首先，本實驗目標為探討地龍是否能促進Schwann cell 移動，及其 調節移動的分子機制為何。結果我們的研究證明了一條經地龍萃取物刺 激後，Schwann cell 移動的特異性訊息路徑- ERK1/2 與 p38 協調之 PAs
及 MMP2/9 活化機制 (圖 4.20) 。細胞經地龍萃取物處理後，會誘導 ERK1/2 與 p38 磷酸化，接著促進 uPA 及 tPA 表現，導致 MMP2 及 MMP9 酵素活性和表現量提高 ; 另外，利用化學性抑制劑與 siRNA 更加確認
了Schwann cell 移動機制為 ERK1/2 與 p38 訊息依賴(Signal-dependent)。
這些年來中草藥受到極大矚目，主要是因其可做為替代或添加藥89 ; 而地龍也是常被使用的中草藥之一33。當周邊神經受傷時，Schwann cell 會在受傷的神經區域移動，並形成Büngner’s band 以支持軸突成功的再 生20；然而有關地龍萃取物對神經再生之影響及促進Schwann cell 移動 之機制也不甚清楚。地龍含有許多營養物質及生物活性； Fibrinolytic enzyme 為地龍的重要成分之一。由於 Fibrinolytic enzyme 具有 plasmin、
plasminogen activator34與類tPA 之功能38，能直接將plasminogen 活化成 plasmin35。故我們推測此地龍萃取物可能會直接活化 plasmin，而提升 MMP9 與 MMP2 的蛋白表現及酵素活性，促使 Schwann cell 移動。
圖
4.20 地龍萃取物促進 RSC96 Schwann cell 移動之機制圖
虛線表示為推測地龍萃取物中的活性成分可能之分子作用機制。另一方面，當周邊神經受傷時會活化 Schwann cell 和巨噬細胞 (Macrophages) 去合成生長促進分子 (Growth-promoting surface molecules) 、細胞激素 (Cytokines) 、貼附分子 (Adhesion molecules) 及 神經親和性因子 (Neurotrophic factors)90,91。神經細胞貼附分子 (Neural cell adhesion molecule ; NCAM) 為免疫球蛋白家族成員之一。研究發現 N C A M 能 經 由 R a s - M A P K 路 徑 誘 導 神 經 軸 突 生 長 ( N e u r i t e outgrowth)92；NCAM 依賴性的細胞移動也需要 MEK- ERK 訊息路徑93。 MAPK 家族的 ERK1/2，p38 及 JNK 皆在神經細胞移動上扮演重要角色
65 ; MAPK 是一群經磷酸化才能展現活性的蛋白酶94。綜合上述研究結
果，我們推論地龍萃取物中的免疫球蛋白家族可能會經由 MEK- ERK 路 徑促進移動。這些生物活性成分也許會藉由間接磷酸化 ERK，導致下游 路徑PAs 與 MMPs 活化，最後致使 Schwann cell 移動，促進神經再生。
本實驗首先證明地龍萃取物處理細胞後，能隨著時間增加，刺激 ERK1/2 與 p38 磷酸化 (Time- dependent)，並促進 Schwann cell 移動；但 JNK 的磷酸化卻是隨之降低。觀察此三個 MAPK 激酶原態的蛋白質表
現量，發現它們會因地龍的刺激而改變。由此可知，地龍在活化MAPK 訊息傳遞路徑時，除了能促進蛋白質生合成作用，提高表現量 ; 也會增 加蛋白磷酸化現象，使其活性提高。
另一方面，為了確定地龍促進RSC96 細胞移動確實是經由活化
MAPK 訊息路徑，我們使用抑制劑 (U0126 和 SB203580)與 siRNA 可以 更清楚看到ERK1/2 與 p38 蛋白質被抑制時，會顯著降低細胞移動; 尤 以ERK1/2 壓制效果最為明顯。綜合上述實驗結果，證明了地龍會經由 活化ERK1/2 與 p38 訊息路徑，促進 RSC96 細胞移動 ; 但 JNK 並無參 與其中。
研究指出uPA 參與促進傷口癒合:如肝臟再生95，與癌細胞轉移61。 Witowsky 等人發現 ERK1/2 參與 uPA 表現的調節 96 ; 此外，p38 也會藉 由調節uPA 表現，控制內皮細胞移動97。我們也進一步實驗發現地龍確 實能直接經ERK1/2 與 p38 訊息路徑促進 uPA 表現。於細胞移動過程中，
會分泌降解細胞外基質分子與細胞貼附的蛋白酶 ; 此蛋白酶包括了 uPA 與 tPA63。PAI-1 則是 PAs 內生性的活性抑制劑。我們的研究數據清
楚地顯示ERK1/2 與 p38 之磷酸化，會伴隨著 uPA 與 tPA 表現量增加 ; 相 反地，PAI-1 表現則逐漸降低。不過於實驗中發現相當有趣的現象: tPA
表現量竟在地龍萃取物刺激2 H 後達到最高量，且持續至 20 H 表現才 開始衰退。推測可能是在神經細胞生長的過程，tPA 為 PAs 中最主要的 蛋白酶98 ; 所以地龍萃取物處理 RSC96 細胞後，便造成 tPA 被迅速且大 量誘導出來。Pittman and Dibenedetto 也曾報導過 tPA 的高度表現會促使 高量神經軸突再生 ; 相較控制組，表現高量 tPA 的細胞移動速度會顯著 增加99。Ulfhammer 等人又進一步發現 tPA 表現會受到 p38 訊息路徑調
控100 ; 如同我們的研究結果，當使用 SB203580 與 siRNA 抑制 p38 磷 酸化態時，會致使tPA 表現也受到嚴重壓制。因此，本實驗不僅證實了 tPA 的活化可藉由 ERK1/2，其尚可經由 p38 訊息路徑。
周邊神經系統( PNS) 之發展與再生，高度依賴著 Schwann cell 的移 動及軸突至遠端標地 (Distant targets) 的延伸。PAs 能分解胞外基質，促 進細胞移動與軸突延伸 101。細胞外基質之分解和細胞增生 102、血管新 生 103、腫瘤轉移與神經組織生長相關 ; 而調節胞外基質分解的其中一 個蛋白質為絲胺酸蛋白酶- uPA61。值得一提的是近來文獻指出Schwann cell 也能產生對周邊神經修補重要的生長因子，如 FGF-2 (Fibroblast growth factor-2)。FGF-2 能誘導和 uPA 表現與功能相關的訊息，方以調
控 uPA 活性 96。我們推論細胞經地龍萃取物處理後，可能會經由活化 FGF-2，促進 ERK1/2 與 p38 磷酸化，導致 uPA 的高度表現。此外，本 實驗的另一個蛋白酶酵素- MMPs (Matrix metalloproteases)也和周邊神
經再生有關 104，並參與許多細胞的移動過程 105。MMPs 剛被分泌至細 胞外時為不活化態，需藉由胞漿素 (Plasmin)106，將其轉變成活化態。胞 漿素則又是經 uPA 或 tPA 活化而來。我們的實驗也顯示了 PAs 表現量 高，確實會伴隨MMP2 與 MMP9 活化。
我們對地龍的研究結果提供了其在神經再生方面的潛在重要功 能。同時也得知地龍雖對神經生長有所益處 ; 但過量的地龍萃取物
(250 ~ 1000 mg/ml) 用於細胞，非但沒有加成的好處，反而對細胞有毒 性，進而降低神經復原能力。因此，最適的地龍萃取物劑量有助提升 Schwann cell 的功能。