本圖列出目前發現可被小分子修飾的位點。Cys-151、-273 及-288 為已知具有活性的重要位點。
本圖擷取自 Taguchi et al., 201143。
Nrf2 調控的基因
在 Hayes 的研究中歸納出 Nrf2 活化後所調控的基因具有兩大特性，包括 1) 可 代謝並清除外來物質及 2) 具有抗氧化活性的功能49。Nrf2 所調控的基因上游處 都帶有 anti-oxidant response element (ARE)，此序列為 5’-TGACnnnGC-3’。常見 Nrf2 調控的基因包括：heme oxygenase-1 (HO-1)、glutathione S-transferase (GST) 及 glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) 50。
Heme oxygenase (HO)為血紅質 (Heme)的降解酵素，血紅素被代謝後產生 biliverdin、CO 及二價鐵離子 (Fe2+)。Biliverdin 會接著被 biliverdin reductase 代 謝成為 bilirubin，這些血紅素的代謝物被認為是具抗氧化能力的物質。細胞內有 多 種蛋 白質 帶有 血紅素， 如 cytochromes、catalase peroxidase 及 tryptophan oxygenase，可做為 HO-1 代謝的受質來源。HO 有三種亞型：HO-1、HO-2 及 HO-3，
HO-1 為誘導型，被誘導時才表現的蛋白質；HO-2 及 HO-3 為持續表現型。HO-1 的表現是為了負責維持細胞內的恆定，凡舉重金屬、細胞激素、荷爾蒙或是氧化 壓力都會誘導 HO-1 的表現，以提升細胞對於氧化性損傷的耐受性51，不僅是在
細胞實驗中，並且在活體實驗中也有類似的結果 52。GCLC 為 GSH 生成的速率 決定酵素，GSH 可被 glutathione peroxidase 應用於降解過氧化氫的過程41。
1.12 研究目的
本論文將探討 HQ17(3)對於 Huh7 肝癌細胞的毒殺機制是否與 Topo II poison 及氧化壓力有關，並深入研究其是否透過修飾Topo IIα 的半胱胺酸並造成細胞內 Topo II poison 毒性，欲探討的層面包括：Topo IIα-DNA 複合體的累積、γ-H2AX 的增加及細胞凋亡的發生。
另一方面，已知 HQ17(3)為具有抗氧化能力的小分子 3。本篇論文以正常人 類皮膚纖維母細胞 (WS1)作為研究模式，觀察 HQ17(3)是否能夠幫助細胞清除外 來的活性氧自由基，並防止受到氧化性傷害及細胞死亡。更進一步探討 HQ17(3) 的分子層面作用方式，包括 HQ17(3)是否與細胞中 Keap1 的半胱胺酸反應形成鍵 結，進而影響 Nrf2 的活性及 HO-1 的表現量。當以 DNAzyme (DZ)的方式降低 Nrf2 的 mRNA 而降低蛋白質表現量時，除了觀察 HO-1 蛋白質含量的改變外，
也觀察 HQ17(3)所提供的保護效果是否受影響，以證明 Nrf2 路徑與 HQ17(3)的 保護有直接的相關性。
二、實驗方法與材料
2.1 HQ17(3)的純化
取漆樹 (Rhus succedanea)的漆液 100 g 溶解於 900 mL 的 95%乙醇中於 37 °C 低速搖晃 7 天，以 8,000 xg 離心 5 分鐘，取出上清液與 20%甲醇以等體積混合，
以離心方式去除黃油等不溶的部分後，加入 3 倍體積的 ethyl acetate 進行萃取。
以 700 xg 離心 20 分鐘，取上層有機溶液層並抽乾後所得為第一道萃取的粗萃物 (crude)。以酒精回溶後再以 0.45 μM 過濾膜濾掉不溶的部份。接著以 HPLC 的方 式分離樣品，使用 C18 管柱 [discovery bio wide pore C18 (Sulpelco, PA)]，流動相 為 100%甲醇，利用 OD280nm觀察並收集最主要的三個波峰。將第一次的回收物 抽乾回溶並過濾後，再進行第二道的 HPLC。以同樣型號的 C18 管柱，再以 90%
甲醇分離出 HQ17(3)、HQ17(2)、HQ17(1)。將 3 個化合物分別濃縮後，並回溶於 DMSO，以 JASCO V550 分光光度計 (JASCO International Co, Tokyo, Japan)測定 吸光光譜並定量3。
