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從DH5α-pTriEx-hTreH (isoform 1) 野生型的菌保中抽出
pTriEx-hTreH (isoform 1) 野生型質體，然後轉形到製備好的 E. coli strain BL21 (DE3)、Origami、Origami (DE3)、Origami (DE3)pLacI、
AD494 (DE3) Competent cell 中，之後塗於含有 Ampicillin（100 μg/ml）
的培養基中，置於 37℃培養箱中培養隔夜，再挑選正確的菌落培養，
隔天從培養基中挑取 1 顆菌落至 5 mL LB medium (含 100 μg/ml Ampicillin)，然後於 37℃、225 rpm 培養 16-18 小時。
隔天從培養基中挑取 1 顆菌落至 5 mL LB medium (含 100 μg/ml Ampicillin)，然後於 37℃、225 rpm 培養 16-18 小時。之後取 2 mL 菌 液到 50 mL LB medium (含 100 μg/ml Ampicillin)，然後於 37℃、225 rpm 培養 2 小時，再來加入 IPTG (終濃度為 0.4 和 1 mM) 後於 37℃、 物，並使用超音波均質機 (sonicator; MicrosonTM, XL 2000，強度設 定 5W) 方式進行破菌，最後以 4℃、8,000 rpm、離心 15 分鐘取上清 液和 pellet 來跑 SDS-PAGE，並於 marker 顯示位置約 58 kDa 位置有 一個主要 band，即為誘導出來之 human trehalase (isoform 1)。
pET-23a system
2.1.1 Human trehalase (isoform 1) 野生型於大腸桿菌中的表達
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參照 2.1 的表達條件 (圖五 A、B、C)。
2.2 Human trehalase (isoform 2) 野生型於大腸桿菌中的表達 Origami (DE3)、Rosetta-gami B (DE3)-pET23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型在 37℃下誘導 0-3 小時、AD494 (DE3)-pET23a(+)-hTreH (isoform 2)野生型在 37℃下誘導 0-4 小時和 BL21 (DE3)-pET23a(+) -hTreH (isoform 2) 在 37℃下誘導 2 小時；而在 20℃下除了 BL21 (DE3)- pET23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型誘導 2 天以外，其它的宿 主則誘導 0、1、2 天，剩下參照 2.1 的表達條件 (圖六 A、B、C)，最 後以 4℃、8,000 rpm、離心 15 分鐘取上清液和 pellet 來跑 SDS-PAGE，
並於 marker 顯示位置約 55 kDa 位置有一個主要 band，即為誘導出來 之 human trehalase (isoform 2) 野生型。
2.2.1 Human trehalase (isoform 2) (C175S) 突變株的表達 參照 2.1 的表達條件 (圖七 A、B、C)。
2.2.2 Human trehalase (isoform 2) (C28/34/175S) 突變株的表達 參照 2.1 的表達條件 (圖八 A、B、C)。
2.2.3 Human trehalase (isoform 2) (C28/34/175/202S) 突變株的表達 參照 2.1 的表達條件 (圖九 A、B、C)。
2.2.4 Human trehalase (isoform 2) (C175A) 突變株的表達 參照 2.1 的表達條件 (圖十 A、B、C)。
2.2.5 Human trehalase (isoform 2) (C175/202A) 突變株的表達 參照 2.1 的表達條件 (圖十一 A、B、C)。
五、 Human trehalase (isoform 2) 野生型與 (C28/34/175/202S) 突變 株的純化
1. 蛋白質粗萃取液
各別將 50mL 的 BL21 (DE3) pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型
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和 BL21 (DE3) pET-23a(+)-hTreH(C28/34/175/202S) 培養液經離心完 後的菌體，以 5 mL 1X 的破菌液來重心懸浮，然後使用超音波均質機 (sonication; MicrosonTM, XL 2000，強度設定 5W) 在冰上的方式進行 破菌，每破菌 15 秒後休息 15 秒，重復此步驟 10-20 次，最後以 4℃、
8,000 rpm、15 分鐘離心取上清液，即可以獲得 BL21(DE3) pET-23a(+)-hTreH(isoform2) 野生型 和 BL21(DE3)pET-23a(+)- hTreH(C28/34/175/202S) 的上清液。
2. 固定化金屬離子親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC) 純化蛋白質
因為在 pET system 所表達的人類海藻糖水解酶在 C 端帶有 his-tag，
因此可以 IMAC 作純化，其純化條件如下:
A. 1 mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 10 mL binding buffer (20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4、0.5 M NaCl、20 mM imidazole) 平衡管柱。
B. 加入 5 mL 的蛋白質上清液，再以 10 mL wash buffer(20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4、0.5 M NaCl、20 mM imidazole) 沖 洗掉雜蛋白。
C. 加入 10 mL elution buffer (20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4、
0.5 M NaCl、0.5 M imidazole)，將目標蛋白從管柱上沖洗下，且 收集有目標蛋白的部分 (圖十二 A、B)。
D. 把目標蛋白質的部分以透析袋來進行透析，其透析溶液在 1L 的 20 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4 進行透析，每 3 個小時置換 成新的透析溶液來隔夜透析。
