ABBREVIATIONS
Dimethylsulfoxide DMSO Dose of 50% inhibition ID50 Ethylene diaminetetraacetic acid EDTA
Fetal bovine serum FBS 2-hydroxyethlmeth-acrylate HEMA 3-(4,5-dimethylthiazol-z-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide MTT Optical Density OD Oral squamous cell carcinoma OC2 Phosphate buffer saline PBS
RPMI Medium l640 RPMI-1640 Trypsin and EDTA T/E
目錄
中文摘要...5
英文摘要...7
壹、文獻綜論...8
一、緒言...8
二、根管充填劑之生物相容性文獻回顧...9
三、細胞凋零 (Apoptosis)... 11
四、細胞模式實驗...12
貳、研究動機與目的:...14
參、研究材料與方法...15
一、材料與化學藥品...15
二、實驗試劑的成份...15
三、實驗試劑製備...16
四. 細胞培養...17
五. 解凍與保存...17
六. 細胞毒性試驗...18
l、作用濃度改變對毒性的影響 (Does-dependent relationship) ...18
2、作用時間改變對毒性的影響 (Time-dependent relationship)
...19
3、統計分析...20
七. DNA fragmentation test (Apoptosis) :...21
肆、結果...23
一、初步實驗...23
二、根管充填劑對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性...23
l、Canals...23
2、Canals-N...24
3、Tubi-seal...24
4、Sealapex...24
5、Vitapex...25
6、AH26...25
7、AH plus...25
三、Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性 , 與作用時間之間的 關係...26
四、Apoptosis 的觀察...26
五、顯微鏡下的觀察...27
伍、討論...28
陸、結論...34
柒、參考文獻...35
捌、表...39
玖、圖...56
中文摘要
根管充填劑依材料組成的不同 , 可分為(1)氧化鋅丁香油酚基底 (ZOE based) , (2)氫氧化鈣基底 (Ca(OH)2-based) , (3)樹脂基底
(Resin-based)三種充填劑。其本身之生物相容性可說是根管治療成功 的關鍵之一 , 因為毒性物質可能會延誤根尖周圍組織之癒合 , 或甚 而引發發炎反應。回顧文獻也發現諸多探討根管充填劑毒性之研究 , 但其結果並不儘相同 , 為能更加掌握根管治療療程的進行 , 實在有 必要對根管充填劑做進一步的瞭解 ; 另外 , 近年來的牙科材料雖然 經過許多改良 ,且其細胞毒性也因而減少 , 但是因為所產生的抗菌 物質 , 而導致組織細胞發生細胞凋零(Apoptosis) 的現象 , 也引起 我們對於根管充填劑是否會引起細胞凋零(Apoptosis) 的問題產生興 趣。因此本研究之目的即藉著細胞培養的方法 , 以 MTT assay 來評 估各類型之根管充填劑(ZOE based; Calcium hydroxide based; and Resin based sealers) ,了解其對細胞之生物相容性 , 以做為臨床治療 上選擇的參考依據。並且利用 DNA 碎片(DNA fragment)在電泳膠上 形成的梯形條紋(ladder)來觀察細胞凋零(Apoptosis) 的現象。結果發 現 AH26 和 AH plus 具有較強的細胞毒性 ; 而 Canals-N 則具有較佳 之生物相容性。但是所有充填劑的毒性 , 都隨著劑量和時間的增加
而增加(p<0.05)。這些根管充填劑毒性所導致的細胞死亡可能可經由 細胞凋零(Apoptosis)產生的。
所以在臨床根管治療時 , 無論使用何種根管充填劑 , 都要注意 根尖狹窄 ( apical constriction ) 的維持 , 儘量減少根管充填劑和根 尖周圍組織的接觸 , 以降低細胞毒性反應的影響。
英文摘要
There are three types of endodontic sealers as follows:
(1)ZOE-based, (2)Calcium-hydroxide-based, and (3)Resin-based sealers.
The biocompatibility of root canal sealers contributes in an important role to the clinical success of endodontic therapy. The toxic materials may delay the healing of periapical tissues or even cause an inflammatory tissue reaction.
The purpose of this study was to evaluate the cytotoxicity of
individual components, each mixed sealers, and each mixture of 24 hours after mixing of Canals, Canals-N, Tubi-seal, Sealapex, Vitapex, AH26, and AH plus that treated on human oral cancer cell line (OC2), and whether did these sealers induce apoptosis.
The result of MTT assay showed that the higher concentration and longer duration of treated materials were and the higher cytotoxicity detected (p<0.05).
Individual mixture of 24 hours after mixing has various degrees of cytotoxicity to OC2 from the others. Mixtures of AH26 and AH plus were the most cytotoxic sealers, and mixture of Canals-N was the least cytotoxic sealer.
The result of the technique for the isolation of apoptotic DNA fragments showed that treated materials might induce apoptosis.
