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人類海藻糖水解酶在大腸桿菌中的功能性表現與新型海藻糖水解酶抑制劑的檢測

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Academic year: 2021

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 人類海藻糖水解酶在大腸桿菌中的功能 性表現與新型海藻糖水解酶抑制劑的檢 測 Functional expression of human trehalase in Escherichia coli and identification of novel trehalase inhibitors. 研 究 生:黃胤榮 Yin-Jung Huang 指導教授:李冠群博士 Dr. Guan-Chiun Lee 中華民國一○一年十二月. I.

(2) 致謝 研究所的生涯即將要劃下休止符,讓我覺得時間過得真快,但這不 是結束只是旅途中的一站,之後要迎向另一個全新的里程,首先我要 先感謝我的指導教授李冠群老師的諄諄教導,不管在論文、實驗上都 給我很多的指導與教誨,讓我受益良多也學到很多知識。在撰寫論文 適時給我幫助與指正,且感謝我的口試委員林炎壽教授和李立群教授 對我的論文提出很多修正的建議與見解,讓我的論文更加完美。 感謝實驗室的學樺學長、亭君學姐、舒琇學妹、汶函學妹、家鴻學 妹、培綺學妹、亞翰學弟、萌皓學弟不管在實驗和生活上都讓我學習 了很多,也替實驗室增添不少趣味和互相幫助。 最後我要感謝我的父母,謝謝你們支持我讀研究所、辛苦的栽培, 也在生活上幫了我一大把,讓我沒有經濟壓力下能全心全力的求學, 內心由衷的感激。. II.

(3) 目錄 圖目錄..................................................................................................... VII 附錄......................................................................................................... XII 摘要........................................................................................................ XIII Abstract ................................................................................................... XV 壹、緒論 (Introduction).............................................................................1 一、海藻糖的簡介 ..............................................................................1 二、海藻糖水解酶的相關研究 ..........................................................3 三、人類海藻糖水解酶 (Human trehalase) 的相關研究 ..................9 四、海藻糖水解酶的抑制劑 ............................................................10 五、蛋白質的結構 ............................................................................16 六、蛋白質的變性 ............................................................................19 貳、研究目的 (Aim) ...............................................................................25 參、研究材料與方法 (Materials and Methods) .....................................26 一、使用菌體 ....................................................................................26 二、Human trehalase 的基因重組載體之建構 ................................26 三、宿主篩檢模式之建立與評估 ....................................................35 四、Human trehalase 重組蛋白質的大量表達與誘導條件 ............36 五、Human trehalase (isoform 2) 野生型與 (C28/34/175/202S) 突變 株的純化 ............................................................................................39 III.

(4) 六、Human trehalase 重組蛋白質的重新摺疊方法 (Protein refolding) ……………………………………………………………………..40 七、蛋白質電泳分析 ........................................................................48 八、Human trehalase 重組蛋白質的活性測定分析 ........................51 九、Human trehalase 之胺基酸序列分析及三級結構和 DBCP 雙硫 鍵的預測 ............................................................................................54 十、豬腎臟的海藻糖水解酶與海藻糖類似物的抑制劑實驗 ........54 肆、研究結果 (Results)...........................................................................56 一、Human trehalase 的基因重組載體之建構 ................................56 1. Human trehalase 基因的重組質體 (isoform 1).........................56 2. Human trehalase 基因的重組質體 (isoform 2).........................56 3. Human trehalase (isoform 2) 基因的定位突變 .........................56 二、重組蛋白質大量表達的誘導表現 ............................................57 pTriEx system..................................................................................57 1. Human trehalase (isoform 1) 野生型於大腸桿菌中的表達 .....57 pET-23a system ...............................................................................57 1. Human trehalase (isoform 1) 野生型於大腸桿菌中的表達 .....57 2. Human trehalase (isoform 2) 野生型與突變株於大腸桿菌中的 表達.....................................................................................................58 三、Human trehalase (isoform 2) 野生型與 (C28/34/175/202S) 突變 株的純化 ............................................................................................60 IV.

(5) 四、Human trehalase 重組蛋白質的重新摺疊方法 (Protein refolding) ……………………………………………………………………..60 1. 利用透析式摺疊 (Dialysis refolding) 來進行蛋白質復性 .....60 2. 利用色層層析摺疊法 (On-column refolding) 來進行蛋白質復 性.........................................................................................................61 五、Human trehalase 蛋白質的 HPLC 活性分析 ............................62 1. 用 8 M Urea 來進行蛋白質復性後的活性分析 ......................62 2. 用 N-Lauroylsarcosine 來進行蛋白質復性後的活性分析 ......62 3. 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 來進行蛋白質復性純化後的活性 分析.....................................................................................................62 4.用 8 M Urea+20 mM 2-ME 來進行蛋白質復性後的活性分析 ……………………………………………………………………63 六、Human trehalase 之胺基酸序列分析及三級結構和 DBCP 雙硫 鍵的預測 ............................................................................................63 七、豬腎臟的海藻糖水解酶與海藻糖類似物的抑制劑實驗 ........63 伍、討論 (discussion) .............................................................................66 一、重組蛋白大量表達的誘導表現 ................................................66 二、Human trehalase (isoform 2) 野生型與 (C28/34/175/202S) 突變 株的純化 ............................................................................................66 三、Human trehalase 重組蛋白質的重新摺疊方法 (protein refolding) V.

(6) ……………………………………………………………………67 四、Human trehalase 之胺基酸序列分析及三級結構和 DBCP 雙硫 鍵的預測 ............................................................................................68 五、豬腎臟的海藻糖水解酶與海藻糖類似物的抑制劑影響 ........69 陸、參考文獻 (References).....................................................................70. VI.

(7) 圖表目錄 圖 一: pET-23a(+)-hTreH (isoform 1) 野生型的重組質體圖 ...............73 圖 二: pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型的重組質體圖 ...............74 圖 三: 定點突變 human trehalase (isoform 2) 基因的結果 .................75 圖 四: 以 SDS-PAGE 分析 pTriEx-hTreH (isoform 1) 野生型於大腸桿 菌中的誘導表達結果 ..................................................................76 圖 五: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 1) 野生型於大 腸桿菌中的誘導表達結果 ..........................................................78 圖 六: 以 SDS-PAGE 分析 pET 23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型於大 腸桿菌中的誘導表達結果 ..........................................................81 圖 七: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175S) 突變 株於大腸桿菌中的表達結果 ......................................................83 圖 八: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175S) 突變株於大腸桿菌中的表達結果 ..............................................84 圖 九: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175/202S) 突變株於大腸桿菌中的表達結果 ..............85 圖 十: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175A) 突變 株於大腸桿菌中的表達結果 ......................................................86 圖 十一: 以 SDS-PAGE 分析 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) VII.

(8) (C175/202A) 突變株於大腸桿菌中的表達結果 .......................87 圖 十二: 以 SDS-PAGE 分析 human trehalase (isoform 2) 野生型和 (C28/34/175/202S) 突變株於大腸桿菌中純化結果 ..................88 圖 十三: 用 8 M Urea 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 dialysis refolding 與純化結果 .....................................................89 圖 十四: 用 8 M Urea 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 dialysis refolding 完的活性分析之 HPLC 圖譜.........................90 圖 十五: 用 N-Lauroylsarcosine 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生 型進行 dialysis refolding 與純化結果 ........................................91 圖 十六: 用 N-laurolsacosine 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型 進行 dialysis refolding 完的活性分析之 HPLC 圖譜 ...............92 圖 十七: 用 6 M GnHCl+1 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 FPLC 式 denaturing affinity-column adsorption 方法 的 on-column refolding 結果 .......................................................94 圖 十八: 用 6 M Urea+1 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 FPLC 式 denaturing affinity-column adsorption 方法 的 on-column refolding 結果 .......................................................96 圖 十九: 用 6 M Urea+1 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行手動式 denaturing affinity-column adsorption 方法的 VIII.

