3.1.1 HQ17(3)修飾 Topo IIα 的半胱胺酸
首先以一段合成的 decapeptide 與 HQ17(3)進行試管反應，利用質譜鑒定方 法證明 decapeptide-HQ17(3)產物的存在。圖一 A 為 HQ17(3)的質譜分析，顯示其
m/z 為 341.25 (-1)，經軟體根據分子量及 peaks 分布圖計算得到，此最強訊號小
分子的組成分為 C23H31O2，為 HQ17(3)帶負電之狀態。進一步以 HPLC-MS/MS 分析 decapeptide-HQ17(3)產物 (圖一 B)。Decapeptide [retention time：4.5 分鐘，m/z 598.2960 (2+)]極性較高，而 decapeptide-HQ17(3) [retention time：9.8 分鐘，
m/z 768.4204 (2+)]極性較低。圖一 C 為根據胜肽母分子 (◆)做二次裂解的圖譜。
圖中所標示出來的訊號為各種裂解片段產物，各片段的 m/z 列於該圖旁。灰色底 標為被偵測到的片段，包括七個 b ions (b2~b4 及 b6~b9)和兩個 y ions (y1 及 y2)。
圖一 D 為 decapeptide-HQ17(3)的二次裂解圖譜，*顯示為具有 m/z 增加 340.25 Da 的片段。灰色底標的片段包括五個 b ions (b5*~b9*) 和一個 y ion (y9*)；此結果 顯示 HQ17(3)具有與硫醇基反應的性質。
以 LCQ 質譜儀分析證明 HQ17(3)與細胞內Topo IIα 的半胱胺酸反應，由圖 二 A 顯示偵測到的所有Topo IIα 胜肽 (涵蓋 14%的序列，以灰底色標示)，其中 有三條胜肽帶有半胱胺酸，分別為 Cys-427、-733 及-1145 (如表一)。Cys-427 位 於 ATPase domain，而 Cys-733 及-1145 則位在 DNA breakage/reunion domain。帶 有 Cys-427 的胜肽 (序列：CSAVK)的質量增加了 340.25 Da，顯示該胜肽 被 HQ17(3)所修飾，MS/MS 圖譜如圖二 B，母分子以◆表示，偵測到 b1~b4 及 y1~y4，
b1~b4 皆帶有 HQ17(3)的修飾。Cys-733 及-1145 胜肽並未帶有修飾 (附圖一 A~B)，
其餘偵測到未帶有半胱胺酸的胜肽則列於附圖二 A~T。此結果顯示 HQ17(3)能夠
另一方面將 recombinant Topo IIα 與 HQ17(3)處理後，以 LCQ 質譜儀分析，
鑑定出的胜肽約涵蓋 40%的Topo IIα 序列，標示於表一的 in vitro 實驗組中，偵 測到十個帶有半胱胺酸的胜肽，包括 Cys-104、-216、-300、-392、-405、-427、
-733、-997、-1008 及-1145，其中 Cys-427、-733 及-997 為被 HQ17(3)修飾的位 置，MS/MS 圖譜如圖三 A~C；其餘未被修飾的含半胱胺酸胜肽則列於附圖三 A~F。
如圖三 D 所標示，此試管實驗及細胞內實驗結果顯示 HQ17(3)的確能夠與 Topo IIα 的數個半胱胺酸反應。
3.1.2 HQ17(3)抑制 Topo IIα 酵素的解螺旋活性
為證實 HQ17(3)是否可藉由與酵素反應而抑制酵素活性，實驗設計利用將酵 素與 HQ17(3)先進行反應後才加入超螺旋 DNA，以觀察酵素解開超螺旋 DNA 的 活性是否降低。從試管 DNA relaxation 實驗中 (圖四 A)，觀察第 5 分鐘及第 20 分鐘所剩餘的 supercoiled DNA 的比例變化，可發現比例從 35%減少至 11%，然 而即使延長反應時間至 60 分鐘或是 360 分鐘，所剩餘比例僅降低至 9%及 8%。
當以酵素比上藥物的莫耳比為 1:200 的前處理反應實驗條件下，剩餘的超螺旋 DNA 的比例則是從 57%減少至 29%，即使延長反應時間至 60 分鐘或是 360 分鐘，
所剩餘比例僅降低至 24%及 22%，此結果顯示 HQ17(3)與酵素反應後，酵素解螺 旋的活性被 HQ17(3)抑制。當酵素比上藥物的莫耳比為 1:800 的前處理反應實驗 條件下，所剩餘的超螺旋 DNA 的比例為 100%，顯示以更高比例的 HQ17(3)的 前處理完全抑制Topo IIα 活性 (圖四 B)。
更進一步藉由加入還原劑以觀察 HQ17(3)是否因 DTT 還原劑的存在而失去 與Topo IIα 反應的作用。從試管 DNA relaxation 實驗觀察得到 (圖五)，40 μM HQ17(3)的處理下造成剩餘的超螺旋 DNA 的比例從 1%增加為 50% (比較 lane 2 及 lane 4)，加入 DTT 及 HQ17(3)的處理組別則是仍有 58%的剩餘超螺旋 DNA (lane 5)，顯示 HQ17(3)抑制Topo IIα 活性的活性並不因 DTT 的存在而受影響。