To prevent the root canal sealer leaked out to periapical tissue is very important for successful endodontic treayments. The better choice of endodontic sealers is the calcium hydroxide-based sealer.
壹、文獻綜論
一、緒言
根管充填材料 (Root canal filling materials) 一般可分為 : 鑄心材 料 (Solid core materials) 根管充填劑 (Root canal sealers) 根管用 水門酊 (Cements, pastes, and plastics)等三類。
其中根管充填劑依其成份可分為 Zinc oxide-eugenol based, Calcium hydroxide based 及 Resin based 等三種充填劑。Gartner(1) 提出理想根管充填材料的性質 :
The properties of ideal root filling materials (Gartner et al., 1992):
1. 可在三度空間中封閉與黏著根管系統 (To adhere and seal the root canal system in three dimensions)
2. 對根尖周圍組織無毒性 (Nontoxicity and well tolerated by periradicular tissues)
3. 具有穩定的體積 (Dimension stability) 4. 不被組織吸收 (Nonabsorbability)
5. 不會被濕氣所影響 (Not affected by the presence of moisture) 6. 不會腐蝕 ( Should not corrode)
7. 具電化學活性 (Be electrochemically active)
8. 容易操作 (Easy to manipulate)
9. 在 X 光下不具通透性 (Be radiopaque)
二、根管充填劑之生物相容性文獻回顧
Keresztesi and Kellner(2)在 1966 年即開始研究根管充填劑之細胞 毒性 , 採用之細胞株為 HeLa 3T3 or L929 細胞。細胞毒性主要以 growth inhibition 和 LD50 來確定。
1. 氧化鋅丁香油酚基底 (ZOE based) root canal sealer :
Munaco et al., 1978(3); Kettering et al., 1984(4); Yesilsoy et al.,
1985(5). 利用細胞培養方法研究 , 指出 ZOE-based sealers 具有強烈的 細胞毒性。其原因認為是由於 eugenol 的釋出 , 導致細胞呼吸受抑制
(6) , 或細胞膜被溶解(7) , 而具有毒性。然而, 根管充填劑中所釋出的 Eugenol , 也具有抗微生物的作用 , 有助於消滅殘存的細菌(8)。 Kouji et al., 1993(9)利用 Radiochromium release 的方法, 來研究 Canals(liquid 中含 eugenol)和 Canals-N(liquid 以 fatty acid 取代 eugenol ) , 發現根管充填劑的細胞毒性 , 可經由 fatty acid 取代 eugenol 的方式來降低。
而 Kouji et al., 1994 (10)更指出剛調好 Canals 毒性甚強 , 凝固經過
24 小時後 , 則未測出毒性反應 ; 至於 Canals-N 在其研究中 , 則不 具細胞毒性。
2. 氫氧化鈣基底 (Ca(OH)2-based) root canal sealer :
一般而言 , 大多數的 Ca(OH)2-based sealer 被認為具有極佳的生 物相容性(11) ; Safavi et al., 1993(12), 1985(13), Sjögren et al., 1991(14), Byström et al., 1985(15). 等人則指出 Calcium hydroxide 於根管中具有 很好的殺菌作用 ; Martin et al., 1977(16), 指出 Calcium hydroxide 在根 尖周圍病灶具有促進骨再生的功能。
3. 樹脂基底 (Resin-based) root canal sealer :
Epoxy resin-based sealer 由於具有許多優異特點(17) , 例如(1)與牙 齒結構可黏著(adhesion to tooth structure), (2)較長的工作時間(long working time), (3)容易調拌(ease of mixing), 和(4)好的封閉效果(good sealing ability)等 , 因此被引進臨床根管治療。其中最常被使用的就 是 Schroder(18)於 1954 年引進之根管充填材料--AH26 ( Dentsply 公司)。
然而 , 已有許多研究提出報告(Tagger et al., 1989(19); Rappaport et al., 1964(20)) : AH26 由於 formaldehyde 的釋出而產生細胞毒性 (Cytotoxicity)。在 AH26 的成份表示中 , 無論 Powder 或 Resin 都沒
有明列含有 formaldehyde 這項成份。但是 , 在 Powder 中所含的 Hexamethylenetetramine (HMT)是由 formaldehyde 和 ammonia 所合 成 ; 而且 HMT 在酸性環境或水溶液中仍會分解成為 formaldehyde 和 ammonia(21)。AH26 剛調拌好時毒性極高 , 且可持續一週 , 而後 才逐漸降低其細胞毒性(22)。而釋出 formaldehyde 的量在一週後也變得 較不顯著(23)(24)。