(9) on-column refolding 結果 ............................................................97 圖 二十: 用 6 M Urea+1 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175/202S) 突變株進行手動式 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding 結果 ...98 圖 二十一: 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding 結果 .................................................................99 圖 二十二: 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding 完的活性分析之 HPLC 圖譜 .......................100 圖 二十三: 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding 結果 ..........................................................101 圖 二十四: 用 8 M Urea+1.2 mM CTAB 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column adsorption 方法的 on-column refolding 完的活性分析之 HPLC 圖譜 ..................102 圖 二十五: 用 8 M Urea+20 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding 結果 ...............................................................103 IX.

(10) 圖 二十六: 用 8 M Urea+20 mM 2-ME 對 pET-23a(+)-hTreH (isoform 2) 野生型進行 denaturing affinity-column purification 方法的 dialysis refolding 完的活性分析之 HPLC 圖譜 .......................104 圖 二十七: Human trehalase 跟大腸桿菌周質體海藻糖水解酶之一致 性序列比對 ................................................................................105 圖 二十八: 利用 SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) 進行 human trehalase 之三級結構預測 .............................................106 圖 二十九: Human trehalase 的雙硫鍵預測之三級結構 ....................107 圖 三十: Lactulose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ...........109 圖 三十一: Melibiose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ....... 111 圖 三十二: Palatinose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響....... 113 圖 三十三: Azacitidine 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ..... 114 圖 三十四: Tobramycin 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 .... 117 圖 三十五: Acarbose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ........ 119 圖 三十六: Kanamycin Sulfate 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影 響 ................................................................................................121 圖 三十七: Lactose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響...........123 圖 三十八: Sucrose 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ..........125 圖 三十九: Thiodiglucoside 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 X.

(11) ....................................................................................................126 圖 四十: Validamycine A 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 .128 圖 四十一: Validoxylamine A 對豬腎臟的海藻糖水解酶活性抑制影響 ....................................................................................................130. 表一: 有抑制效果的海藻醣類似物總整理圖………………………132. XI.

(12) 附錄 附錄 一: 海藻糖的分子結構圖 ...........................................................133 附錄 二: 刷狀緣膜上糖苷水解酶的生合成 .......................................134 附錄 三: 海藻糖水解酶水解海藻糖而形成等莫耳數 α-和 β-形式葡萄 糖產物的反應 .........................................................................135 附錄 四: 海藻糖和海藻糖的結構類似物的化學式結構 ...................136 附錄 五: 海藻糖水解酶水解海藻糖以及海藻糖減緩 TBP 蛋白多麩醯 胺聚集的機制 .........................................................................137 附錄 六: 篩選出之海藻糖相似物及方法流程圖 ...............................138 附錄 七: 小腸內酵素所水解的雙糖 (麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖) 與合成的 Lactulose、Melibiose 之結構式比較 ...................139 附錄 八: 蛋白質四個層次的結構 .......................................................140 附錄 九: 在電子顯微鏡下所觀察到大腸桿菌細胞中的內聚體 .......141 附錄 十: AKTAprime™ Automated Liquid Chromatography System (GE Healthcare) 所提供參考之純化流程圖 .........................142 附錄 十一: 預測蛋白質雙硫鍵之鍵結型態的機制流程圖 ...............143. XII.

(13) 摘要 海藻糖水解酶、蔗糖酶-異麥芽糖 (sucrase-isomaltase, SI)、麥芽糖 酶-葡萄糖澱粉酶 (maltase-glucoamylase, MG) 是哺乳類小腸絨毛膜主 要的 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidases),這些酵素負責把雙醣水解成單醣, 以利吸收作為能量的來源。海藻糖存在於很多食物當中,而小腸海藻 糖 水 解 酶 (EC 3.2.1.28) 會 水 解 海 藻 糖 (1-α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside) 成為兩個葡萄糖分子。海藻糖對細胞有兩種保 護的特性,亦即可當作化學伴護劑 (Chemical chaperone) 及細胞自噬 反應引發劑 (inducer of autophagy),實驗證實在神經細胞當中是可以 運用在因蛋白質沉澱所造成的退化性神經疾病的藥物治療上。因此, 如果能透過抑制腸道內的海藻糖水解酶活性,進而增加腸道內海藻糖 吸收的話,這樣在血液和大腦中的海藻糖濃度也會增加,有可能改善 由蛋白質沉澱所造成的退化性神經疾病。而人類海藻糖水解酶的結構、 催化機制與其抑制劑到目前為止還沒有被研究清楚,本研究將人類海 藻糖水解酶的 cDNA 在大腸桿菌裡表達,然而表達出來的重組蛋白質 為內聚體 (inclusion body),利用透析式摺疊 (Dialysis refolding) 和管 柱色層層析摺疊法 (On-column refolding) 進行蛋白質再摺疊復性,但 是再摺疊出來的重組蛋白質活性非常低。為了避免因蛋白分子間及分 子內不正常的雙硫鍵形成而造成蛋白質錯誤的摺疊,以增加它的可溶 性,根據三級結構的模擬把人類海藻糖水解酶中可能不涉及形成雙硫 鍵的半胱胺酸 (cysteine) 殘基,利用定位突變法以絲氨酸 (serine) 來 取代,其中預測出 4 個彼此距離較遠、較不可能形成雙硫鍵的半胱胺 酸,並將它們突變為絲氨酸。然而突變的重組蛋白質仍為內聚體,而 且再摺疊出來的重組蛋白質仍然沒有活性。另外,生化分析數種海藻 XIII.

(14) 糖的結構類似物對於豬的海藻糖水解酶的抑制作用,確定可以作為哺 乳類海藻糖水解酶的抑制劑,這些類似物有可能作為治療由蛋白質沉 澱所造成的神經性退化性疾病的藥物。 關鍵字: 海藻糖、海藻糖水解酶、海藻醣水解酶抑制劑、重組蛋白質 表達. XIV.

(15) Abstract In mammals, trehalase, sucrase-isomaltase and maltase-glucoamylase are the major α-glycosidases of the intestinal brush border membranes. These enzymes are responsible for the degradation of di- and oligosaccharides into monosaccharides, and are crucial for the energy-intake. Trehalase (EC. 3.2.1.28) hydrolyses. α,α-trehalose. (1-α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside) to two glucose molecules. The intestinal trehalase is involved in the hydrolysis of ingested trehalose which is found mainly in many nutrient foods. The dual protective properties of trehalose (as a chemical chaperone and an inducer of autophagy). have encouraged. pharmaceutical. application. of the. disaccharide in neurodegenerative diseases caused by protein aggregation process. Therefore, it is theoretically possible to increase intestinal absorption of trehalose through inhibiting intestinal trehalase activity, and thus increase in trehalose content in blood or brain. This may in turn alleviate neurological protein deposition diseases. The protein structure, catalytic mechanism and specific inhibitors of human intestinal trehalase (hTreH) have not been elucidated. In the present study, a cDNA fragment encoding the mature form of hTreH was cloned and recombinant hTreH was expressed in Escherichia coli. However,the recombinant hTreH was expressed as an inclusion body. Protein refolding through dialysis and on-column refolding process were performed. The refolded enzyme showed very low specific activity. To prevent protein misfolding through the formation of incorrect intra- or inter-molecular disulfide bonds and thus increase its solubility, based on tertiary structure modeling, several predicted non-disulfide-bonding cysteine residues in hTreH were replaced with serine by site-directed mutagenesis. Four cysteine residues in hTreH were changed into serine, which are predicted to be distant from each XV.