2.2 細胞培養及藥物處理條件
Huh7 及 WS1 細胞培養於 37 °C 恆溫、含 5% CO2的培養箱中，所使用的培 養液為 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)，添加 2 mM L-glutamine、
1.5 g/L sodium bicarbonate、0.1 mM non-essential amino acids、10% fetal bovine serum、100 U/mL penicillin，100 μg/mL streptomycin 及 250 ng/mL amphotericin。
培養於 10 公分培養皿中，待長滿至約八分滿時，便進行繼代培養。吸去培養液，
以 PBS 清洗後，加入 1 mL trypsin/EDTA (0.05%/0.025%)放置 5 分鐘，待細胞飄 起後，加入四倍體積的培養液以中和 trypsin 的作用並打散細胞，留下 1 mL 細胞 懸浮液於盤中，再補體積至適當量，搖勻細胞使其平均分散於盤中，再放入培養 箱培養。於 Huh7 細胞模式中，HQ17(3)的處理條件於不同時間點的濃度為10 μM，
時間點則附註於圖說明中；NAC 為 1 mM 處理 3 小時；caspase 抑制劑則是 4 mM 處理 3 小時。
HL-60 及 HL-60/MX2 細胞為懸浮型細胞，使用 RPMI 為培養基，每隔兩天 將細胞打散並補充新鮮培養基即可。
2.3 蛋白質萃取及西方墨點法
細胞核蛋白及細胞質蛋白萃取
以 trypsin 處理細胞後，以 PBS 清洗後離心，移除上清液後加入400 μL buffer A [10 mM HEPES (pH 7.8)、10 mM KCl、2 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、
1 mM NaF、1 μg/mL leupeptin、20 μg/mL aprotinin 及 0.1 M PMSF]，置於冰上 10 分鐘，其間搖晃數次，最後加入25 μL 10% NP-40 混勻後，以 800 xg 於 4 °C 離 心 5 分鐘，上清液為細胞質蛋白的部分，pellet 則為細胞核。以 buffer A 清洗細 胞核兩次後，以 buffer B [50 mM HEPES (pH 7.8)、50 mM KCl、300 mM NaCl、
0.1 mM EDTA、1 mM DTT、10% glycerol、1 mM NaF、1 μg/mL leupeptin、20 μg/mL aprotinin 及 0.1 M PMSF]打散細胞核，並以超音波 (Ultrasonic Device, GmbH, Ringwood, NJ)強烈震盪 (sonication)以打破細胞核，再以 12,000 xg 離心 2 分鐘去 除 pellet，上清液為細胞核蛋白質的部分53。
全細胞蛋白質萃取
收集處理過後的細胞，以 PBS 清洗後離心，移除上清液後加入 50 μL lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM EGTA、1 mM NaF、150 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM PMSF、1 mM Na3VO4及 1% triton X-100]並以超音波震盪打破細胞，
再以 12,000 xg 離心 10 分鐘取上清液全細胞蛋白質的部分5。 西方墨點法 (Western blot analysis)
蛋白質以 BCA assay (Thermo Scientific, Rockford, IL)定量，取60 μg 蛋白質，
加入 4x loading dye，並加熱 95 °C (5 分鐘)以打開蛋白質的結構，利用 10% SDS PAGE 分離不同大小分子量的蛋白質，接著轉印至 nitrocellulose (NC) paper 上，
以 1X TTBS 清洗，以 5% non-fat milk blocking 後，再與 Topo IIα 抗體 (1：1000，