AH plus 也是屬於一種 Epoxy resin-based sealer。根據製造廠商表 示 , AH plus 的臨床使用效果優於 AH26 ; 同時 , 毒性反應也較 AH26 為小。但是根據研究報告指出 : AH plus 剛調拌好後 4 小時內 毒性極高 , 而後明顯下降。其短暫的細胞毒性產生的原因 , 可能與 其含有少量 formaldehyde 有關(22)。
4. 至於在各類根管充填劑間細胞毒性的比較方面 , 結果並不儘相 同。例如 , Osorio et al.於 1998 年提出的研究報告(24)認為氧化鋅丁香 油酚基底和樹脂基底充填劑的毒性相近 , 且都大於氫氧化鈣基底充 填劑 ; 但 Leonardo et al., 2000 的研究(25)卻認為氫氧化鈣基底充填劑 的毒性大於氧化鋅丁香油酚基底充填劑。
三、細胞凋零 (Apoptosis)
Apoptosis 最早於 1972 年被描述(26) , 指的是一種生理的細胞死亡
進展過程。在許多基礎生物反應中 , 例如 : 由荷爾蒙引起的組織重 塑(Hormone-induced tissue remodeling)、胚胎形態的發生(Embryonic morphogenesis)等 , 都扮演重要角色。
有許多因素可以引發 Apoptosis 包括 Biological agents(例如 TGFß-like protein 等)和 Nonphysiological agents(例如 radiation, toxic substances or drugs)(27)。
Apoptosis 與 Necrosis 最明顯的區別(27) , 在於 Apoptosis 具有 energy stores 以維持細胞的完整 ; 以及完整的代謝(metabolic integrity) 來合成分子以便進行整個過程。
Apoptotic cells 可同時見到細胞質的壓縮 ; 以及核中核染色質的 壓縮和斷裂(28)(29)(30)
。而且也可以看到長度約 180-200 base pairs 的 DNA fragments 形成(27) , 而這些 fragments 可在 electrophoretic DNA gels 形成清楚的 ladder。
四、細胞模式實驗
雖然有學者認為體外實驗的方法沒有辦法充分模擬體內環境，所 以認為試管內(in vitro)與體內實驗方法之間並沒有理想的關連性。然 而體內實驗亦存有許多不易克服的因難 ， 因此體外實驗的操作方法 仍被採用著(31)。Dahl Blet 1975(32)的細胞培養（體外實驗)及猴子牙齒
（體內實驗）來研究 silicatophosphate cement 和 zinc phosphate cement 的生物相容性 ; 另外也以細胞培養（體外實驗)及猴子牙齒 (體內實驗)來研究 glass ionomer 的生物相容性(33)。結果發現在體外及 體內實驗有相似的反應。所以吾人認為採用細胞培養來作為細胞毒性 之測試，對臨床研究有參考的價值。
貳、研究動機與目的:
根管充填劑 (Root canal sealers) 乃牙科根管治療廣泛使用之物 , 其本身之生物相容性更是根管治療成功的關鍵之一 , 因為毒性物 質可能會延誤根尖周圍組織之癒合 , 或甚而引發發炎反應。面對 幾乎每天都要處理的根管治療病患 , 實在有必要對根管充填劑做 進一步的瞭解 , 以便更能掌握療程的進行。因此本研究之目的即 藉著細胞培養的方法 , 來評估各類型之根管充填劑(ZOE based;
Calcium hydroxide based; and Resin based sealers) ,了解其對細胞之 生物相容性 , 以做為臨床治療上選擇的參考依據。
根據 Goldberg於 1994 年提出的報告(34)指出 , 近年來的牙科材料雖 然經過改良 , 使其細胞毒性減少 ; 但是所產生的抗菌物質 , 卻 可能反而導致組織細胞發生細胞凋零(Apoptosis) 的現象。這也引 起我們對於根管充填劑是否會引起細胞凋零(Apoptosis) 的問題產 生興趣 , 所以也將細胞凋零(Apoptosis) 一併列入探討的範圍。
參、研究材料與方法
一、材料與化學藥品
1. RPMI-1640, Fetal bovine serum (FBS), Penicillin, Streptomycine, Trypsin, 購自美國 Life Technology 公司
2. 細胞培養皿購自丹麥 Nunc 公司
3. Dimethyl sulfoxide 購自德國 E. Merck 化學公司 4. Canals 及 Canals-N 購自日本昭和藥品株式會社 5. Tubi-Seal 及 Sealapex 購自美國 KERR 公司 6. AH 26 及 AH plus 購自美國 DENTSPLY 公司 7. Vitapex 購自日本 J. Morita 公司
二、實驗試劑的成份
Root canal sealers:
1. Zinc oxide-eugenol based Canals
Canals-N Tubi-seal
2. Calcium hydroxide based Sealapex (Kurr)
Vitapex 3. Resin based
AH26 AH plus
各藥物組成如 Table 1-3 所示
三、實驗試劑製備
所有試劑除 Vitapex 分為 Immediately mixed 及 24 hr after mixing 兩組 外), 均分為 group 1 (Component A), group 2 (Component B), group 3 (Mixed), group 4 (24 hr after mixing), 等四組。Component A 方面 : 在 Canals, Canals-N, 及 AH26 為 powder ; Tubi-seal 及 Sealapex 為 base;
AH plus 為 paste A。Component B 方面 : 在 Canals 及 Canals-N 為 liquid; Tubi-seal 為 accelerator; Sealapex 為 catalyst; AH26 為