E. 最後將透析後的酵素分裝至微量離心管中，置於-20℃保存。
六、 Human trehalase 重組蛋白質的重新摺疊方法 (Protein refolding)
41 100 μg/ml Ampicillin)，然後於 37℃、225 rpm 培養 2 小時，再來 加入 IPTG (終濃度為 0.4mM) 後於 37℃、225 rpm 培養 2 小時以 誘導蛋白質大量表現。
B. 接著以 5 mL 的 1X 破菌液來破菌，並使用超音波均質機 (sonicator;
MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、8,000 rpm、
離心 15 分鐘取 pellet。
C. 收集到的 pellet 以 10 mL wash buffer (50 mM sodium phosphate、
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100 mM NaCl、0.5% Triton X-100、pH 8.0) 沖洗，然後以 4℃、
8,000 rpm、離心 15 分鐘，倒掉上清液，重覆此步驟四次。
D. 接著以 10 mL wash buffer(50 mM sodium phosphate、100 mM NaCl、
pH 8.0) 沖洗一次，之後以 4℃、8,000 rpm、離心 15 分鐘以移除 Triton X-100，留下 pellet。
E. 再加入 5 mL 的 8 M Urea 和不同濃度的 DTT 來回溶 pellet，置於 phosphate、pH 7.0) 進行透析隔夜。
H. 最後再依測試條件及蛋白質本身含有雙硫鍵，所以要透析再含有 1 mM GSH/0.2 mM GSSG 的透析溶液裡進行透析隔夜。
I. 取出部分已經摺疊好的 hTreH 來做純化 (圖十三 A、B、C)。
J. 取出部分已經摺疊好的 hTreH 來跟受質海藻糖進行反應並測活性 (圖十四)。
1.1.2 用 N-Lauroylsarcosine 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進 行復性流程
A. 蛋白質取得參照上述 1.1.1 之 A。
B. 用 5 mL 的 1X IB Wash Buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1%
Triton X-100, pH 7.5) 來破菌，並使用超音波均質機 (sonicator;
MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、10,000×g、離 心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet，重覆此步驟 3 次。
C. 然後再以 4℃、10,000×g、離心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet。
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D. 秤 pellet 的濕重後，加入相對量的 1X IB Solubilization Buffer (0.3%
N-lauroylsarcosine, 1 mM DTT, 50 mM CAPS, pH 11.0)，來回溶 pellet。
FPLC 式 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding
A. 蛋白質取得參照上述 1.1.1 之 A。
B. 然後用 4 mL 的 20 mM sodium phosphate (pH 8.0) 回溶 pellet，並 使用超音波均質機 (sonicator; MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破 菌，最後以 4℃、10,000×g、離心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet。
C. 接著用 3 mL wash buffer 1(2 M Urea、20mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 2% Triton X-100, pH 8.0) 回溶 pellet，並使用超音波均質
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機 (sonicator; MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、
10,000×g、離心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet，重覆 2 次。
D. 再用 3 mL wash buffer 2 (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 2%
TritonX-100, pH8.0) 回溶 pellet，並使用超音波均質機 (sonicator;
MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、10,000×g、離 心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet。
E. 最後用 5 mL 回溶內聚體的回溶溶液 (6 M guandine hydrochloride, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0)，之 後在室溫下攪拌 30-60 分鐘，然後在 4℃、10,000×g、離心 15 分 鐘，留上清液，並用 0.22 μm 或是 0.45 μm 過濾器來過濾上清液，
以除去多餘的不可溶顆粒。
F. 接著使用 FPLC( Fast Protein Liquid Chromatography) 來做管柱上 的重新摺疊蛋白質，使用的機型為 AKTAprime™ Automated Liquid Chromatography System(GE Healthcare)，其管柱為
Ni+column。而使用的 Binding Buffer、Washing buffer、Refolding buffer、Elution Buffer 成分如下:
Binding Buffer 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 6 M guanidine hydrochloride,1 mM 2-ME pH 8.0
Washing buffer 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole,6 M urea, 1 mM 2-ME pH 8.0
