一氧化氮探針對一氧化氮的高特異性乃是評估應用該探針於了解一氧化氮 多種生物作用方面不可缺少的重要性質。因此本研究針對 FA-OMe 對於一氧化氮 以及其他可能與一氧化氮競爭的活性氧化物或活性氮化物的選擇性進行探討。將 FA-OMe 分別與 8 當量的 NO 及 100 當量的 OH∙、H2O2、HNO、ONOO−、NO2− 及 NO3−反應 2 小時後的螢光強度結果如 Figure 14 所示。在 FA-OMe 與 NO 反應 後溶液螢光強度上升約 8 倍，與其他活性氮、氧化物反應後則是沒有螢光強度的 上升。文獻指出目前已商業化的一氧化氮探針 DAF-28b會與 dehydroascorbic acid (DHA)及 ascorbic acid (AA)反應，造成在生理環境下產生螢光訊號而干擾對一 氧化氮的偵測28。因此我們針對 FA-OMe 對 DHA 及 AA 的選擇性也做了研究，
發現 DHA 及 AA 與 FA-OMe 反應 2 小時後並不會造成 FA-OMe 溶液的螢光強度 增加，此結果說明了 DHA 與 AA 不會影響 FA-OMe 對一氧化氮的偵測。此外亦 有文獻29指出當 H2O2/peroxidase、ONOO−或 OH∙存在下將會造成 o-diaminophenyl group 的氧化形成不穩定的 arylaminyl radical，再與 NO 反應形成 triazole 的結構
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而造成螢光強度上升。由以上結果顯示 FA-OMe 對一氧化氮的特異性優於 DAF-2，
其原因可能是由於相較於 DAF-2 結構上的兩個 amino group，FA-OMe 結構上只 有一個 amino group，因而使得與一氧化氮反應的部位電子密度較低，比較不容 易受到其他活性氮、氧化物、DHA 以及 AA 的影響。
Figure 14. Selectivity of FA-OMe (20 M) for NO over other reactive oxygen and nitrogen species: normalized fluorescence response after 2 h relative to the emission of the probe in 100 mM HEPES buffer at pH 7.4 and 25.0 ± 0.1℃ (ex 460 nm, em 524 nm).
一氧化氮在細胞中的螢光影像研究
將 FA-OMe 應用到偵測細胞中一氧化氮之前，必須先了解 FA-OMe 的細胞 毒性。在本研究中，我們將 Raw 264.7 細胞與不同濃度的 FA-OMe 培養 24 小時，
然後利用 MTT assay 了解細胞的存活率，其結果顯示 FA-OMe 的細胞毒性相當 低，如 Figure 15 所示。
Figure 15. MTT assay on Raw 264.7 murine macrophages treated with different concentrations of FA-OMe for 24 h.
針對內生 性一 氧化氮 之細胞螢 光影 像研究 中，首先 利用 0.5
g mL
1 lipopolysaccharide (LPS)刺激活化 Raw 264.7 巨噬細胞內的一氧化氮合成酶 iNOS，進而使細胞內大量產生一氧化氮。再將受 LPS 刺激過的細胞與 10 M 的 FA-OMe 分別培養 4 小時與 8 小時，並將未受 LPS 刺激過的細胞與 10 M 的 FA-OMe 培 養 12 小時作為對照組。螢光顯微鏡影像結果如 Figure 16 所示，可以觀察到未受
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LPS 刺激活化 iNOS 的對照組並無螢光產生(Figure 16A)，而受到 LPS 刺激活化 iNOS 的實驗組有明顯的螢光產生，並且隨著與 FA-OMe 培養的時間增加，其螢 光影像也愈明顯(Figure 16B 及 16C)。由以上結果得知隨著 FA-OMe 與細胞培養 時間的增加，進入到細胞中的 FA-OMe 也隨之增加，在與細胞內生性的一氧化 氮反應後生成具有螢光的產物 dA-FA-OMe 也增加，因此可觀察到螢光強度增強 的趨勢，同時此結果也顯示 FA-OMe 在細胞中可以成功地獲得內生性一氧化氮 的螢光影像。
Figure 16. Endogenous NO detection in Raw 264.7 murine macrophages by FA-OMe (10
M): (top) DIC images; (bottom) fluorescence. FA-OMe incubation with cells for (A) 8 h without LPS pre-stimulation, (B) 4 h with LPS (0.5 g mL1) pre-stimulation for 4 h, and (C) 8 h with LPS (0.5 g mL1) pre-stimulation for 4 h. The scale bar represents 50 m.
為了解 FA-OMe 停留在細胞內的能力，我們利用 1.25
g mL
1的 LPS 刺激 並活化 Raw 264.7 細胞內的 iNOS 並將受 LPS 刺激過的細胞與 10 M 的 FA-OMe 一起培養 8 小時。然後每隔 10 分鐘將細胞以 PBS buffer 清洗後以螢光顯微鏡觀 察，於 30 分鐘內觀察四次。由結果顯示，細胞經過 PBS buffer 數次的沖洗過程 中，其螢光影像的強度並沒有明顯的變化，表示 FA-OMe 進入細胞與一氧化氮反 應後能有效地停留在細胞中，結果如 Figure 17 所示。推測其原因乃是 FA-OMe 進入到細胞後其結構上的 ester 官能基被細胞內的 esterase 酵素切割，進而形成 FA-OMe-carboxylate 限制了再次通過細胞膜的能力，當 FA-OMe-carboxylate 與 NO/O2反應後生成 dA-FA-OMe-carboxylate 而產生螢光。為了證明在細胞中螢光 訊 號 的 來 源 並 非 來 自 於 FA-OMe-carboxylate ， 我 們 針 對 FA-OMe 與 fluoresceinamine ( 根 據 文 獻 在 pH > 4 的 水 溶 液 中 ， fluoresceinamine 會 以 FA-OMe-carboxylate 形式存在30)在 pH 值 6.5 10.0 範圍內的穩定度進行研究，其結果如 Figure 18 所示。由結果觀察到在此 pH 範圍內 fluoresceinamine 與 FA-OMe 的螢光強度沒有明顯的差別，表示在細胞實驗中螢光訊號的來源並非來 自於 FA-OMe-carboxylate (fluoresceinamine)。
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Figure 17. FA-OMe diffusion/localization in Raw 264.7 murine macrophages: (top) DIC images; (bottom) fluorescence. After each image, the cells were washed three times with 2 mL of PBS. [FA-OMe] = 10 M, [LPS] = 1.25 g mL−1, scale bars 25 m.
Figure 18. pH dependence of the fluorescence intensities of 20 M fluoresceinamine (▲) and FA-OMe (◆) in 100 mM HEPES buffer at 25.0 ± 0.1℃. The fluorescence intensities were detected at 524 nm with excitation at 460 nm. Inset: comparison to that of 20 M dA-FA-OMe (●) in 100 mM HEPES buffer at 25.0 ± 0.1℃.