resin(paste); AH plus 為 paste B。group 3 混合方式依照廠商提供的混 合比例方法。至於 group 4 則為混合後置於 37°C, 100%濕度之培養箱 中 24 小時後取出。總共 26 組試劑, 而後所有材料浸泡於 DMSO (Dimethyl sulfoxide) (20 mg/100µl) 1 小時, 取上澄液並稀釋成 0.02;
0.1; 0.5; 2.5; 12.5 mg/100µl 等五種濃度儲存於-20ºC 冰箱中備用。本研 究 DMSO 之最終濃度均小於 1%以下, 如此才不會造成細胞的傷害。
四. 細胞培養
口腔鱗狀細胞癌細胞株
細胞株 OC2, 源於人類口腔鱗狀細胞癌, 由臺中榮總口腔顎面外 科所提供, 依 Wong et al(35), 之方法培養於 RPMI-1640 medium
( GIBCO, life Technologist Inc, Grand Island, NY) 中, 含有 10% fetal bovine serum, penicillin ( 100 unit per ml of RPMI-1640 medium) – streptomycine (100 unit per ml of RPMI-1640 medium) – Fungizone and 1% L-glutamine 37°C, 5%CO2, 100% humidity, 恆溫之培養箱。
五. 解凍與保存
口腔鱗狀細胞癌細胞株(Oral squamous cell carcinoma cell line – OC2) 由液態氮筒中取出之細胞, 迅速放入 37°C 水浴中, 使其快速解 凍, 將解凍之細胞移至含有 37°C RPMI-1640 培養液之離心管中, 以 1000rpm, 離心 10 分鐘, 除去上清液後, 以含 10% FBS 之 RPMI-1640 培養液培養之, 培養方法如前節所述。
如欲冷凍保存細胞, 則用胰蛋白脢酵素 (Trypsine/EDTA) 處理, 以分離細胞, 以 1000rpm, 離心 10 分鐘, 除去上清液後, 再加入含有 10% FBS 及 10% DMSO 之 RPMI-1640 培養液, 再取部分完全均勻 的細胞懸浮液, 以計數器計算細胞數目為每管 1×106個細胞放入 Cryotube 中, 放入 -20°C 冰箱中 4-5 小時後, 移至 -80°C 冰箱
8-10 小時, 最後移至液態氮中儲存。
六. 細胞毒性試驗
MTT (Tetrazolium dye,
3-(4,5-dimethylthiazol-z-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ) assay 實 驗步驟
試驗方法參考 Plumb et al. 1989(36) 之方式。此研究得知活細胞的 粒腺體會將 MTT 代謝而產生藍紫色結晶, 此藍紫色結晶可溶於異丙 醇 (DMSO) 中, 故測其吸光值大小可得知活細胞數目的多寡, 可藉 此判斷藥物對細胞的毒性。
口腔鱗狀細胞癌細胞株與根管充填劑作用後的 MTT 分析
l、作用濃度改變對毒性的影響 (Does-dependent relationship)
將所培養之細胞 OC2 取出 4X 104個細胞/well，種於 24 孔 microtiter plate 並加入 1ml RPMI-1640 培養液， 於 37°C, 5% CO2 的 培養箱中 48 小時後，吸棄培養液後，加入新的培養液，並加入 10 μl 試驗藥物，於 37°C, 5% CO2的培養箱中 l 小時後，吸棄培養液 後，並用 PBS 洗一次，取 1ml 的 MTT(5 mg/ml in PBS )與 medium 混合液(MTT : medium = 1:7), 加入每個 well 中，以錫箔紙將之包裹 好，再繼續培養 4 小時之後，將 well 內之液體吸棄，加入 1ml DMSO
溶解 formazen ，並加入 Sorensens glycine buffer 125μl，以分光度計 在波長為 570nm 下檢測各種濃度之吸光值(O.D.)。所有試劑及各濃度 均重複做 6 次求其平均值。
細胞毒性之計算公式如下(以 DMSO 組 Survival rate 為 100%):
% Survival rate = [(OD of test group - OD of Blank) / (OD of DMSO control group - OD of Blank)] x 100%
其中, Test 各組分別加入 10μl 前述(見參、三、試驗試劑製備)所調製 的 26 組試劑; Control 組加入 10μl DMSO; Blank 組為純 Medium 組, 不加入任何細胞及試劑。
由以上公式得知 : % of Survival rate 值愈小,則試驗藥物的細胞毒性 愈大。所有試劑及各濃度均重複做 6 次求其平均值。以內插法由濃度 反應曲線 , 算出其造成 50%細胞致死的濃度 (LD50) 。
2、作用時間改變對毒性的影響 (Time-dependent relationship)
將所培養之細胞 OC2 取出 4X 104個細胞/well，種於 24 孔 microtiter plate 並加入 1ml RPMI-1640 培養液， 於 37°C, 5% CO2 的 培養箱中 48 小時後，吸棄培養液後，加入新的培養液，並加入 10 μl 濃度為 1/5LD50 的試驗藥物，於 37°C, 5% CO2的培養箱中分別 培養 l, 6, 12, 24 及 48 小時後，吸棄培養液後，並用 PBS 洗一次，取
1ml 的 MTT(5 mg/ml in PBS )與 medium 混合液(MTT : medium = 1:7), 加入每個 well 中，以錫箔紙將之包裹好，再繼續培養 4 小時之後，
將 well 內之液體吸棄，加入 1ml DMSO 溶解 formazen ，並加入 Sorensens glycine buffer 125μl，以分光度計在波長為 570nm 下檢測 各種濃度之吸光值(O.D.)。所有試劑及各濃度均重複做 6 次求其平均 值。
細胞毒性之計算公式如下(以 DMSO 組 Survival rate 為 100%):
% Survival rate = [(OD of test group - OD of Blank) / (OD of DMSO control group - OD of Blank)] x 100%
