些毒性較強的物質 , 才造成細胞毒性的 增加 , 經過凝固後這些毒性物質才消失 , 而細胞毒性反應也隨之降 低。不僅是樹脂基底充填劑 , 連氧化鋅丁香油酚基底充填劑和氫氧
化鈣基底充填劑也都有同樣的情況發生。然而當我們進行根管治療使 用根管充填劑的時候 , 都是將剛調拌好的混合充填劑直接放入根管 內 , 所以上述結果提醒我們 : 無論使用何種根管充填劑 , 都要注 意在根管擴大與充填時 , 根尖狹窄 ( apical constriction ) 的維持 , 儘量減少根管充填劑和根尖周圍組織的接觸 , 以降低細胞毒性反應 的影響。
在 Canals 和 Canals-N 方面, 兩種藥劑的不同僅在於 Liquid 的組 成為 Eugenol 或是 Fatty acid。由 LD50 來看 , 無論是 Liquid、Mixed 或 24hr after mixed 的細胞毒性 , Canals-N 均較 Canals 為小 , 尤其是 比較 24hr after mixed 的細胞毒性更是明顯。這結果和 Kouji Araki(9) 所言除去 Eugenol 以降低根管充填劑細胞毒性的結論相同。而且比較 24hr after mixed 的細胞毒性 , Canals-N (LD50 = 2.95 mg/100μl) 甚 至較氫氧化鈣基底充填劑 Sealapex (LD50 = 2.95 mg/100μl) 的細胞 毒性為小。從以上結果看來 , Canals-N 顯然比其他根管充填劑擁有較 佳的生物相容性。
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 的 1/5 LD50 濃度混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株 , 均會造成時 間效應的細胞毒性 ; 亦即作用時間越久(Table 13, Figure 8) , 其 survival rate 越由高往下降。其中以 AH plus 在 6 至 12 小時間的變化
較為明顯( Survival %由 99.68% 降至 54.79% )。Allan et al., 2001(42) 提出的研究指出在根管內(Root canal)根管充填劑凝固較試管內(In vitro)為慢。由以上結果顯示 : 這些未完全凝固的根管充填劑與根尖 周圍組織作用越長的時間, 組織所受到的毒性刺激越大 , 越可能會
較為明顯( Survival %由 99.68% 降至 54.79% )。Allan et al., 2001(42) 提出的研究指出在根管內(Root canal)根管充填劑凝固較試管內(In vitro)為慢。由以上結果顯示 : 這些未完全凝固的根管充填劑與根尖 周圍組織作用越長的時間, 組織所受到的毒性刺激越大 , 越可能會