Schwann cell的分化、移動、增生、表現生長因子及對再生軸突之
髓鞘化，對受損的周邊神經修補相當重要107。基於上述 MTT assay 與 傷口癒合實驗 (Wound healing)，發現 125 ug/ml 地龍萃取物似乎具有促 進Schwann cell增生與存活能力 ; 接下來我們進一步探討地龍是否也會 影響 RSC96 細胞增生與存活，及其訊息機制又是為何。 根據實驗結 果，我們描繪出地龍萃取物促進Schwann cell增生與存活的可能機制 (圖 4.21) 。研究發現地龍萃取物處理Schwann cell後，會刺激IGF-I協調的 PI3K/Akt訊息路徑，促進細胞存活與活化細胞週期之進行。本實驗為第 一個證明: 地龍萃取物會隨著作用時間增加，而提升PCNA (DNA合成時 被表現的蛋白質) 蛋白合成，與活化IGF-I協調PI3K/Akt訊息路徑，最後 致使細胞增生與存活者; 所活化的PI3K/Akt路徑又可藉由PI3K siRNA 之轉殖給阻斷。
圖
4.21 地龍萃取物促進 RSC96 Schwann cell 存活與增生之機制圖
虛線表示為推測地龍萃取物中的活性成分可能之分子作用機制。近來研究證明IGF-I對神經細胞增生73與存活76相當重要。有關地龍 對於周邊神經再生之相關分子機制尚不清楚。G-90為地龍萃取物中的另 一個重要成份；此醣脂蛋白之混合物具有許多功能，包括抗菌46、抗氧 化47、抗凝血及纖維蛋白溶解活性(Fibrinolysis)40等。實驗顯示細胞經 H2O2處理後，再加入G-90至細胞；相較於H2O2傷害組，發現G-90能使得 細胞回復H2O2的傷害並刺激生長。此外，Grdisa and Popvic等人更是進 一步推論G-90可以刺激纖維母細胞與表皮細胞生長，可能在組織修復上 扮演重要角色。此醣脂蛋白混合物也許會是相當有潛力的傷口癒合試劑
47。G-90含有許多生長因子，包括IGF；研究顯示G-90中的IGF能誘導細
胞增生43。
當人體的周邊神經再生速率緩慢時，相對的會延長器官神經被切 斷的時間，而導致增加永久性癱瘓(Permanent paralysis)之危險108。神經 親和性因子(Neurotrophic factors)是一個能支持與影響神經元再生能力
的家族109；IGFs已被確認為此家族的成員之一110。先前研究已證明哺乳 類的周邊神經再生依賴著IGFs111，而IGF-I不僅會被優越表現於再生神經
中112，且此蛋白表現量的增加和增生中Schwann cell的有關113。IGF-I的 訊息會透過IGF-IR傳遞，參與影響神經元生長與存活114。視神經(Optic nerve)受傷後會高度表現IGF-I以促進細胞存活，且其也會藉由PI3K/Akt 路徑直接誘導神經軸突生長115。此外，IGF-I也會利用PI3K/Akt路徑(為
caspase上游)救援Schwann cell免於細胞凋亡116，以及需要PI3K/Akt協調 細胞週期G1 至 S 的前進(Progression)117。綜合上述我們便推測來自 G-90混合物中的IGF能藉由PI3K/Akt訊息路徑促進Schwann cell增生與 存活。此生長因子能直接利用高度表現IGF-I去誘導PI3K/Akt磷酸化，再 隨即活化下游的抗凋亡蛋白(pBad and Bcl2)與細胞增生指標PCNA表現 增加，caspase表現量下降，及細胞週期G1 至 S 的前進，最後促使細胞 增生與存活。我們的研究確實證明了此IGF-I所協調的PI3K/Akt訊息路徑 參與Schwann cell增生與存活，其可能在周邊神經再生上扮演上要角色。
細胞的存活與凋亡為一體兩面之事。提高之細胞存活(Cell survival)
包含了兩方面的觀念:存活訊息的活化與凋亡訊息的抑制76。PI3K/Akt、
Bcl2家族及 Caspases為目前已知且常測量的存活與死亡訊號 ; 因此，本 實驗選擇了PI3K、pAkt、pBad、Bcl2、Caspase 9及Caspase 3，這六個代 表性的細胞存活與死亡訊息分子進行分析。地龍萃取物處理RSC96細胞 0 ~ 24 H後，利用western blot探討訊息分子蛋白表現。細胞中的存活訊 息(PI3K、pAkt、pBad 及 Bcl2)表現量皆隨時間增加；相反地，代表死 亡的訊號(Caspase 9及Caspase 3)表現則逐漸降低。IGF-I對細胞神經系統 有著諸多影響，包括了促進神經軸生長 (Neurite outgrowth)、誘導細胞 骨 架 重 組 ( R e a r r a n g e m e n t )1 1 8 及 保 護 細 胞 免 於 計 畫 性 死 亡 (Programmedcell death)119。1999年實驗發現初生 (Postnatal) 的Schwann