Refolding buffer 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, 1 mM 2-ME pH 8.0
Elution Buffer 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 1 mM 2-ME pH 8.0
縮寫:2-mercaptoethanol (2-ME)
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G. 下圖為 AKTAprime™ Automated Liquid Chromatography System (GE Healthcare) 所提供參考之純化流程圖 (附錄十)，即為本實驗 純化步驟之模板，設定流速為每分鐘 1 mL。 和 (C28/34/175/202S) 進行 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding
除了回溶內聚體的回溶溶液是從 6 M guandine hydrochloride 換成 6 M Urea 以外，其它步驟跟上述 2.1 用 6 M GnHCl+1 mM 2-ME 來進行 FPLC 式蛋白質復性流程一樣 (圖十八 A、B、C)；此外還用相同的復 性流程條件下來做手動式的 denaturing affinity-column adsorption 方法 的 on-column refolding (圖十九) 和做 pET23a (+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175/202S) 突變株的蛋白質復性流程 (圖二十)。
2.3 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野 生型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding
A. 蛋白質取得參照上述 1.1.1 之 A。
B. 接著以 5 mL 的 1X 破菌液來破菌，並使用超音波均質機 (sonicator;
MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、8,000 rpm、
離心 15 分鐘取 pellet。
C. 再用 5 mL IB solublization buffer(8 M Urea, 20mM sodium
phosphate, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0) 回溶 pellet，然後
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在 37℃靜置 4 小時。
D. 之後把上述回溶後的溶液在加入等體積的 CTAB 溶液 (20mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl, 1.2 mM CTAB,20 mM imidazole, pH 8.0)，混均勻後在室溫下靜置 10 分鐘後，以 4℃、10,000 rpm、離 心 15 分鐘取上清液。
E. 然後把上清液來通固定化金屬離子親和性層析法 (Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC) 的 Ni+column。
F. 再來用 36 mL 的 wash buffer (20 mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl, 生型進行 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding
47 型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding
A. 蛋白質取得參照上述 1.1.1 之 A。
B. 接著以 5 mL 的 1X 破菌液 (8 M Urea, 10mM sodium phosphate, 20 mM 2-ME, pH 8.0)來破菌，並使用超音波均質機 (sonicator;
MicrosonTM, XL 2000) 方式進行破菌，最後以 4℃、8,000 rpm、
離心 15 分鐘取 pellet。
C. 用 5 mL 的 1X IB Wash Buffer (20 mM sodium phosphate, 10 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 7.4) 來回溶 pellet，接著以 4℃、10,000
×g、離心 10 分鐘，倒掉上清液取 pellet，重覆次步驟 3 次。
D. 加入 5 mL 的 1X 破菌液 (8 M Urea, 10mM sodium phosphate, 20 mM 2-ME, pH 8.0)來回溶 pellet。
E. 接著放置沸水中加熱 10 分鐘後，並以 4℃、10,000×g、離心 10 分 鐘留上清液。
F. 1 mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow)，先以 1X 破菌液 (8 M Urea, 10mM sodium phosphate, 20mM 2-ME, pH 8.0) 平衡管柱。
G. 加入 5 mL 的蛋白質上清液到管柱中後，再以 1X 破菌液 (8 M Urea, 10mM sodium phosphate, 20mM 2-ME, pH 8.0) 來平衡管柱並沖
48 液(20 mM sodium-phosphate buffer, 0.1mM DTT, pH 7.4) 下進行透 析，每 3 個小時置換成新的透析溶液來隔夜透析，重復 2 次。
A. 40 %(w/v) acrylamide：ACRYL/BIS=37.5：1 solution (Bioshop) B. Ammonium persulphate (APS)
C. 10 % SDS solution
D. Stacking gel buffer: 配製 0.5 M Tris-HCl 溶液，pH 6.8。
E. Resolving gel buffer：配製 1.5 M Tris-HCl 溶液，pH 8.8。
F. N,N N’ N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)
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G. Tris-glycine electrophoresis buffer：含 0.025 M Tris、0.192 M glycine 與 0.1 % SDS，pH 8.3。 4x Resolving gel