型號 sc-56803，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、γ-H2AX 抗體 (1：1500, 型號 05-636, Millipore, Billerica, CA)、c-PARP 抗體 (1：2000, 型號 9541P, Cell Signaling, Beverly, MA)、HO-1 抗體 (1：2000, 型號 OSA-110, Enzo Life sciences, Farmingdale, NY)或是 Nrf2 抗體(1：2000, 型號 sc-722, Santa Cruz Biotechnology) 於室溫反應 1 小時，以 1X TTBS 清洗，加入二抗 [1：5000, horseradish peroxidase conjugated secondary antibody (Zymed, CA)] 於室溫反應 1 小時，以 1X TTBS 清 洗，最後以冷光呈色反應 [enhanced chemiluminescence Western blotting detection system 觀察，以 LAS-4000 image analyzer (FUJIFILM Medical Systems U.S.A., Inc., CT, USA)拍照並定量。
2.4 人類 recombinant Keap1 蛋白質的純化
以 pET28c (+)為載體，將 HA2-Keap1 核苷酸序列置於 SalI 及 XhoI。參照 Eggler 等人的實驗方法純化 Keap1 蛋白質54。方法如下，將該質體轉形 (transform) 至 Rossetaa/DE pLys 細菌株中培養，待 OD600達 0.5~0.6 時，再用 0.2 mM IPTG 誘導蛋白質表現，於 15 °C 中培養 24 小時。收集細胞前先加入 1 M Tris 以升高 pH 至 8.0，才將細胞離心並打散懸浮於 lysis buffer [50 mM Tris/pH 8.0、500 mM NaCl、10 mM imidazole、7.5 mM MgSO4、3 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)、1 mM PMSF、0.1% triton X-100 及250 μg/mL lysozyme]，
接著以超音波震盪打破細胞，以 12,000 xg 離心十分鐘收集上清液。加入 Cobalt metal chromatography (Clontech, Mountain View, CA)以純化 Keap1 蛋白質，此純 化步驟於 4 °C 中進行並搖晃一小時，之後以 5%~40% buffer B (50 mM Tris/pH 8.0、
500 mM NaCl、1 M imidazole、0.1% triton X-100、3 mM TCEP 及 1 mM PMSF) 將蛋白質從 Cobalt resin 上沖提出來並透析 (25 mM Tris-HCl/pH 8.0、2 mM TCEP 及 20% glycerol)，分裝並保存於-80 °C。
2.5 HQ17(3)修飾蛋白質硫醇基的產物分析
HQ17(3)與 Topo IIα 的硫醇基反應
接種 Huh7 細胞於 10 公分培養皿 (1 x 106 cells)中，加入 10 μM HQ17(3)處 理五個小時，以上述方法收集細胞核蛋白質。取 60 μg 核蛋白以 6% SDS-PAGE 分離各個蛋白質，以 Coomassie blue 染色，將 170 kDa 處 (Topo IIα 的大小約為 170 kDa)的膠切下 並 沖提出 其中的 蛋白質。另一方面 ，本篇論文所使用的 recombinant Topo IIα 為台灣大學詹迺立教授實驗室所提供，以供分析 HQ17(3) 與Topo IIα 的試管內反應。將 20 μM HQ17(3)與 recombinant Topo IIα (0.5 μM)反 應 20 分鐘，反應溶液為 Topo II buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.9)、50 mM NaCl、
50 mM KCl、5 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、15 μg/mL BSA 及 1 m M ATP]。