cell生長在含IGF-I培養液下，能促進細胞存活與預防凋亡 (Apoptotic death)；故IGF-I可能和調控周邊神經發展過程的細胞存活相關120。因此，
IGF-I普遍被認為是促進存活因子116,120。目前研究顯示IGF-I主要是經由 PI3K/Akt路徑來預防Caspases活化與增進存活116 ; 而我們的實驗結果同 意上述論點。當RSC96細胞經地龍萃取物刺激後，會時間依賴性地 (Time dependent manner) 活化IGF-I表現，IGF-I又會再促進PI3K表現，進而Akt 與Bad的磷酸化；磷酸化Bad (pBad) 無法和Bcl2結合，使得抗凋亡蛋白 -Bcl2 被釋放出來121 ；磷酸化的Akt (pAkt) 也會抑制Caspase 9的活性，
導致Caspase 3的活性連帶受到抑制122，而抑制凋亡。
計畫性死亡( Programmed death) 是細胞控制生長、恆定及防禦等過 程細胞數目的方式。倘若細胞凋亡被抑制，促進其存活時，便有可能導 致細胞增生。IGF-I及其協調 PI3K/Akt 路徑除了和細胞存活有關，也和
增生相關123,124。先前學者發現 IGF-I 能經由促進細胞通過G1期，而刺激
DNA合成與細胞複製73 ; 且已知當細胞在進行複製(replication) 時，同時
會 活 化 細 胞 週1 2 5。 增 生 中 的 細 胞 能 通 過 一 些 細 胞 週 期 關 卡 (Checkpoints)，如G1至S期的變遷 (Transitions)；於此些關卡中，以DNA 複製與有絲分裂(Mitosis) 關卡最為重要。因此，我們合理的推論地龍萃 取物會透過改變細胞週期的進行，而影響 Schwann cell 增生。週期的前 進首先需要 cyclin D1 and cyclin E 之活性以通過 G1 期 (Gap phase)，進
入S期126； cyclin A 調控 S 期 DNA 複製與有絲分裂初期 (M phase)
127。我們的研究數據證實了地龍萃取物會誘導細胞週期 G1 至 S 期的前 進，且進一步促使 Schwann cell 由 S 進入 G2 期；另一方面，參與細 胞週期調控的蛋白質：cyclin D1、cyclin E及cyclin A之表現，會隨地龍 萃取物作用的時間逐漸增加，然後提升進入 S 期DNA複製的細胞數 目，以促進RSC96細胞生長。目前有許多實驗利用老鼠的纖維母細胞 (Fibroblasts)128與哺乳類的上皮細胞129 (Mammary epithelial cells) 進行 IGF-I 協調的增生研究，結果顯示IGF-I能刺激細胞通過 G1 期 ; 本研究 數據也同意上述結果，細胞週期的調控不只可以藉由cycilns，也能經由 IGF-I協調。此外，我們的研究結果也提供了個重要的證明:神經細胞的
增生可藉由偵測細胞週期之改變得之。
除了IGF-I外，根據先前所發表文獻，得知Schwann cell尚會分泌其 他貼附分子(Adhesion molecular) 及生長因子(Growth factor)，對於受損
的神經細胞修復和再生有關鍵性的調控功能130。周邊神經受損時，
Schwann cell會移動到受損部位，經不斷分裂增殖與神經生長因子 (Nerve growth factor) 之分泌，可刺激軸突再生和髓鞘形成25,131；除了纖 維母細胞生長因子 (Fibroblast growth factor) 及上述所提到的神經生長 因子能刺激神經再生作用外，更有學者指出肝細胞生長因子 (Hepatocyte growth factor) 對神經幹細胞生長及分化具促進作用132，它同時也是
Schwann cell 有絲分裂源 (Mitogen)133。此外， IGF-1會透過活化 Ras-Raf 路徑增加 cyclin D1蛋白質表現，而促進骨骼肌 (Skeletal muscle) 再生69；故並非所有細胞皆是透過 PI3K/Akt 路徑活化細胞週期。
總結來說，我們發現地龍萃取物會藉促進 IGF-1 及其協調的 PI3K/Akt 路徑蛋白之表現，促進 Schwann cell 存活與增生，導致神經的 再生；可能是經由提升調控細胞週期的蛋白 (cyclin D1, cyclin E, and cyclin A) 表現，而促進 G1 期前進，致使細胞增生 ; 同時也會增加抗凋 亡蛋白Bcl2表現，提高細胞存活。