(16) other and may not form disulfide bonds with each other. However, the mutant proteins were also expressed as inclusion bodies, and the refolded enzymes still showed no activity. Several trehalose analogs were biochemically characterized as mammalian trehalase inhibitors, and they can be as potential therapeutics for the protein deposition-mediated diseases. Keyword: trehalose, trehalase, trehalase inhibitor, recombinant protein expression. XVI.

(17) 壹、 緒論 (Introduction) 一、. 海藻糖的簡介. 海藻糖 (Trehalose,α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside, C12H22O11,MW = 342.31) 為 α-D-吡喃葡萄糖基 α-D-吡喃葡萄糖苷, 是兩個葡萄糖以 α,α-1,1-鍵結所形成的結構 (附錄一),屬於非還原性 雙糖,廣泛地存在於自然界中,包括細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、無 脊椎動物和植物。雖然在自然界是以 α,α-形式存在,但是也有少部分 是以 α, β-或是以 β,β-形式存在,且其物理特性也跟 α,α-形式有所不同 (Richards, et al., 2002)。當生物體受到高熱、寒冷、乾旱、脫水、氧化 或是高滲透壓等極端環境下,海藻糖可以保護蛋白質不致變性和維持 細胞膜的完整性,雖然哺乳類不會合成海藻糖,但是在很多食品當中 含有海藻糖,其提供哺乳類攝食海藻糖的來源,而在一些研究指出海 藻糖在人類攝食一餐中安全劑量可達攝食量的 10 % (Rodriguez-Navarro, et al., 2010)。 海藻糖的物化特性 海藻糖本身有一個奇特的特性,在第一次加熱到 97℃時就會熔化, 但是再繼續加熱到 130℃時會失去結晶水形成無水形式的結晶體,最 後在 210℃熔化。而海藻糖在水溶液當中的性質是很穩定,很難被酸 和 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 水解,且在相對濕度 92 %下,其含 水結晶體還有 9.5 % (Richards, et al., 2002),代表海藻糖是化性非常穩 定的糖類。 海藻糖的生理特性 累積於生物體內的海藻糖會保護蛋白質中的胺基酸殘基,避免受 到自由基的破壞,但生物體內所含之蔗糖則無法提供保護 (Benaroudj, et al., 2001)。當生物體在遭遇環境壓力,如冷凍、加熱、乾燥或高滲 1.

(18) 透壓時,海藻糖能有效地保護蛋白質和細胞膜的功能;於無水環境中, 海藻糖能直接與生物細胞膜接觸維持其流動性,防止因乾燥而造成的 膜融合與通透性改變 (Richards, et al., 2002)。 海藻糖特殊之生理特性被應用於生物科技上,例如:適量地添加海 藻糖可合成較長片段之cDNA,有助於基因體的研究 (Spiess and Ivell, 2002)。眼藥水中添加海藻糖,進而達到乾眼症病人的治療 (Matsuo, et al., 2002)。添加適量的海藻糖可提升動物細胞存活率,有助於動物細 胞的保存,也應用在細胞的電穿孔技術中,藉以提升細胞存活率 (Cao, et al., 2011)。 海藻糖的應用與未來發展 由於海藻糖的特殊性質及作用機制,已經通過美國食品及藥物檢驗 局認證為 GRAS (generally regarded as safe) 之安全健康食品,因此目 前已經廣泛地應用在食品加工、生化製品、醫藥和化妝品等產業中, 如以下幾點: 1. 在酵素、蛋白質、藥物製備與器官移植方面當做為安定劑, 2. 在疫苗與哺乳類動物細胞中做為抗凍劑, 3. 在化妝品上可作為保養品的保濕劑成分, 4. 在食品加工上因為海藻糖甜度適中、水溶性高、低致齲性、低 吸濕性及加工儲存過程中穩定等特性,因此可應用在乾燥食品、 冷凍食品、糕餅業、錠劑、蜜餞、糖果、飲料、調味料、發酵 食品等。 還有海藻糖可以當作化學伴隨蛋白 (Chemical chaperone)、細胞自噬 反應引發劑 (inducer of autophagy) 以及可以直接跟蛋白質做反應來 加強蛋白質的摺疊,而海藻糖已被證實能有效抑制多種蛋白質的沉積, 並且能藉由促進細胞自噬作用,提升細胞清除不正常蛋白質的能力。 2.

(19) 在某些澱粉樣蛋白 (amyloid) 相關的疾病老鼠模式中,可以藉由減緩 TATA binding protein (TBP) 蛋白多麩醯胺聚集,達到抑制脊髓小腦運 動失調症第十七型的功用,所以海藻糖具有延緩其症狀的效果。海藻 糖在一些神經退化性疾病的實驗研究當中是可以改善其疾病的症狀, 如下幾點: 1. 在體外實驗發現海藻糖是可以抑制類澱粉蛋白 (amyloid) 的形 成。 2. 海藻糖可以改善造成阿茲海默症的β-類澱粉蛋 (β-amyloid) 的 沉澱。 3. 海藻糖可以減緩造成亨丁頓舞蹈症的R6/2老鼠模式中的多麩醯 胺 (polyglutamine, polyQ) 病因。 4. 在細胞模式當中,海藻糖可以促進細胞自噬反應引發,來減緩 普恩蛋白 (prion) 的症狀。 5. 海藻糖可以藉由促進細胞自噬反應引發,來改善造成帕金森氏 症狀的多巴胺和tau蛋白質病因的老鼠模式。 6. 在人類神經母細胞的實驗當中,海藻糖可以促進細胞自噬反應 引發,來抑制由蛋白酶體誘導出神經性毒蛋白質的沉澱 (Casarejos, et al., 2011) (Rodriguez-Navarro, et al., 2010)。 二、 海藻糖水解酶的相關研究 海藻糖水解酶的簡介 海藻糖水解酶 (α,α-trehalase, α,α-trehalose glucohydrolase, E.C 3.1.2.28) 是屬於糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase) 的一種,廣泛地存 在於細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、某些魚類的血漿和哺乳類當 中,而在這些物種中的海藻糖水解酶根據他們的最適活性 pH 值又可 以分成兩大類,分別是酸性海藻糖水解酶 (acid trehalase) 和中性海藻 3.

(20) 糖水解酶 (neutral trehalase),而這兩大類的海藻糖水解酶的主要差異 是在他們的結構上、熱穩定性、調節的組成以及生理上的特性有所不 同,酸性海藻糖水解酶是屬於細胞外 (液泡外) 酵素,主要是吸收外 在的海藻糖來當作碳源,至於中性海藻糖水解酶則是細胞質酵素 (cytosolic enzyme),負責水解內生性的海藻糖,大部分在真菌中的海 藻糖水解酶都有這兩種形式的酵素存在 (de Almeida, et al., 2009)。 糖苷水解酶又分為兩大類,第一類為糖苷水解酶家族 37 [glycoside hydrolase family 37 (GH37) ],而大部分的海藻糖水解酶都是屬於這類 酵素;第二類酵素是由一些酸性海藻糖水解酶跟麥芽糖、海藻糖、曲 二糖、海藻糖-6-磷酸、黑曲霉糖磷酸化酶所組成的糖苷水解酶家族 65 [glycoside hydrolase family 65 (GH65) ] (Silva, et al., 2010) (Carbohydrate Active Enzyme database, http://www.cazy.org)。 海藻糖水解酶功能、演化與表達 在哺乳類中,海藻糖水解酶跟蔗糖酶異麥芽糖 (sucrase-isomaltase, SI)、麥芽糖酶葡萄糖澱粉酶 (maltase-glucoamylase, MG) 是屬於腸道 刷狀緣膜的 α-葡萄糖苷酶的一種,而這些酵素是可以把雙醣跟多醣水 解成能量代謝來源的單醣,但是海藻糖水解酶跟其它兩種酵素有兩個 不一樣的地方,首先是海藻糖水解酶只有對海藻糖有很高的受質專一 性 (Van Beers, et al., 1995),第二點是蔗糖酶異麥芽糖和麥芽糖酶葡 萄糖澱粉酶是從同一個祖先基因所演化而來的,但是哺乳類海藻糖水 解酶的演化起源卻不是跟蔗糖酶異麥芽糖和麥芽糖酶葡萄糖澱粉酶 相同,而是跟較低等生物,例如原核生物等等有密切關係 (Oesterreicher, et al., 2001)。 在靈長類動物 (例如人類和狒狒) 當中海藻糖水解酶是會存在一生 且都會消化海藻糖;而在其他哺乳類中例如:老鼠、兔子、馬、袋鼠 4.