接著用 trypsin (2 μg, Promega, Madison, WI)水解 cellular Topo II 或是 recombinant Topo IIα (於 37 °C 下反應 16 個小時)，再以 Finnigan LCQ ion trap 質 譜儀 (ThermoElectron, San Jose, CA)分析反應產物。實驗方法參照 Bender et al., 200728，此套儀器搭配 Micro-Tech Scientific protein-15-C18W-300 reversed phase HPLC 管柱 (5 μm, 150 mm x 300 μm, 300Å)，流動相 A 為含有 0.1% formic acid 的水，流動相 B 為含有 0.1% formic acid 的 acetonitrile，沖提的條件為：前 180 分鐘由 5% (流動相 B)增加梯度至 95% (流動相 B)，再以 95%流動相 B 繼續沖提 40 分鐘。於每個 mass spectra 中訊號最高的 peak 會被送入做二次裂解以鑒定胺 基酸序列，軟體為 BioWorks 3.1 及 TurboSEQUEST (ThermoElectro)進行蛋白質鑑 定55，於搜尋條件中指定 Cysteine 的修飾為 340.25 Da 以尋找產物的存在，MS/MS 結果品質的判定根據 Xc > 0.3、Cn > 0.1、Rsp 為 1 或 2 者，並進一步挑選 MS/MS 的裂解片段至少帶有三條片段者。
HQ17(3)與 Keap1 的硫醇基反應
將一段合成的 Keap1 胜肽 [序列為 LNVRC241ESEVF，decapeptide (500 μM)]
與HQ17(3) (200 μM)置於 37 °C 下反應 24 小時，反應溶液為 1 mL Tris-HCl (25
mM，pH 8.2)56，之後透過 C18 column (Glen Research Inc., Sterling, VA)去除反應 中的鹽類，以真空抽去液體並回溶於 15% (v/v) acetonitrile 含有 0.1% (v/v) formic acid 的溶液中，再以 Agilent 6510 四極體質譜儀 (Santa Clara, CA)分析反應產物。
此套儀器搭配 GRACE VYDAC C18 column (150 mm x 2.1 mm) (GRACE, Deerfield, IL)。流動相 A 為 HPLC 等級水，流動相 B 為 100% acetonenitrile，沖 提的條件為：前 5 分鐘將流動相 B 的比例由 15%增加梯度至 40%，之後於 10 分 鐘內再增加梯度至 100%。掃描質譜的方式為偵測 m/z 598.29 (2+) (decapeptide) 及 768.41 (2+) [decapeptide-HQ17(3) adduct]的訊號。
另一方面偵測 HQ17(3)與細胞內的 Keap1 反應產物。接種 WS1 細胞於 10 公 分培養皿 (1 x 106 cells/dish)中，加入 1 μM HQ17(3)處理五個小時，以 trypsin 作 用將細胞打下並以 PBS 清洗後離心，以上述方法收集細胞質蛋白質。取 60 μg 質蛋白以 10% SDS-PAGE 分離各個蛋白質，以 Coomassie blue 染色，將 67 kDa 處 (Keap1 的分子量約為 67 kDa)的膠體切下並沖提出其中的蛋白質。同樣也以 試管反應偵測 HQ17(3)與人類 recombinant Keap1 反應產物。將 200 μM HQ17(3) 與 recombinant Keap1 (10 μM)反應 20 分鐘，反應溶液為 Tris buffer [25 mM Tris-HCl (pH 8.0)]。將 Keap1 以 trypsin (2 μg)水解後 (於 37 °C 下反應 16 個小時)，
再以 Finnigan LCQ ion trap 質譜儀分析反應產物，分析方法如實驗 2.2 部分所述。
2.6 試管實驗分析 Topo II 誘導 DNA 斷裂的形成
根據 Fortune 及 Osheroff 的研究進行 Topo II 誘導 DNA 斷裂的反應57。反應 包含 340 nM Topo IIα、10 nM RF-f1p DNA、0~100 μM HQ17(3)或是 200 μM VP-16，