其中, Test 各組分別加入 10μl 前述(見參、三、試驗試劑製備)所調製 的 7 組混合物試劑; Control組加入 10μl DMSO; Blank 組為純 Medium 組, 不加入任何細胞及試劑。
觀察不同時間對毒性的影響。
3、統計分析
實驗結果用二因子變異數分析法(Two-way ANOVA)進行統計分析 , p 值 <0.05 表示顯著 ; Tukey’s HSD 事後比較(post-hoctest)來決定各組 之間的差異顯著 (p<0.05) 。
七. DNA fragmentation test (Apoptosis) :
試驗方法乃參考 M. Herrmann et al., 1994(37) 之方法。此研究得知 Apoptosis 會引起細胞 DNA 鍵結產生斷裂, 因而產生 DNA 碎片。而 這些 DNA 碎片(fragments)可在 electrophoretic DNA gels 形成清楚的 ladder。故觀察 gels 上 DNA 碎片產生的 ladder, 可瞭解試劑是否會引 發 Apoptosis 現象。
取 4 X 1O5細胞培養於 10 cm dish 中並加入 10 ml RPMI-1640 培 養液， 於 37°C, 5% CO2 的培養箱中 48 小時後，吸棄培養液後，
加入新的培養液，由於濃度為 LD50 的試驗藥物毒性太強 , 一小時即 可使 50%細胞致死 , 不適合做長時間觀察 , 所以加入 100μl濃度稀 釋為 1/5LD50 的試驗藥物，於 37°C, 5%CO2的培養箱中分別培養 l, 6, 12, 24 及 48 小時 ; 以及濃度稀釋為 1/10LD50 的試驗藥物，於 37°
C, 5% CO2的培養箱中分別培養 6 及 48 小時後，吸棄培養液後，並用 PBS 洗一次, 進行以下流程圖中之步驟 :
以 2% agarose gel跑膠 留下沉澱物並乾燥之 以轉速 12000rpm離心15分鐘
用75% 酒精(alcohol) 潤溼
加入 1/2 體積 10 M 醋酸氨(ammonium acetate) 和 2.5 體積 100%乙醇 (ethanol) (or 1/10 體積 3M NaOAC pH5.2 和 2.5 體積 100% ethanal)
在 攝氏-80 度C 至少 1小時 或 攝氏-20 度C 隔夜 加入 蛋白酵素K(proteinase K) 至最終濃度 2.5μg/μl
在攝氏 37度 C 處理 至少 2 小時 上清液調入 1% SDS
以RNA酵素A(RNase A )在攝氏56度C處理 2 小時 (最終濃度為 5μg/μl)
用1600G force(約3000rpm)離心5分鐘 然後收集上清液
細胞樣本用 lysis buffer 50μl 處理 10秒鐘 用 PBS沖洗後取下細胞放入高速離心機
以轉速 3000 rpm離心 15分鐘
以 100bp DNA ladder 為 referenced ladder , 最後結果於螢光下照相觀 察。
肆、結果
一、初步實驗
1、 口腔鱗狀細胞癌細胞株 :
為了找到最適當之細胞數和處理時間 ，以 OC2 細胞進行 MTT 方法分析細胞毒性。首先以不同細胞數 3X104、4X104、5X104、 6X104、8X104、1X105以作用兩天、四天 ，測其吸光值 ，希望吸光 值≦2 ;結果發現無論處理幾天，其吸光值均隨細胞數增加而增高 ， 處理結果以 4X104/ml 細胞數兩天能得到 1.545±0.067 之吸光值 ， 且細胞與吸光值有線性關係之存在 ;由此結果決定以處理兩天細胞 4X104/ml 作為實驗試劑對細胞毒性研究的條件(Table 4)。
二、根管充填劑對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性
本實驗以 0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mg/100μl 五種濃度分別以 前述細胞數和處理時間分析
l、Canals
Canals 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應(Dose-dependent)的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算
出其 powder 成份、liquid 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細 胞致死濃度(LD50) , 分別為 0.11、0.25、0.04 和 0.65 mg/l00μl ( Table 5 , Figure l）。
2、Canals-N
Canals-N 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成 濃度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 powder 成 份、liquid 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度 (LD50) , 分別為 0.14、0.41、0.06 和 2.95 mg/l00μl ( Table 6 , Figure 2）。
3、Tubi-seal
Tubi-seal 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成 濃度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 accelerator 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別 為 0.22、0.24 和 0.84 mg/l00μl ( Table 7 , Figure 3）。
4、Sealapex
Sealapex 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃
度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 base 成份、
catalyst 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 1.61、3.04、0.07 和 1.96 mg/l00μl ( Table 8 , Figure 4）。
5、Vitapex
Vitapex 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其充填物、24 小 時後之充填物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 0.40 和 1.00 mg/l00μl ( Table 9 , Figure 5）。
6、AH26
AH26 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃度 效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 resin 成份、混 合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度(LD50) , 分別為 3.58、
0.03 和 0.36 mg/l00μl ( Table 10 , Figure 6）。
7、AH plus
AH plus 的各成份和混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株，會造成濃 度效應的細胞毒性; 以內插法由此濃度反應曲線算出其 paste A 成
份、paste B 成份、混合物、24 小時後混合物的 50%細胞致死濃度 (LD50) , 分別為 3.60、0.30、0.39 和 0.55 mg/l00μl ( Table 11 , Figure 7）。
各種測試藥物之 LD50 , 結果如 Table 12 表示。
三、Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和
AH plus 對口腔鱗狀細胞癌細胞株的細胞毒性 , 與作用時間之間的
關係
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 的 1/5 LD50 濃度混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株 , 均會造成時 間效應的細胞毒性。其中以 AH plus 在 6 至 12 小時間的變化較為明 顯( Survival %由 99.68% 降至 54.79% ) (Table 13, Figure8)。
四、Apoptosis 的觀察
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 等七種藥物 , 與口腔鱗狀細胞癌細胞株作用 1、6、12、24、48 小時後，每一種材料在膠上都沒有使細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應 (見照片 7, 8, 9, 10)。但若以上述七種藥物 , 用較低的濃度(1/10 LD50)
與口腔鱗狀細胞癌細胞株作用 6 及 24 小時後，每一種材料在膠上均 可使細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應(見照片 11)。所以 , 由以上的證 據顯示這七種藥物可能會破壞口腔鱗狀細胞癌細胞之 DNA 鍵結 , 引起 Apoptosis 現象。
五、顯微鏡下的觀察
照片 1-1 為口腔鱗狀細胞癌細胞顯微鏡下的觀察照片, 而照片 1-2 為加入 DMSO 後培養 1 小時之照片。照片 2, 3, 4, 5 是 Canals 之 Powder, Liquid, Mixed, 24hr after mixed, 濃度由低至高作用於口腔鱗 狀細胞癌細胞(OC2)後培養 1 小時之照片。其他試劑作用後於顯微鏡 下觀察呈現類似 Canals 之景象表現。
而其中有些試劑作用後於顯微鏡下呈現類似 Apoptosis 景象表現 (細胞濃縮, 細胞膜完整, 核內有濃縮顆粒)。例如口腔鱗狀細胞癌細 胞株(OC2) 經試劑萃取物 Mixed of Sealapex, 2.5mg/100μl 或 Paste of Vitapex, 2.5mg/100μl 處理後, 培養 1 小時產生類似 Apoptosis 景象(見 照片 6-1 及 6-2)。
伍、討論
牙科根管治療所用之充填劑的材料，大致可分為氧化鋅丁香油酚 基底 (ZOE-base)、氫氧化鈣基底 (Ca(OH)2-base)和樹脂基底
(Resin-base)，且各有其優缺點;本實驗乃研究其細胞毒性(Cytotoxicity) 及是否產生 Apoptosis 現象。
本實驗研究使用 DMSO 為溶劑是因其為常用之溶劑 , 其最終 濃度均小於 1%以下如此才不會造成細胞之傷害。
此研究使用 MTT 分析法之理由，有許多化學敏感分析可用於體 外之試驗，美國 National cancer Institue 以 tetrazolium
dye-based assay，用於篩檢藥物之方法，此種分析方法之細胞必須是 活的，當實驗試劑與細胞作用後，存活下來的活細胞的粒線體可將此 種水溶性黃色染料 MTT 經由粒腺體還原酵素作用還原下來，使其變 成不溶於水之紫色 MTT-formazan 產物，我們將 MTT-formazan 溶於 DMSO ，測其吸光值(38); Pumb(36)認為 MTT-formazan 的吸收光譜值 會受到細胞數與 PH 值的影響, Pumb(36)認為在細胞密度低時或是高 的 PH 值時，吸收的最大值是在波長為 560-570nm；在細胞密度高時 或是低的 PH 值時，吸收的最大值是在波長 510nm 和 570nm 上。本
試驗採用 570nm 波長來測試。
對於 MTT 分析法的評價有 Bean TA﹒et al. l995(40) 和 Schweikl H. et al.1995(41)認為，MTT 分析法在細胞毒性研究上較 colorimetric proliferation assay 和 Cr51 release assay 準確。也有學者指 出 MTT 還原酵素作用甚至可在細胞膜 Lysis 前即測出(44)。