(21) 的海藻糖水解酶是在初生的時後發現,但是在成年期才會有強烈活性 增加 (up-regulation),代表有可能在成年的時候才會接觸到海藻糖; 至於其它必要性的肉食動物 (obligate carnivores) 如海豹和貓是缺乏 海藻糖水解酶的存在,所以酵素的存在顯示海藻糖的攝取或是至少海 藻糖被攝取的可能性,因此在這些物種所表達的海藻糖水解酶是有 3 種模式: 1. 終其一生都是缺乏海藻糖水解酶. 2. 在斷奶後其海藻糖水解酶的活性增加. 3. 在初生之前海藻糖水解酶的活性增加. 所以海藻糖水解酶的基因調控是有差異的。 海藻糖水解酶主要存在於小腸和腎臟當中 在哺乳類當中海藻糖水解酶的組織分布主要地在小腸的腸細胞和 腎臟中的近端小管上皮細胞裡,而在小腸上皮細胞的所有刷狀緣膜蛋 白質中,海藻糖水解酶佔不到 0.1%的比例。Ruf 和他的同事 (1990) 證 明兔子的海藻糖水解酶 mRNA 在肝臟裡表達,但是也有觀察到一些 未證實的事情。在這個組織特定的表達模式也觀察到其他的刷狀緣膜 酵素,例如: 胺基胜肽酶N (aminopeptidase N)、 氨基胜肽酶A (aminopeptidase A)、 雙胜肽水解酶IV (dipeptidylpeptidase IV)、 麩氨酸轉移酶 (γ-glutamyltransferase)、 麥芽糖酶葡萄糖澱粉酶 (maltase-glucoamylase, MG)。 而在大象的實驗當中,Riby和同事 (1990) 證實腎臟裡的海藻糖 水解酶會水解海藻糖,其實驗是把海藻糖注射到兔子和老鼠的血管中, 看看海藻糖有多少的量會分泌到尿液中,而在兔子和老鼠的血漿中海 5.

(22) 藻糖的清除速率是相差不多的;如果腎臟的海藻糖水解酶沒有被表達 的話,注射海藻糖到體內10分鐘後會累積在腎臟當中,相反地由於海 藻糖水解酶在腎臟裡高度地表達,其在尿液中的海藻糖濃度變低,顯 示腎臟的海藻糖水解酶在絲球體過濾 (glomerular filtration) 中能非常 有效地水解海藻糖。 海藻糖水解酶之結構與生合成 (Biosynthesis) 然而海藻糖水解酶的生合成沒有很明確地被描述,但是可以從很多 生化數據方面來推論 (Van Beers, et al., 1995) (附錄二),首先海藻糖水 解酶的 N 端序列是一段可切斷且易位到粗糙內質網內的訊息序列, 而粗糙內質網中的海藻糖水解酶的 C 端含有一段疏水性序列,其功 能是鑲嵌在刷狀緣膜上,但是當多肽轉譯完成後,C 端含有一段疏水 性序列就被醣基化磷脂醯肌醇 (glycosylphosphatidylinositol;GPI) 所 取代,其醣基化磷脂醯肌醇只會被磷脂醯膽鹼特異的磷脂酶 C 所水 解掉。相反地其它雙醣酶是由跨膜 (transmembrance) 序列鑲嵌在細胞 膜上,是會被木瓜蛋白酵素給水解掉。而醣基化磷脂醯肌醇的功能是 具有高度專一性地在頂端傳輸訊號,在一些酵母菌、昆蟲的海藻糖水 解酶是沒有醣基化磷脂醯肌醇的存在,如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 是屬於細胞蛋白、而在昆蟲中如黃粉甲蟲 (T. molitor) 中的 海藻糖水解酶是屬於可溶性小腸酵素、還有在家蠶蛾 (Bombyx mori) 的海藻糖水解酶是位在於很多上皮細胞的基底膜上,但是在序列上也 並沒有發現到有可以跨膜 的序列,所以家蠶蛾的海藻糖水解酶是如 何鑲嵌在細胞膜上的機制到目前為止是不清楚的,但是在哺乳類中的 海藻糖水解酶是屬於胞外酵素,是由醣基化磷脂醯肌醇連接到細胞膜 上。 在一些研究指出把豬、兔子的腎臟和小腸裡的海藻糖水解酶來用刀 6.

(23) 豆凝集素A-瓊脂糖凝膠層析法來分析顯示只有N-Glycosyl 鍵結方式 所形成的高甘露糖型 (high mannose type) 和複合型 (complex type)醣 蛋白,而沒有發現以O-Glycosyl鍵結方式所形成的醣蛋白,但是在蔗 糖酶異麥芽糖 (sucrase-isomaltase)、麥芽糖酶葡萄糖澱粉酶 (maltase-glucoamylase) 和乳糖酶 (lactase) 中都有N-Glycosyl 鍵結及 O-Glycosyl鍵結所形成的醣蛋白。所以海藻糖水解酶跟其他的刷狀膜 糖苷水解酶有幾個地方是不一樣的: 1. 海藻糖水解酶跟其他酵素的結構並沒有相似之處。 2. 海藻糖的分子量相對其它酵素而言是比較小的。 3. 海藻糖水解酶是具有醣基化磷脂醯肌醇序列而不具有跨膜 序列。 4. 海藻糖水解酶具有獨特的催化機制。 綜合上述所列的各別特點讓海藻糖水解酶在刷狀緣膜上具有特別 的酵素功能。 海藻糖水解酶的受質專一性和水解機制 海藻糖水解酶的天然受質到目前為止只有發現海藻糖是可以被水 解。海藻糖 (α,α-trehalose,α-D-glucopyranosyl-1,1-α-Dglucopyranoside, C12H22O11, MW = 342.31) 是屬於非還原性雙糖的一種,其分子結構是 兩個葡萄糖經由的 α,α-1,1-醣苷鍵結所形成的。 就目前已知的部分來說,顯示在哺乳類及昆蟲中之海藻糖水解酶的 催化位是只有一個活性位 (active site),而只能專一性水解非還原性的 α,α-1,1-醣苷鍵結所形成的海藻糖。除了海藻糖以外,還有一些合成 的受質也會被人類、熒光假單胞菌 (pseudomonas fluorescens)、歐洲鰓 金龜 (cockchafer melolontha ) 和豬的海藻糖水解酶給水解,這些合成 受質包含有: 7.

