本方法雖然可以廣泛尋找水平基因轉移現象，但在開發階段 all-against-all
比較的分析時間，tBLASTn 的時間和最後處理跑 CLUSTALW 與 MEGA 的時間過久，
勢必需要找出能夠更快分析的方法。另外，最後的實驗輸出仍然需要人工去確認
是否有水平基因轉移現象。
本方法候選基因從哪裡來，甚至是之後到哪裡去的問題。建立了眾多可能有
水平基因轉移現象的演化樹之後便可以採取前述 SPR 方法以建立 phlogenetic
network，如此或許可以完整的呈現一個基因的旅程。因此，本方法可以視作是
建立 phlogenetic network 得前置工作，可以大量得到有效的 data 以供後續研究。
另外，雖然此法可以篩選出水平基因轉移候選，但水平基因轉移現象的確認仍需
結合其他方法，比如 GC content 與 Codon usage 等方法。
另外當比較組中的 Genome 序列太相近時，一點點序列差異便會使
Mahalanobis 距離變得相當大，本次實驗中最大的距離高達 923，但此兩組 genome
為同種不同品系、其序列差異僅只有 1 個 nucleotide，這樣的差異極有可能只是
普通演化現象造成的多樣性，並不是此方法所要討論的重點，因此我們限制了序
列間的相似度必須<70%。但，這樣的限制雖然讓前幾名的輸出能呈現物種的差
異性，仍不能排除有漏掉可能基因轉移現象的可能性。
21
本次研究觀察到 Stigmatella aurantiaca 的水平基因轉移率有 3733 個，並不
算特別突出，因此無法直接證明其基因體大小的異常現象是否和水平基因轉移現
象有關，且我們的方法內仍有需要完全確認的地方，比如 BLAST 的準確性、e-value
條件的設定是否真的可以完整的找到所有的同源基因，又或者 Mahalanobis 的計
算方法，是否能夠完整的找出所有的 outlier，又或者有些 Genome 的構造會使此
方法產生誤差，如真菌類的 Intron 等。
最後，為了真正確認 Genome 大小與水平基因轉移的關聯性，我們仍然需要
用此方法來檢視比較一般的菌種，如 E.coli，來做為對照以說明此假說是否成立。
22
Figure 1 ：利用演化距離不一致確認水平基因轉移現象
給定 Genome A、B、C，如果物種演化樹為上圖，A、B、C 的共有同源
基因之演化樹形式應該呈如此排列，因此 A-B/A-C 應為定值。
在有水平基因轉移現象發生的時候，由於該特殊的基因是經由轉移現象獲得
其距離必定與一般演化得到的基因不同，A-B/A-C 的比值因此而產生差異。
這樣的差異便可以化為座標差異應用在後面的散布圖觀念中。
23
Figure 2 ：利用三條列間的距離建立比較組散布圖
利用 B 為 Y 軸，A-B 的距離為 Y 座標，C 為 X 軸，A-C 的距離為 X 座標
24
Figure 3 ：方法流程圖
本實驗由 tBLASTn 開始 (深藍色區塊)，將欲知物種的全蛋白序列為 query 對
細菌、古生菌、真菌的全基因體進行 BLAST。得到特定蛋白的結果後紀錄其
Bit-score。接著開始進行程式比對部分(橘色區塊)，首先排列兩兩 Genome 做
all-against-all 比對，假設一蛋白在這兩個 Genome 上都有 Hit 的話就可以有一個
資料點，掃描所有共同蛋白後得到一散布點圖，利用 Mahalanobis 距離找出群組
中 outlier 的點。最後的是排序與分析部分(淺藍色區塊)，將 Mahalanobis 距離大
的點挑出利用 CLUSTAL W alignment 後，以 MEGA 建立演化樹，輸出最後的結果。
25
Figure 4 ：all-against-all 比對與比較組
由上半部分 BLAST 的結果開始，假設 query 之蛋白為 α，其與 genome A、B、
C 皆有 hit。紀錄這些 hit 的 bit-score 後，進入到下半部分進行 genome 間
all-against-all 比對，會比較 AB、BC、AC(圖上未顯示)，這兩兩 genome 便被稱為
「比較組」，並可以畫出一個以兩 genome 為軸，bit-score 為刻度之散布圖。共
同對應到的蛋白 α 便以在各自 Genome 上的 bit-score 為 X-Y 坐標，在圖上形成一
資料點。
Genome C
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Figure 5 : 比較序列與 outlier
當我們得到比較組，畫出散布圖，標出所有在其上有 hit 的蛋白點之後，便
可以得到一個有眾多點的群組，一般情況下 Genome B、C，到共同同源的蛋白點
的距離應該是成比例的線性形態(上左)，只是距離較遠的線性可能會有偏向(上
右)，如此群中 outlier 的點便可能是水平基因轉移現象造成的，下圖為一實際的
例子，在 NC_005957.1 與 NC_011658.1 genome 比較組中出現的 outlier 蛋白。
B
C
C
D
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Figure 6：STAUR_2131 之演化樹
此樹的分類將屬於 Bacteria 的 Stigmatella aurantiaca 基因分類入 Fungi 內，
顯示出此基因是由 fungi 轉移過來的。
紅色與藍色邊框是本實驗有包含的 dataset，紅色為 Bacteria，藍色為 Fungi。
原圖來自何宜佩發表之碩士論文[32]。
FA|A. oryzae|BAE66289.1|unnamed protein product FA|A. flavus|XP 002384622.1|conserved hypothetical protein FA|A. oryzae|XP 001827422.2|glucuronan lyase A
FA|A. flavus|XP 002378726.1|conserved hypothetical protein FA|A. oryzae|XP 001823345.1|glucuronan lyase A
FA|T. stipitatus|XP 002484423.1|integral membrane protein FA|P. marneffei|XP 002149242.1|conserved hypothetical protein B|S. aurantiaca|ZP 01465287.1|hypothetical protein STIAU 2222
B|S. aurantiaca|YP 003951762.1|hypothetical protein STAUR 2131 FA|A. clavatus|XP 001274384.1|conserved hypothetical protein FA|N. fischeri|XP 001259598.1|hypothetical protein NFIA 076310 FA|A. fumigatus|XP 753554.1|conserved hypothetical protein FA|A. fumigatus|EDP51830.1|conserved hypothetical protein