Fuji et al(39) 指出 ，MTT 分析可因細胞種類之不同，培養時間 之差異或其他條件不同，而影響其結果，在我們的實驗中我們也分別 以不同濃度之細胞數與 DMSO 藥物作用作測試，結果發現不同之細 胞數與 DMSO 藥物作用間有線性關係。由 Table 4 得知以口腔鱗狀細 胞癌細胞 : 其細胞數為 4X104培養兩天後，DMSO 作用 l 小時之吸 光值 1.545±0.067 , 且細胞與吸光值有線性關係之存在 ; 以此條件 作為口腔鱗狀細胞癌細胞株研究之參考。
本實驗的吾人採用的材料分別是 :(1)氧化鋅丁香油酚基底充填 劑 (ZOE-base) 的 Canals、Canals-N 和 Tubi-seal，(2)氫氧化鈣基底充 填劑 (Ca(OH)2-base) 的 Sealapex , (3)樹脂基底充填劑 (Resin-base) 的 AH26 和 AH plus 的組成 A、組成 B、組成 A 和組成 B 的混合物、
組成 A 和組成 B 的 24 小時後混合物 , 以及氫氧化鈣基底充填劑 (Ca(OH)2-base) 的 Vitapex 的組成 A 和組成 B 的混合物、組成 A 和 組成 B 的 24 小時後混合物共二十六項。由結果發現這二十六項試劑
由低濃度到高濃度的測試物，吸光值隨濃度增加而遞減 ( Figure l-7），結果顯示 survivate rate 由高往下降 , 顯示高濃度樣品對細胞具 有較高的毒性。
這二十六項中 Tubi-seal 的 Base 和 AH26 的 Powder (LD50 均大 於 12.5 mg/100μl)，對口腔鱗狀細胞癌細胞，含較低的細胞毒性 (Table4-9)。
比較 LD50 發現 , 各組成 A 和組成 B 的混合物 , 細胞毒性大小 依次為 AH26 > Canals > Canals-N > Sealapex > Tubi-seal > AH plus >
Vitapex ; 而在組成 A 和組成 B 的 24 小時後混合物中 , 其細胞毒性 大小依次為 AH26 > AH plus > Canals > Tubi-seal > Vitapex > Sealapex
> Canals-N。除 Vitapex 外 , 本次實驗所有混合試劑的凝固時間 , 依 照廠商說明都在 24 小時以內 , 由以上這些結果顯示 : 即使經過足 夠時間的凝固反應 , AH26 和 AH plus 等樹脂基底充填劑的毒性反應 仍然比較高 , 這點可能值得我們在臨床使用樹脂基底充填劑時多加 考量。
另外, 所有混合物之毒性均較 24 小時後混合物為大 , 顯示剛調 拌好的混合試劑可能產生某些毒性較強的物質 , 才造成細胞毒性的 增加 , 經過凝固後這些毒性物質才消失 , 而細胞毒性反應也隨之降 低。不僅是樹脂基底充填劑 , 連氧化鋅丁香油酚基底充填劑和氫氧
化鈣基底充填劑也都有同樣的情況發生。然而當我們進行根管治療使 用根管充填劑的時候 , 都是將剛調拌好的混合充填劑直接放入根管 內 , 所以上述結果提醒我們 : 無論使用何種根管充填劑 , 都要注 意在根管擴大與充填時 , 根尖狹窄 ( apical constriction ) 的維持 , 儘量減少根管充填劑和根尖周圍組織的接觸 , 以降低細胞毒性反應 的影響。
在 Canals 和 Canals-N 方面, 兩種藥劑的不同僅在於 Liquid 的組 成為 Eugenol 或是 Fatty acid。由 LD50 來看 , 無論是 Liquid、Mixed 或 24hr after mixed 的細胞毒性 , Canals-N 均較 Canals 為小 , 尤其是 比較 24hr after mixed 的細胞毒性更是明顯。這結果和 Kouji Araki(9) 所言除去 Eugenol 以降低根管充填劑細胞毒性的結論相同。而且比較 24hr after mixed 的細胞毒性 , Canals-N (LD50 = 2.95 mg/100μl) 甚 至較氫氧化鈣基底充填劑 Sealapex (LD50 = 2.95 mg/100μl) 的細胞 毒性為小。從以上結果看來 , Canals-N 顯然比其他根管充填劑擁有較 佳的生物相容性。
Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 的 1/5 LD50 濃度混合物對口腔鱗狀細胞癌細胞株 , 均會造成時 間效應的細胞毒性 ; 亦即作用時間越久(Table 13, Figure 8) , 其 survival rate 越由高往下降。其中以 AH plus 在 6 至 12 小時間的變化
較為明顯( Survival %由 99.68% 降至 54.79% )。Allan et al., 2001(42) 提出的研究指出在根管內(Root canal)根管充填劑凝固較試管內(In vitro)為慢。由以上結果顯示 : 這些未完全凝固的根管充填劑與根尖 周圍組織作用越長的時間, 組織所受到的毒性刺激越大 , 越可能會 延誤根尖周圍組織之癒合 , 或甚而引發發炎反應 , 所以應該要減少 根管充填劑與根尖周圍組織之接觸。換言之 , 前面所提到在根管擴 大與充填時 , 根尖狹窄 ( apical constriction ) 的維持就顯得更為重 要了。
Adams et al., 1995 的研究(43)指出 : 某些次致死量(sublethal)或進 行性的損傷( progressive injury)所導致的壞死(Necrosis) , 在觀察超微 構造改變時 , 可能也會發現胞體漿凝縮(cytoplasmic condensation)、
大空泡(blebbing) 等現象 , 但這些現象只能說是類似細胞凋零 (Apoptosis)的收縮壞死(Shrinkage necrosis) , 作者認為細胞凋零 (Apoptosis)特有的印記(hallmark) -- 明顯界限的核染色質分隔 (well demarcated chromatin segregation) , 才是判定 Apoptosis 或 Necrosis 的 關鍵。在本實驗中使用 Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、