(24) 1. 海藻糖的兩個差向立體異構體: α-D-allopyranosyl-α-D-glucopyranoside α-D-galactopyranosyl-α- D-glucopyranoside, 2. 海藻糖分子其中一個葡萄糖的第 6 個碳團 (carbon-group) 被去除: α-D-glucopyranosyl-α-D-xylopyranoside 3. 兩個去氧化合物 (deoxy-compound): 6’-deoxy-α, α-trehalose 和 6,6’-dideoxy-α-α-trehalose . 上述所列的合成受質被海藻糖水解酶水解的效率比水解海藻糖的 效率還要低: 海藻糖的 Km 值=5.88 mM,其它的合成受質的 Km 值介 於 5.88~57 mM,而至於 VMax 只有海藻糖 VMax 的 2~23%。由此可 見海藻糖水解酶的 hydroxyl-group (例如在第 3, 4, 6, 6’碳上的氫氧團) 跟 6’的 HCOH-group 是酵素在反應中扮演一個重要的角色。 在海藻糖水解酶的水解機制中,最值得注意特點是有研究顯示出在 參與水解海藻糖反應中的 α,α-1,1-醣苷鍵結經由重氧水 (H218O) 的氧原子 18O 的實驗來標記發現是被鍵結到 β-D-葡萄糖上 (Mori, et al., 2009),所以海藻糖在被水解後而釋放出等莫耳數的 α-D-葡萄糖 (α-D-glucose) 和 β-D-葡萄糖 (β-D-glucose) (附錄三) (Mori, et al., 2009), 這樣的情形在昆蟲裡也是一樣,但是在對刷狀緣膜上的其他 α-或 β糖苷水解酶而言,只會都水解出是 α-D-葡萄糖不然就是 β-D-葡萄糖, 不會兩種 α-和 β- D-葡萄糖同時存在。 海藻糖水解酶可以當作疾病的標記 海藻糖水解酶也在兔子和人類的羊水裡被發現,其用洗滌劑溶解剛 出生的兔子裡海藻糖水解酶跟小腸的海藻糖水解酶後的可溶性狀態 形式下來研究,發現在動力學、分子量研究是相似的。海藻糖水解酶 在羊水裡的發現和含量是跟初生在腎臟和小腸裡的海藻糖水解酶的 發育有很緊密地關係,而懷孕時候的海藻糖水解酶在腎臟裡表達比在 8.

(25) 小腸發表達的時間還要早。 在羊水裡的海藻糖水解酶起源是由腸道和腎臟經尿道流到羊水裡, 然而在羊水裡的海藻糖水解酶活性下降時可能顯示嬰兒在腸道或是 尿道裡的阻塞,或者是其他病理因素影響到腎或是小腸。海藻糖水解 酶很適合當作造成腸胃、泌尿生殖器或是氣管與支氣管的管腔阻塞而 分泌出黏性形成囊狀纖維化疾病的標記。正常人類懷孕 16 到 18 週時 的羊水含有 1 U/mg 濃度的蛋白量,然而當海藻糖水解酶濃度降到 0.1 U/mg 濃度時,代表由於囊狀纖維化的影響才造成如此現象,所以海 藻糖水解酶在人類羊水裡的活性低的時候,代表有很高可能性的先天 性腎臟疾病症狀。 先天性海藻糖水解酶的缺乏症 先天性的海藻糖缺乏症是因為常染色體隱性遺傳病 (autosomal recessive disorder) 所造成的,而在美國人和丹麥人中是很罕見地發生, 反之在格陵蘭的因紐特人中佔 10%的比率。其他研究正常且健康的瑞 士成年人的其中兩個案例,在小腸切片裡發現沒有海藻糖水解酶的存 在,而這兩個案例顯示在其他的刷狀緣膜的糖苷水解酶的表達是正常 的,可能是天生缺乏海藻糖水解酶的表達。天生性海藻糖水解酶的缺 乏症狀原因到目前為止還是不清楚,有可能是基因表達弱或是表達出 沒有活性的酵素等等 (Van Beers, et al., 1995)。 三、 人類海藻糖水解酶 (Human trehalase) 的相關研究 在 1997 年的研究 (Ishihara, et al., 1997) 當中是第一次從人類腎臟 互補型去氧核糖核酸基因庫 (cDNA library) 中選殖出人類腎臟海藻 糖水解酶 (Human kidney trehalase),其氨基酸序列第 19 或 20 的位置 之前是一個含有轉移 (translocation) 到內質網膜上的訊息序列 (Signal Sequence),而扣除訊息序列的氨基酸數目後,大約由 563-564 9.

(26) 個胺基酸組合而成,且有 5 個可能的醣基化位置 (N–X–S/T);在一些 海藻糖水解酶抑制劑動力學研究指出 (Asano, et al., 1996),海藻糖水 解酶可能有兩個基質結合區 (subsite),一個是催化位 (catalysis subsite)、另一個是辨識位 (recognition subsite),但是到目前為止海藻 糖水解酶的催化機制還是不清楚。 而兔子 (rabbit)、麵包蟲 (Tenebrio molitor)、家蠶 (silkworm)、大腸 桿菌 (Escherichia coli)、酵母菌 (yeast) 的海藻糖水解酶已經分離出來 了,且 human kidney trehalase 的序列跟上述物種的序列相似性分別為 81%、43%、43%、33%,但是到目前為止,只有大腸桿菌周質體人 類海藻糖水解酶的三級結構被解出來 (Gibson, et al., 2007)。 四、 海藻糖水解酶的抑制劑 有好幾種海藻糖水解酶的抑制劑已經可以從自然界中提煉出來,且 被證實是有效的,如 Deoxynojirimycin、Validamycins、Validoxylamines、 Trehazolin、Salbostatin、Calystegin B4,這些的化學結構式跟海藻糖 是很相像的 (附錄四),以 trehazolin 是最有效且專一性高的抑制劑, 而它的化學性質和生化特性已經被研究很徹底。而對 trehazolin 而言 抑制海藻糖水解酶是屬於可逆的競爭性抑制劑,但是到目前還沒有 trehazolin 跟海藻糖水解酶結合的三級結構複合體資料 (Chiara, et al., 2005)。 海藻糖結構類似物的前導藥物開發、篩選以達到抑制 SCA17 小腦萎縮症 (Spinocerebellar Atrophy),又稱脊髓小腦失調症 (Spinocerebellar Ataxia, SCA),是一類遺傳病,涉及不同基因,目前 沒有良好的治療方法。脊髓小腦運動失調症第十七型 (SCA17) 是由 於染色體 6q27 位置的 TATA-binding protein (TBP) 基因上 CAG/CAA 三核苷重複擴增所引起的神經退化性疾病。TBP 蛋白多麩醯胺 10.

(27) (polyQ) 擴增會導致 SCA17,但為何如此的突變會造成小腦及相關神 經細胞之死亡目前仍未知。 人類無法自行合成海藻糖,而攝食中的海藻糖會被腸道水解酶–海 藻糖水解酶水解成兩分子葡萄糖,進而被小腸絨毛吸收,所以抑制效 果不佳。此外,海藻糖屬於親水性化合物,穿透血腦障壁 (BBB) 的 效率可能極低,為了達成抑制脊髓小腦運動失調症第十七型,所以希 望設計新穎海藻糖類似物,提升其BBB的穿透效率,同時不會被水解 的海藻糖類似物或許可以透過抑制腸道海藻糖酶的活性,增加海藻糖 的吸收,以便提升血液及腦部的海藻糖含量,和達成抑制此疾病之功 效和治療許多因不正常蛋白質沉積所引起的神經退化性疾病。 所以我們跟交通大學生物資訊及系統生物研究所的楊進木教授實 驗室合作,其實驗室是以下 3 點篩選方法來篩選海藻糖結構類似物 (附錄五、六) : 1. 拓譜分析 (Compound topology analysis) 尋找與海藻糖拓譜相似 之化合物。 2. 官能基分析 (Function group analysis) 尋找與海藻糖具有相似官 能基之化合物。 3. 用電腦篩選系統 (iGEMDOCK) 來尋找與海藻糖具有相似氫鍵 網路 (hydrogen-bonding network) 之化合物。並以 iGEMDOCK 測量化合物與蛋白質內的殘基 (residue) 交互作用之能量。 經由這些篩選方法得到海藻糖結構相似物主要分為N、S、C、O、 Three-rings 和SO4暨PO4六大類,而在本系所李桂楨老師實驗室有把 O-type的海藻糖結構類似物於細胞實驗中來看,發現Lactulose (乳酮糖) 和Melibiose (蜜二糖) 海藻糖結構類似物是對改善SCA17症狀是有效 的,而且這兩種糖跟腸內道裡的酵素,例如乳糖酶 (Lactase) 和蔗糖 11.