另一方面，此反應條件下，DTT 並不影響酵素活性 (lane 3)。
3.1.3 HQ17(3)造成 Topo IIα 導致的 DNA 斷裂
由試管實驗方法觀察得到 HQ17(3)造成Topo IIα 導致的 DNA 斷裂情形增加 (linear form DNA)。從圖六 A 結果中發現，Topo IIα 的處理並不會造成 linear form DNA 的產生 (Lane 2)，30 μM HQ17(3)的處理並未造成顯著地 Topo IIα 導致的 DNA 斷裂 (Lane 5)。當增加 HQ17(3)的濃度於 100 μM 時，發現 linear form DNA 明顯增加，與Topo IIα 的處理組別相比，約有 4 倍的上升 (Lane 6)。VP-16 的處 理為陽性對照組，明顯增加Topo IIα 導致的 DNA 斷裂 (Lane 3)。Proteinase K 的 處理則是用於證明出現的 linear form DNA 為蛋白質-DNA 複合體所造成的產物，
此實驗的平均結果及分析如圖六 B 所示。
另一方面觀察 Huh7 細胞中也有 HQ17(3)造成Topo IIα-DNA 複合體的累積的 現象發生。利用 ICE bioassay 方法，觀察Topo IIα-DNA 複合體的比例變化。如 圖七 A 所示，於未經藥物處理的組別中可見 free Topo IIα 出現在 fraction 1~4 (佔 93%)，而僅 7%的Topo IIα 出現於 fraction 5~8；於 HQ17(3)處理的組別 (30 μM) 中，約有 30%的Topo IIα 出現於 fraction 5~8，實驗的平均結果及分析如圖七 B 所示。進一步發現細胞內因 HQ17(3)的處理而造成γ-H2AX 增加的情形。如圖八 A 及圖八 C 所示，10 μM HQ17(3)的處理造成帶有 γ-H2AX 的細胞比例從 9%上 升至 35%。另一方面，比較 HL-60 及 HL-60/MX2 細胞中的γ-H2AX 增加程度，
可見 HQ17(3)造成發生 γ-H2AX 的 HL-60 細胞比例從 20%上升到 70%，然而 HL-60/MX2 細胞中則並未發現此現象 (圖八 B)。將兩株細胞的結果整合於圖八 C，由此結果可歸納出 HQ17(3)於 Huh7 細胞及 HL-60 細胞中造成 DNA 斷裂。另 一方面，利用西方墨點法再次確認 Huh7 細胞中 γ-H2AX 的增加情形，HQ17(3) 處理細胞 45-及 90 分鐘後，明顯造成γ-H2AX 的增加 (圖八 D)。
3.1.4 HQ17(3)促進 DNA 受損相關基因的表現
HQ17(3)的處理導致 DNA 受損相關基因表現量上升。所觀察的基因包括
DDIT3、GADD45A、GADD45G、Mouse double minute 2 homolog (MDM2)、three
prime repair exonuclease 1 (TREX3)及 ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR)；這些基因是將 HQ17(3)處理 Huh7 細胞四小時後，收集 RNA 以 microarray 分析所 得到上升 2 倍以上的基因 (黃政博，博士論文，2008)。本篇研究中以 real-time PCR 的方式確認這些基因的變化，於 Huh7 細胞中處理 HQ17(3)不同時間之後，發現 若干基因表現量於 4 小時處理後明顯上升，變化量持續上升至 12 小時，包括
DDIT3、GADD45A 及 GADD45G，然而 ATR、TREX1 及 MDM2 則無明顯變化 (圖
九 A)。同樣在 HL-60 細胞 中，發現以 HQ17(3)處理細胞四小時後，DDIT3、GADD45A 及 GADD45G 基因表現量明顯上升，分別為 7-、3-及 8 倍的增加，而在 HL-60/MX2 細胞中的上升倍數僅分別為 3-、1.5-及 4 倍的增加，結果顯示這些基因於 HL-60 細胞中的變化較 HL-60/MX2 更為明顯 (圖九 B)。由以上結果歸納出 DNA 受損 相關基因的表現與 HQ17(3)造成的 Topo II poison 有關。
3.1.5 HQ17(3)促進 Huh7 細胞進行細胞凋亡
利用 ACP assay 發現 HQ17(3)造成細胞生長率下降。未經藥物處理的 Huh7 細胞數目於 72 小時後有 10 倍的細胞生長率增加，而經 HQ17(3)以 2-、5-及 10 μM 的處理之後，則僅有 8-、6-及 4 倍的生長倍率 (72 小時)，顯示為細胞生長受抑 制 (圖十 A)，而 HQ17(3)對細胞的毒性 [median effective concentration (EC50)]為 7.3±0.6 μM。