AH26 和 AH plus 等七種藥物 , 以 1/5 LD50 濃度與口腔鱗狀細胞癌 細胞株作用 1、6、12、24、48 小時後，每一種材料在膠上都沒有使 細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應 ; 但若以上述七種藥物 , 用較低的
濃度(1/10 LD50)與口腔鱗狀細胞癌細胞株作用 6 及 24 小時後，每一 種材料在膠上均可使細胞產生 DNA 碎片的帶狀反應。所以由以上的 證據顯示這七種藥物可能會破壞 DNA 鍵結 , 引起 Apoptosis 現象 , 故其毒性反應引起細胞死亡可能可經由 Apoptosis 所產生。
陸、結論
由本實驗操作下可獲得以下的結論
l﹒樹脂基底充填劑 (Resin-base) 的 AH26 和 AH plus，對於口腔鱗狀 細胞癌細胞株具有較強的細胞毒性。
2﹒氧化鋅丁香油酚基底充填劑(ZOE-base)的 Canals-N，對於口腔鱗 狀細胞癌細胞株具有較佳的生物相容性。
3﹒細胞毒性會隨實驗試劑劑量的增加而增加。
4 . 細胞毒性會隨作用時間的增加而增加。
5 . 無論使用何種根管充填劑 , 都要注意在根管擴大與充填時 , 根 尖狹窄 ( apical constriction ) 的維持 , 儘量減少根管充填劑和根尖 周圍組織的接觸 , 以降低細胞毒性反應的影響。
6. Canals、Canals-N、Tubi-seal、Sealapex、Vitapex、AH26 和 AH plus 等七種藥物 , 其毒性反應引起細胞死亡可能可經由 Apoptosis 所產 生。
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捌、表
玖、圖
Fig.1. 以MTT assay評估Canals對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/100μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The
absorbance of DMSO control group - the absorbance of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.2. 以MTT assay評估Canals-N對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/100μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The
absorbance of DMSO control group - the absorbance of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.3. 以MTT assay評估Tubi-seal對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The
absorbance of DMSO control group - the absorbance of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.4. 以MTT assay評估 Sealapex對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The absorbance of DMSO control group - the absorbance
of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.5. 以MTT assay評估Vitapex 對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The absorbance of DMSO control group - the absorbance
of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%M Sur%24h
Fig.6. 以MTT assay評估AH26對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 15
Concentration (mg/μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The
absorbance of DMSO control group - the absorbance of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.7. 以MTT assay評估AH plus對口腔鱗狀細胞癌細胞株 (OC2)的細胞毒性(Cytotoxicity)
0 20 40 60 80 100 120
0 2 4 6 8 10 12 14
Concertration (mg/μl)
% Survival rate = [(The absorbance of treatment of sample - the absorbance of medium) / (The absorbance of DMSO control group - the absorbance
of medium)] x 100%
Survival (%)
Sur%A Sur %B Sur%M Sur%24h
Fig.8. 利用口腔鱗狀細胞癌細胞株(OC2), 以 MTT assay評 估作用時間與細胞毒性(cytotoxicity)間的關係
0 20 40 60 80 100 120
0 10 20 30 40 50 60
Time (hour)
Survival (%)
S%C S%CN S%TS S%SA S%V S%AH26 S%AH+