(28) 酶 (Sucrase) 所水解的受質乳糖 (Lactose) 和蔗糖 (Sucrose) 的結構式 是很相像的 (附錄七),而也把其他O-type的海藻糖結構類似物如乳糖 (lactose)、巴拉金糖 (palatinose)、托普黴素(tobramycin)、阿紮胞苷 (azacitidine)、蔗糖 (sucrose)、阿卡波糖(acarbose)、硫酸康寧黴素 (kanamycin sulfate) 來做海藻糖水解酶的抑制劑實驗。 而以下簡短介紹各種海藻糖的結構類似物: 1. Lactulose (4-0-β-D-galactopyranosyl-D-fructofuranose) (乳酮糖)是一種合成的雙醣,由果糖和半乳糖單體藉由β-1,4醣苷鍵而形成的, 其乳酮糖的甜度比乳糖還要甜1.5倍,且可以利用酒精溶液來結晶出 來。乳酮糖的β-1,4醣苷鍵不會被哺乳類的消化酵素給水解 (Panesar and Kumari, 2011) 以及通過小腸、胃也都不會被降解。 可以被存在於人類腸道中的比菲德氏菌 (Bifidobacterium) 和乳酸 菌 (lactobacillus) 來當作能量代謝來源之一,且乳酮糖是一種助益生 菌的物質,其可以促進腸道中的益生菌,並抑制腸道沙門氏菌的生長, 也不會使口腔中的細菌滋生。在結腸中大部分的益生菌可以代謝乳酮 糖而產生出乳酸、醋酸和蟻酸,這些酸會被引導到腸中促使糞便軟化, 因此乳酮糖又可以被用來當作通便劑。 乳酮糖也可運用在食品加工業和醫藥工業當中,在食品加工業中, 乳酮糖可以來調節腸道的功能、增加食品的風味和改變食品的物化特 性,且在攝取的食物中含有這種糖時對人體有益處,此外,也可以當 作糖尿病患者的甜味劑,可以取代糕點、飲料、嬰兒奶粉食品、麵包 等等的代糖;在醫藥工業中,乳酮糖是可以用來治療便秘、肝性腦病 變 (hepatic encephalopathy)、肝臟併發症、沙門氏菌、當做腫瘤預防、 抗內毒素藥劑以及維持血糖、胰島素的正常等等 (Panesar and Kumari, 2011)。 12.

(29) 2. Melibiose (6-O-α-D-galactopyranosyl-D-glucose) (蜜二糖)是一種天然的雙醣,是由葡萄糖和半乳糖單體藉由α-1,6醣苷鍵而形 成的,存在於自然界中的植物,例如可可豆和大豆當中。而且蜜二糖 的功能在一些研究指出可以增加乳酸,例如比菲德氏菌,並改善人類 糞便的排泄,而且在臨床實驗當中蜜二糖可以改善異位性皮膚炎,所 以上述的研究顯示蜜二糖對免疫系統和過敏性疾病症狀有一定的改 善效果 (Tomita, et al., 2007)。 3. Isomaltulose (6-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuranose) (異麥芽酮 糖醇)是一種還原性的雙醣,是由葡萄糖和果糖單體藉由α-1,6鍵結而成的, 存在於自然界中的蜂蜜、甘蔗汁,以及其他附產物例如糖漿 (treacles) 或是食品級的黑糖蜜 (Molasses),而在商品的異麥芽酮糖醇名稱則被 稱為巴拉金糖 (Palatinose),是由食品級的蔗糖把 (1,2)-fructoside的醣 苷鍵經由酵素性的重新結晶成 (1,6)-fructoside。 而異麥芽酮糖醇的味道和外觀都跟蔗糖很相像,在水中的黏稠性也 跟蔗糖很相似,且在酸性溶液中比蔗糖還要穩定,但是他的甜味只有 蔗糖的一半以及熔點比蔗糖 (160-185℃) 還要低 (123-124℃),所以整 體來看異麥芽酮糖醇是可以取代蔗糖來運用在甜食方面。 相對於蔗糖,異麥芽酮糖醇在一些研究指出很難被環境中或是口腔 中的微生物或細菌所發酵,此外異麥芽酮糖醇也被發現可以抑制不可 溶的聚葡萄糖;在很多研究中顯示異麥芽酮糖醇減少細菌致齲性比蔗 糖效果還要來的好,因此異麥芽酮糖醇是可以取代蔗糖而沒有致齲性 的問題。 再者,異麥芽酮糖醇在小腸中的水解速率比蔗糖還要來的慢,所以 可以使血糖和胰島素反應變小,適合糖尿病患者使用 (Lina, et al., 13.

(30) 2002)。 4.. Azacitidine (阿紮胞苷)是一種核苷類似物,也第一個美國FDA核准認可用來治療骨髓發育. 不良症候群 (Myelodysplastic Syndrome, MDS) 的去甲基化的化療藥 物,此藥物透過干預細胞的複製和生長來防止癌的增大或擴散來延緩 病症並增加病患的存活率 (Vigil, et al., 2010)。 5. Tobramycin (托普黴素)托普黴素屬於一種氨基醣苷類 (aminoglycosides) 水溶性抗生素藥 物,是由黑暗鏈黴菌 (Streptomyces tenebrarius) 所分離出來的,對於 革蘭氏陽性G(+),尤其革蘭氏陰性G(-)細菌具有廣效性的殺菌效果。 其藥理機轉是進入體內後主要是以原劑型,經腎臟排出體外。托普黴 素可接合到細菌的30S核糖體,阻斷核糖體的作用,導致蛋白質無法 合成,而造成細菌死亡。由於托普黴素不能通透腸胃道 (氨基醣苷類 藥物皆有此特性),因此口服吸收極差,只能夠靜脈注射、肌肉注射、 或是局部塗抹給藥,但是有副作用例如造成耳朵毒性、腎臟毒性或是 偶爾可能發生噁心、嘔吐、倦怠、無力感等 (Guo, et al., 2006)。 6. Acarbose (阿卡波糖)是一種由為大麥穀類藉由Actinoplanes utahensis 細菌發酵萃取而 製成的偽四多醣 (Pseudotetrasaccharide) 的醣類分解抑制劑,是應用 於第二型糖尿病患者的藥物,在2006年一篇臺灣口服降血糖藥物開發 趨勢報告中指出acarbose的處方頻率由1997年的0.02%上升至2003年 的4.1%,因干擾碳水化合物的消化,使醣類吸收速率減慢而能有效降 低餐後血糖值,使糖尿病患者的餐後高血糖及餐後高胰島素血症得以 緩解,其作用機制是主要是抑制腸道內負責雙醣、寡醣及多醣的醣類 水解酵素例如α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase)、α-澱粉液化酶 14.