FA|S. macrospora|CBI55925.1|unnamed protein product FA|N. crassa|XP 959843.1|hypothetical protein NCU05852 FA|A. nidulans|XP 657616.1|hypothetical protein AN0012.2
FA|N. haematococca|XP 003041896.1|hypothetical protein NECHADRAFT 52969 FA|M. anisopliae|EFY98252.1|glucuronan lyase A
FA|H. jecorina|BAG80639.1|glucuronan lyase A
FA|C. globosum|XP 001226268.1|hypothetical protein CHGG 08341 FA|M. oryzae|XP 363838.1|hypothetical protein MGG 01764 100
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Blastn c2627104-2626334 (STAUR-2131 coding region)
NC_007198.1 (the only one hit)
2798658 2799151
tBLASTn YP_003951762.1 (SRAUR-2131 Protein)
NC_007198.1 2798586 2799350
tBLASTn XP_753554.1 (Aspergillus fumigatus Af293)
NC_007198.1 2798523 2799350
tBLASTn YP_003951762.1 (SRAUR-2131 Protein)
NW_001884672.1 1345381 1344695
tBLASTn XP_001827422.2
(Aspergillus oryzae RIB40)
NW_001884672.1 1345381 1344695
tBLASTn YP_003951762.1 (SRAUR-2131 Protein)
NT_107015.1 42199 42885
tBLASTn XP_657616.1 (Aspergillus nidulans FGSC A4)
NT_107015.1 42130 42885
tBLASTn YP_003951762.1 (SRAUR-2131 Protein)
NW_001092400.1 14676 13987
tBLASTn XP_959843.1 (Neurospora crassa OR74A)
NW_001092400.1 14745 13987
Table 1 ：tBLASTn 效力驗證
利用 Figure.4 之蛋白為 Query 進行 BLASTn 與 tBLASTnQuery 欄對應 Figure.4 中的蛋 白，Hit target 欄為 BLAST 後 hit 到的 Genome，標示紅色為 Figure.4 中有的蛋白，在本實 驗中也有被找到。可以看出圖中的蛋白全部都能夠利用 tBLASTn 的方法找出。
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Figure 7：NC_014844.1 對 NC_014148.1 比較組散布圖
箭頭處為 outlier 點
M.distance 比較組
A Species B Species
16.8986814 NT_107015.1 A.nidulans NC_017850.1 M.oryzae 15.6519429 NC_016582.1 S.bingchenggensis NC_007198.1 A.fumigatus 13.9237548 NC_015957.1 S.violaceusniger NC_007198.1 A.fumigatus 11.8339654 NS_000201.1 P.chrysogenum NT_107015.1 A.nidulans 11.2209951 NS_000201.1 P.chrysogenum NC_007198.1 A.fumigatus 10.6673748 NC_015957.1 S.violaceusniger NW_001884672.1 A.oryzae
Table 2：STAUR_2131 之比較組
比較組之 A、B 各為 Genome，Species 欄為該 Genome 之種名，M.distance
為該點之 Mahalanobis 距離，橘色區塊為 Bacteria，其餘皆為 Fungi。
NC_014148.1 NC_014844.1
YP_003956356
YP_003951646
30
31
Figure 8：STAUR_2131 比較組之散布圖
STAUR_2131 六組比較組中的三張散布圖，箭頭處為 outlier STAUR_2131 點的
位置，皆是肉眼可見的 outlier。
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
NC_015957.1<>NW_001884672.1
NC_015957.1 NW_001884672.1
STARU_2131
32
Figure 9：YP_003951762.1(STAUR_2131)演化樹
藍色 bar 為真菌群類，紅色 bar 為細菌群類。
利用 Neighbor-Join、PAM matrix 為 distance，bootstrap 100 建的樹，可以看到
YP_003951762 被分類在真菌群內，顯示其與真菌群有水平基因轉移現象。
Figure 10：YP_003951762.1(STAUR_2131)樣版演化樹
藍色 bar 為真菌群類，紅色 bar 為細菌群類。建樹條件如上。
兩群分類被完全隔開，且 Stigmatella aurantiaca 確實被分類於細菌群中。
33
Figure 11：YP_003950678 與 YP_003954354 之演化樹
其演化樹與樣版演化樹皆同，建樹方法為 Neighbor-Join、PAM matrix distance、
bootstrap 100。
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Figure 12：YP_003955618 與 YP_003953284 演化樹
其演化樹與樣版演化樹皆同，建樹方法為 Neighbor-Join、PAM matrix distance、
bootstrap 100。
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