反應體積為20 μL，DNA cleavage buffer 為 10 mM Tris-HCl (pH 7.9)、5 mM MgCl2、 100 mM KCl 及 0.1 mM EDTA。此反應於 37 °C 中進行 6 分鐘，爾後加入 2 μL of 5% SDS (final：0.5%)及 1 μL 的 250 mM EDTA (pH 8.0)以終止反應。之後加入 4 μL proteinase K (10 mg/mL)於 37 °C 處理 60 分鐘以水解蛋白質，將樣品加入 3 μL
μg/mL ethidium bromide)分開各種不同的 DNA，包括 linear、nicked DNA 及 supercoiled DNA，再以 UV 觀察並以 ImageJ (ver 1.42)分析觀察 supercoiled DNA 被切斷成 linear DNA 的比例。
2.7 試管實驗分析 Topo II 活性
參考 Lindsey et al., 2005 的方法26，利用偵測 supercoiled form plasmid DNA 被 Topo II 解開螺旋成 relaxed form DNA 的程度做為決定 Topo II 酵素活性的方法。
反應包含 10 nM Topo IIα、400 nM negatively supercoiled RF-f1p DNA、0~40 μM HQ17(3)或是 20 μM VP-16，反應體積為 20 μL。Topo II buffer 為 10 mM Tris-HCl (pH 7.9)、50 mM NaCl、50 mM KCl、5 mM MgCl2、15 μg/mL BSA、1 mM ATP 及 0.1 mM EDTA。為觀察 dithiothreitol (DTT)還原劑對於 HQ17(3)抑制 Topo II 活性的影響，於加入 DTT 後才起始反應。反應條件為於 37 °C 下反應 20 分鐘後，
以 95 °C 處理 5 分鐘以終止酵素活性並加入 DNA loading dye，利用 1% agarose gel (以 0.5X TPE 配置)以 50V 電壓分離 relaxed、supercoiled 及 nicked form DNA，將 膠體以 EtBr 外染的染色方式並利用 UV 觀察結果。
2.8 Immunodetection of in vivo complexes of enzyme to DNA (ICE bioassay)
此方法利用氯化銫 (CsCl)梯度溶液以超高速離心將 DNA 與蛋白質層分離，
並搭配 dot-blot 方法分析30。CsCl 梯度溶液 (1.6-1.8 mg/mL)配置於 polyallomer tube 管中 (14 mm x 89 mm，適用於 SW41 bucket，Beckman Coulter)。Huh7 細 胞 (107 cells /10-cm dish)經 HQ17(3)或是 VP-16 處理 90 分鐘，去除上清液，於盤 中加入 2 mL sarkosyl lysis buffer (1% sarkosyl/TE buffer)，以 27 1/2G 號針頭抽吸 十二次以打斷染色體，此 lysate 隨即加於 CsCl 梯度溶液之上，於室溫 (20 °C) 進行超高速離心 125000 xg 20 小時 (低溫會使 CsCl 沉澱而破壞梯度)。待離心結
束後，將每管樣品分成 10 個 fractions (從上至下：1 mL/fraction)，取等體積與 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5)混合後，取 50 μL 的混合液以 dot-blot 方式將 樣品利用真空抽取方式轉至 NC paper 上 (NC paper 須先以 sodium phosphate buffer 浸濕 15 分鐘)，之後以西方墨點法偵測Topo IIα。Fraction 1~4 為蛋白質層，
可偵測到 free Topo IIα 蛋白質，而 fraction 5~8 為 DNA 層，與染色體形成共價鍵 結的 Topo IIα 會出現於此處，Fractions 9~10 為 RNA 層。以 LAS-4000 image analyzer 拍照並定量，計算 fraction 5~8 所佔的百分比。
2.9 免疫螢光組織染色
將細胞培養於蓋玻片上 (3 x 105 cells)，並加入藥物處理 90 分鐘後進行染色。
將細胞培養於蓋玻片上 (3 x 105 cells)，並加入藥物處理 90 分鐘後進行染色。