(31) (α-amylase) 、澱粉葡萄糖化酵素 (glucoamylase)、葡聚醣蔗糖酶 (dextransucrase)、環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶 (cyclomaltodextrin glucanosyltransferase) (Lee, et al., 2001),因此不會發生乳糖耐受不良 症。主要作用於小腸刷狀緣,使小腸前半段醣類吸收減少,然代償作 用使小腸後半段的酵素活性增強,增加醣類的吸收,所以碳水化合物 的總吸收量並未改變 (Willms and Ruge, 1999),但是也有副作用例如 在胃腸方面,如腹痛、腹瀉及脹氣等等。 7. Kanamycin Sulfate (硫酸卡納黴素)卡那黴素又可以分別卡那黴素A、B和C這三種抗生素所組成的,是 氨基糖苷類的廣效性抗生素,由卡那黴素鏈黴菌 (Streptomyces kanamyceticus) 發酵萃取出來的,而硫酸卡那黴素 [4-O-(6-amino-6deoxy-α-D-glucopyranosyl)-6-O-(3-amino-3-deoxy-αD-glucopyranosyl)-2-deoxystreptamine ] 是這三種抗生素中最常被應 用和來研究的抗生素,也是屬於一種氨基醣苷類 (aminoglycosides) 的藥物,其作用機制是跟鏈黴素 (Streptomycin) 一樣,對革蘭氏陰性、 陽性菌及分枝菌都是以接合到細菌的30S核糖體來阻斷核糖體的作用, 而導致蛋白質無法合成,造成細菌死亡 (Puius, et al., 2006)。 8. Lactose (4-0-β-galactopyranosyl-D-glucopyranose) (乳糖)是一種雙醣,由葡萄糖和半乳糖單體藉由β-1,4醣苷鍵而形成的,甜 度約蔗糖的五分之一,而乳糖存在於大部份的哺乳類乳汁當中,只有 少數例外,而在哺乳類乳汁當中乳糖大約佔2-10%,其中牛乳平均佔 4.8%、人類中佔7%。乳糖在不同溫度的狀態下其物化特性有所不同; 在水溶液中乳糖又分成α和β形式,在食品工業中,乳糖用於作嬰兒食 品及煉乳等等;在醫藥工業中,用於藥品的甜味劑和賦形劑;此外, 還可作細菌培養基 (Ganzle, et al., 2008)。 15.

(32) 9. Sucrose (α-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-fructofuranoside) (蔗糖)是一種非還原性的雙醣,具有旋光性,由葡萄糖和果糖單體藉由 α-1, 2醣苷鍵而形成的,只會被植物和其它光合作用植物,例如甘蔗 或是甜菜所合成,是植物儲藏、積累和運輸糖分的主要形式。在食品 加工業中是可以當作甜味劑或調味劑;在化妝品中可以運用在護膚產 品等等,蔗糖的代謝是可以當作能量來源之一,但是攝取過多會造成 蛀牙、肥胖、痛風與糖尿病等影響身體健康 (Wind, et al., 2010)。 潛在商業價值 海藻糖結構類似物可能變成一種新穎的藥物來治療神經性退化性 疾病,包括阿茲海默症、普恩蛋白疾病、帕金森氏病、以及多種多麩 醯胺疾病,例如亨丁頓舞蹈症、脊髓小腦萎縮症等,因為這些疾病在 台灣的比率很高,且開發和篩選出新藥來商業化,預期此新藥市場需 要的規模會相當龐大。 五、 蛋白質的結構. 1.. 蛋白質的結構 蛋白質結構是指蛋白質分子的空間結構。作為一類重要的生物大分. 子,蛋白質主要由碳、氫、氧、氮、硫等化學元素組成。所有蛋白質 都是由20種不同的L型α胺基酸連接形成的多聚體,在形成蛋白質後這 些胺基酸又被稱為殘基,若殘基數少於40就稱之為多肽或肽。要發揮 生物學功能,蛋白質需要正確摺疊為一個特定構形,主要是通過大量 的非共價鍵相互作用如氫鍵 (hydrogen bonding),離子鍵 (ionic interactions),凡得瓦爾力 (Van der Waols forces) 和疏水性作用力 (hydrophobic interactions) 來實現;此外,在一些蛋白質 (特別是分泌 性蛋白質)摺疊中,雙硫鍵也起到關鍵作用。為了從分子水平上了解 蛋白質的作用機制,常常需要測定蛋白質的三級結構,而定義上將蛋 16.

(33) 白質結構分成四個層次 (附錄八)。 1.1 一級結構 : 是指組成蛋白質分子的多肽鏈,是由共價鍵所組成線 性胺基酸的排列次序,而此種鍵結是屬於較強的共價鍵結,所以不易 被破壞,一般的變性作用後,二、三、四級結構已遭破壞後,蛋白質 還是可以保有其完整的一級結構仍完整。 1.2 二級結構 : 指胜肽鏈主鏈的原子局部空間分佈,不包括與其他肽 鏈的相互關係以及側鏈構型,僅涉及蛋白質分子主鏈的構形,是以不 同胺基酸殘基 (residue) 之間的羰基氧原子 (carbonyl oxygen atom, C=O) 和醯胺氫原子 (amide hydrogen atom, N-H) 基團間的氫鍵為主 而使胜肽鏈摺疊成穩定結構,主要為α-螺旋 (α-helix) 和β-平板 (β-sheet),如果這些氫鍵經由提高溫度、酸鹼條件或是加有機溶劑就 可加以破壞結構後,其二級結構自然就會因此而被破壞。 1.3 三級結構 : 蛋白質的胜肽鏈在多個二級結構為基礎上在三維空 間的進一步摺疊形成具有一定規律的一個蛋白質分子的三級結構,其 穩定三級結構的作用力是以氫鍵、疏水性作用力、鹽橋和凡得瓦爾力 等作用力,這些作用力可以存在於一級結構序列相間隔很遠的胺基酸 殘基的側鏈基團之間,因此蛋白質的三級結構主要是指胺基酸殘基的 側鏈間的結合,所以具有生化活性的蛋白質都有嚴格的特定三級結構。 除了這些作用力以外,在一些蛋白質的三級結構中還存在著一種共家 鍵結,是由兩個半胱氨酸的氫硫基 (sulfhydrl group) 側鏈經氧化反應 而形成的共價鍵,其稱之為雙硫鍵 (disulfide bonding)。雙硫鍵不屬於 上述這些作用力的一種,但是在某些胜肽鏈中能使相隔很遠的兩個胜 肽鍵結在一起,而這對於穩定蛋白質的三級結構有著相當的重要性。 1.4 四級結構 : 具有兩個或多個以上的獨立的三級結構的胜肽鏈次單 元 (subunits) 以微弱的分子作用力結合成的蛋白質,其中單獨的次單 17.

(34) 元就被稱為亞基。亞基之間不一定要共價連接,但有一些亞基之間是 通過雙硫鍵來連接,而穩定此種結構的作用力大多是疏水性作用力和 氫鍵,且穩定四級結構的作用力會較穩定三級結構的作用力還來的弱, 所以四級結構往往是最容易也最先被破壞的。不是所有的蛋白質都有 四級結構,許多蛋白是以單體或多聚體等形式,以利發揮更複雜的生 理功能。 所以蛋白質會因其立體結構的不同影響它們的功能,且蛋白質必 需要有正確的構形才會有活性以進行生化反應。. 2.. 內聚體 (inclusion body) 近年來廣大的國際市場對生物製藥領域的第 1、2 代蛋白質藥品需. 求是日益增加,而估計產值至少有 50x109 美金,且有效地治療很多 疾病,然而在一些使用在病患的部分藥品單價相對於傳統的藥品是比 較昂貴的,所以會造成藥品推廣使用上的困難 (Chen and Leong, 2009)。 但是隨著生物科技的進步、基因技術的發展,很多蛋白質藥品的生產 都是把重組基因放至微生物的宿主上,讓微生物大量繁殖,再將其分 離純化,而細菌是目前廣泛地被運用來大量的生產我們所需的蛋白質, 其不需要後轉譯修飾 (post-translational modification) 如醣基化 (glycosylation)。且在細菌方面的研究如大腸桿菌,其已經完善地被建 立出完整的基因遺傳資訊、高效率宿主表達系統、蛋白質純化方法的 應用,而通常在表達重組外來基因蛋白質時會考慮到成本、操作方法 的簡便,所以大腸桿菌是第一首選。 然而大腸桿菌有很高的表達能力,但是往往在宿主細胞產生沒有活 性的內聚體 (inclusion body) (附錄九),或是聚集形成不具活性的固體 沉澱物,稱之為糾結體 (aggregate),而會形成內聚體的原因有可能是 蛋白質在細胞生理不正常的狀態下高度被表達成不可溶的蛋白質,例 18.