進一步研究顯示 HQ17(3)引發細胞凋亡。如圖 十 B 所示，於 16 小時 HQ17(3) 處理後 ，有 23%的細胞顯示出其粒線體膜電位降低。於 24 小時 HQ17(3)處理後，
發現 21%的細胞發生 annexin V+/PI-的情形，無後期凋亡的細胞群 (annexin V+/PI+)或是細胞壞死 (annexin V-/PI+)的情況 (圖十 C)。於 48 小時的處理後，
60%及 44%的細胞中分別有 caspase 9 及 caspase 3 活化的現象 (圖十 D)。Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)是活化後的 caspase 3 的受質，並且被活化態的
caspase 3 切成較小的蛋白質 (c-PARP)，利用 西方墨點法分析發現細胞內 c-PARP 在 24 小時的 HQ17(3)處理後有上升的現象，說明了 caspase 3 活化的現象 (圖十 E)。
當 DNA 受損時，細胞週期可能因此而停滯，故以 DNA 套數的分析觀察細 胞週期的改變，對照組的細胞週期分別如下：G0/G1 期為 52%、S 期為 40%而 G2/M 期為 8%。當細胞接受 HQ17(3) 24 小時的處理後，G2/M 期無明顯變化 (圖 十一 A)。而且在此條件處理下，其他與細胞週期相關的 cyclin B1 及 cyclin D1 則沒有顯著的變化 (圖十 E)。本實驗以 VP-16 (10 μM)為 Topo II inhibitor 造成細 胞週期停滯於 G2/M 期的陽性對照組。然而在 HQ17(3)的處理中 (24 小時)，發 現具 subG1 的細胞比例增加的情況，代表發生 DNA 雙股斷裂，而且發現長時間 48 小時的處理後，具 subG1 的細胞比例上升至 29% (圖十一 B)。
另一方面以 caspase 3 抑制劑或是 pan-caspase 抑制劑 (抑制 caspase 1、-3、
-6、-8 及-9)前處理 Huh7 細胞後，HQ17(3)處理所造成的具 subG1 的細胞比例明 顯下降。於 10 μM HQ17(3)處理的組別中發現，比例從 25%降低至 15%及 8%；
20 μM HQ17(3)處理的組別則是從 27%降低至 20%及 10% (圖十一 C)；因此可說 明部分 DNA 斷裂是來自於細胞凋亡。
3.1.6 氧化壓力為 HQ17(3)促進 Huh7 細胞的凋亡原因之一
HQ17(3)除了透過抑制Topo IIα 的活性而造成細胞毒性外，也引發細胞內氧 化壓力。如圖十二 A 所示，在 HQ17(3)處理 8 小時後，細胞內的 mitochondrial ROS 含量隨著濃度上升而增加。
接著將細胞預先處理 NAC 以預防氧化性損傷，再加入 HQ17(3)處理以觀察 各種現象的改變。首先觀察細胞內抗氧化相關基因的表現量改變，於 HQ17(3) 處理 12 小時後，HO-1 及 GCLC 分別有 17 及 6 倍的上升 (圖十二 B)，而 NAC 的前處理則有效減緩 HO-1 及 GCLC 的上升的倍數。DDIT3 及 GADD45A 的表現
受 NAC 的影響。另外，各類細胞凋亡的現象，包括 MMP 的喪失、subG1 比例、
caspase 9 及 caspase 3 的活化程度，皆因 NAC 的前處理而有不等程度的減輕，約 降低 50~65%的細胞比例 (如圖十二 C)，以上這些結果顯示氧化壓力是 HQ17(3) 造成細胞凋亡的原因之一。而 annexin V+/PI-的比例僅些微下降。
另一方面，HQ17(3)所造成的Topo IIα-DNA 複合體的累積及增加的 γ-H2AX 量並未因 NAC 的前處理而降低 (圖十三 A 與 C)。由統計圖中顯示，不管在有無 NAC 前處理的條件下，HQ17(3)誘導的 Topo II poison 現象並不因此而具有顯著 差異 (圖十三 B 與 D)。已知 VP-16 所造成的 Topo II poison 已知與氧化壓力無關，
因此 Topo II poison 的現象比例並未因 NAC 的處理而改變 (圖十三 B 與 D)。由 本結果中可得知，氧化壓力並非 HQ17(3)導致 Topo II poison 的機制。
進一步觀察細胞存活率的改變 (72 小時)，發現 NAC 的預先處理並未能拯救 HQ17(3)造成的 Huh7 細胞死亡。以 5 及 10 μM HQ17(3)的處理分別造成 30%與 50%的細胞死亡。加入 NAC 預先處理的細胞，其存活率並沒有因此改變 (圖十 三 E)。已知 HQ 可透過氧化壓力造成細胞死亡，於 NAC 的前處理下，HQ (60 μM) 造成降低的細胞存活率從 20%上升至 70%，因而當做 NAC 拯救細胞的陽性對照 組。以上結果顯示氧化壓力為 HQ17(3)造成的 Huh7 細胞凋亡的部分原因，而並 非主要細胞死亡的原因。