buffer (pH 8.8) 4x Resolving gel buffer: 1.5M Tris，pH 8.8
4 %焦集膠體 (stacking gel) 的建議溶液配置方法 (兩片膠量): Tetramethylethyle-nediamine 4.2 μl 6.2 μl 8.2 μl Ammonium persulphate 16.7 μl 25 μl 33.4 μl Total volume 3.3 mL 5 mL 6.7 mL
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3. 聚丙烯醯胺凝膠體的製備
將陶瓷片和玻璃片中間以 1.5 mm 的兩個隔間條夾起來，然後放入 鑄膠器 (Hofer Mighty Small, dual gel caster, SE200 series) 內，接著以 對角的方式來鎖緊。再加滿 95%酒精來靜置 5 分鐘確定鑄膠器底部是 buffer (Tris 24.9 mM, Glycine 191.8 mM, SDS 3.46 mM)，然後放至於 沸水中煮 5 分鐘後冷卻，接著取適量待測的蛋白質樣本注入樣本槽中，
一開始先以 60 伏特進行電泳，等待測的 sample buffer 指示劑進入焦 集膠體後，再以 140 伏特繼續進行電泳。
5. 聚丙烯醯胺凝膠體的染色與退染
以 Coomassie Brilliant Blue R-250 來染蛋白質電泳膠體。
[染色液]
51 albumin, BSA) 來當作標準品 (Sigama,P-7656)，先配好一組終濃度分 別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的標準品，和把待測樣品做適當 稀釋後，各別加入 200 μL 的 Bradford reagent dye (5 倍稀釋) (Bio-rad, 500-0006) 於 96 孔盤內反應 10 分鐘後，拿去 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reader 測 OD595，所得出來的值可以做出標準曲 線，然後就可以算出待測物的蛋白質濃度。
八、 Human trehalase 重組蛋白質的活性測定分析
Human trehalase 的活性測定---高效能液相層析分析 Accetic acid 100 mL
52 本以 HPLC (High pressure liquid chromatography) 進行活性分析。
而糖類標準品則使用葡萄糖 (Sigma, G5767)、麥芽糖 (Sigma, M5885) 與海藻糖 (Sigma, T5251) 之莫耳濃度混和物，配成不同濃度 之標準溶液 (0.5、2.5、10、25、50、150 mM)，同樣須過濾處理。
液相層析之移動相使用 acetonitrile(Tedia，AS1122-001
HPLC/spectro grade)、二次水與甲酸 (formic acid，99％，Acros organics，
270480010) 體積比 75:25:1 之混合溶劑，以孔徑 0.2 μm 之 PVDF 濾膜 (PALL，FP-200TM) 經抽氣過濾後再以超音波震盪器 (Ultrasonic
Cleaner DC300H, DELTA) 中 10 分鐘除去大部分的氣泡後即可以上機 使用。
2. HPLC 儀器操作
幫浦開始運作前需進行 purge，並詳細檢查管線是否有氣泡殘留，
要在分析樣本前將氣泡移除，避免干擾樣本的分析訊號或試管柱受損。
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確定氣泡移除後，即可以 1 mL/min 的流速沖洗管柱、平衡系統，並 監測訊號基線是否有穩定，待訊號穩定後即可以用專用注射針筒將上 述標準溶液及 hTreH 酵素活性分析之樣品分別注入系統中進行分析，
每針樣品體積皆取20 μL，並使用操作軟體紀錄 HPLC 之分析圖譜。
High-performance liquid chromatography (HPLC) 儀器操作條件:
――――――――――――――――――――――― 葡萄糖濃度，並計算海藻糖水解酶的比活性 (specific activity)，單位 為 U/mg protein；活性單位 (U) 定義為：每分鐘能產生 1 nmol glucose
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所需的酵素量，單位為 nmoles/min。
九、 Human trehalase 之胺基酸序列分析及三級結構和 DBCP 雙硫鍵 的預測
到目前為止已經解出海藻糖水解酶三級結構的物種只有大腸桿菌 裡的周質間海藻糖水解酶(periplasmic trehalase)，所以將人類海藻糖 水解酶之胺基酸序列輸入 SWISS-MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/)
進行三級結構預測，並將預測出來的結構以分析軟體 PyMOL 呈現立 體結構，並將人類海藻糖水解酶的結構與大腸桿菌的周質間海藻糖水 解酶的結構和序列進行比對 (圖二十七、圖二十八)，以及利用 DBCP (disulfide bonding connectivity pattern prediction) 程式 (附錄十一) 來 預測人類海藻糖水解酶分子內可能存在的雙硫鍵位置 (圖二十九)。十、 豬腎臟的海藻糖水解酶與海藻糖類似物的抑制劑實驗
1. 海藻糖結構類似物 Melibiose (Acros，Cat#12537)、 lactulose (Fluka，Cat#61360)、palatinose (SIGMA，Cat #P2007)、tobramycin (sigma，Cat#A8980)、acarbose (SIGMA，Cat #A8980)、lactose (Acros，Cat#36889)、sucrose (SIGMA，Cat #S7903) 和 kanamycin Sulfate (Acroscat，Cat #BP906-5) 被豬腎臟的海藻糖水解酶水解 (Sigma-Aldrich, T8778) 的實驗，其流程如下:
在 50 μL 的反應體積中，分別含有以 135 mM citric acid buffer (pH 5.7) 配成終濃度為 28 mM trehalose 或海藻糖類似物，以及 0.001Unit 的 porcine kidney trehalase 在 37℃下反應 30 分鐘後，並於 95℃反應
在 50 μL 的反應體積中，分別含有以 135 mM citric acid buffer (pH 5.7) 配成終濃度為 28 mM trehalose 或海藻糖類似物，以及 0.001Unit 的 porcine kidney trehalase 在 37℃下反應 30 分鐘後，並於 95℃反應