(35) 如疏水界面的暴露而影響蛋白質摺疊,形成糾結體等等,所以需要額 外的重新摺疊步驟來把內聚體回復成有活性的可溶性蛋白質。雖然表 達出來的蛋白質是內聚體形式,但是也有其優點如下: 1. 在大腸桿菌的高度表達下,每公升的菌液當中所表達的重組蛋 白佔全部蛋白質30% (8.5克) 的蛋白質。 2. 內聚體蛋白質可很容易地藉由離心、分子篩選層析或凝膠過濾 法來跟宿主細胞的其它可溶性蛋白質做分離。 3. 由於重組基因所表達出的內聚體可以抵抗被蛋白酶水解掉。 4. 在純化之前所破菌後的溶解產物 (lysate) 性質跟蛋白質性質有 很高的相似性,如此一來可以減少純化的步驟。 5. 如果重組基因所表達的重組蛋白對宿主是有毒的話, 其在大量 形成沒有活性的內聚體時可能會增加細胞的生存能力,進而增 加目標基因的產量 (Li, et al., 2004)。 六、 蛋白質的變性 1.. 蛋白質的變性 蛋白質的變性受到高溫、強鹼、強酸、尿素、化學藥劑、有機溶劑、. 重金屬、紫外線以及放射線等等物理或是化學性的破壞,引起蛋白質 分子的自然結構改變,並引起生物活性的喪失和物理、化學性質的異 常變化,此稱之為變性作用 (denaturation)。 變性作用又可以分為可逆跟不可逆兩種,不可逆變性是指去除變性 因素後蛋白質構形不能恢復原狀,例如蛋白遇到熱會凝固成白色的固 體,當蛋白已經被熱凝固之後,即使它冷卻後也不會恢復成原來未加 熱時的澄清液體,所以加熱蛋白質會使其性質改變,而這種變性反應 是不可逆的。至於可逆變性是指去除變性因素後蛋白質的構形尚可恢 復原狀,如加尿素 (urea) 和鹽酸胍 (guanidine hydrochloride) 等的化學 19.

(36) 藥劑可以引起蛋白質變性,但去除尿素和鹽酸胍後蛋白質構形及可以 恢復原狀。 蛋白質發生可逆變性時,胜肽鏈的共價鍵並沒有斷裂,所以蛋白質 的特殊氨基酸序列,在變性之後仍然完整存在。雖然如此,但是大部 分蛋白質的特性都已經產生了變化,這些變化原因如下: 1. 由於疏水機團暴露在分子表面,引起溶解度降低. 2. 改變對水結合的能力. 3. 生物活性消失 (如失去酵素活性或是免疫活性). 4. 結晶性下降. 5. 由於胜肽鏈的暴露,易被蛋白質酶水解,增加酵素水解的敏感性. 6. 滴定曲線改變等等。 2.. 常見的化學變性劑 通常在實驗室大多是利用化學藥品破壞蛋白質的疏水性作用力、氫. 鍵、雙硫鍵、離子性作用力,使內聚體或糾結體溶解而形成一散亂的 結構,此一程序稱為去摺疊 (unfolding) 或是變性,其所用的化學藥 品稱之為變性劑 (denaturant),一般常見的化學變性劑有以下數種: 尿素 (urea) : 主要是破壞分子間疏水作用力,通常使用濃度8-10M。 鹽酸胍 (guanidine hydrochloride) : 主要可以破壞分子間的疏水性作 用力及靜電作用力,通常使用6-8M。 以上兩種變性劑主要是利用其與蛋白質分子間形成氫鍵鍵結,且此 作用力大於穩定蛋白質結構的作用力,因此將蛋白質結構拉開,而成 為一個鬆散的結構。 還原劑 (reducing agent): 一般是指二硫代蘇糖醇 (ditheothiol) 與β氫硫基乙醇 (β-mercaptoethanol),都是用來還原蛋白質鏈中的雙硫鍵, 使其還原成氫硫基,而所使用濃度需視蛋白質鏈中所含的雙硫鍵數目 20.

(37) 而作適當的調整。 3.. 蛋白質的復性 (renaturation) 為使蛋白質恢復其生理活性,需先將內聚體從宿主細胞分離出來,. 再利用變性劑溶解,但其強度會破壞蛋白質分子的完整結構,而成為 一級結構的多胜肽鏈, 因此必須將其進行重新摺疊 (refolding),使其 恢復原有的結構與活性,此過程稱為復性 (renaturation)。 3.1 蛋白質復性的方法 在傳統的蛋白質復性的方法中,不外乎直接稀釋或是透析方式來降 低蛋白質之間的交互作用,以及減低變性劑的濃度,但是這兩種方法 會很消耗大量溶液,增加實驗成本,進而增加後續純化的繁瑣,且蛋 白質回收率會很低,而相對於高濃度的蛋白質復性的話,在移除變性 劑的濃度後會因為蛋白質分子間或是分子內的作用力增加,形成錯誤 摺疊 (misfolding) 的聚集體,因此降低蛋白質復性的效率。 所以到目前為止,有很多種不同蛋白質復性的方法是為了在高濃度 的蛋白質下進行蛋白質復性,進而增加回收率,例如管柱層析復性 (on-column chromatographic refolding),或是在蛋白質復性中添加一些 添加物來幫助蛋白質復性,但是每種蛋白質復性的方法並不適用於各 種蛋白質,所以在很多研究當中必需要依照自己需求的條件來做蛋白 質復性,舉例來說在管柱層析復性的方法有分子大小排斥層析法、離 子交換層析法、疏水性作用層析法以及固定金屬離子親和性層析法, 這些層析法的基本復性原理是管柱平衡後,將變性蛋白質上樣並吸附 在膠體上,然後再利用緩衝溶液洗掉一些未吸附在膠體上的雜蛋白質, 最後在復性緩衝溶液下將吸附的蛋白質洗脫下來,在洗脫過程中完成 復性。但是層析管柱會因為其所使用的固定膠體的不同,而以不同方 式來進行蛋白質的復性,所以分別在以下作簡單描述。 21.

(38) 3.1.1. 分子大小排斥層析法. 分子大小排斥層析法又可以稱為凝膠過濾層析法 (gel-filtration chromatography),主要是利用變性劑、部分摺疊與完全摺疊好的蛋白 質的分子半徑和形狀的不同來分離,而管柱裡的膠體含有不同大小孔 穴的矽膠小珠。當樣本分子接近於膠體孔徑時,會滯留在管柱裡的時 間較久,相對於大分子的話因不能穿過膠體孔穴,所以會很快地跟移 動相流出來,如此一來樣本會在膠體內因流動速率不同而彼此分開就 達到分離的效果。 3.1.2. 離子交換層析法. 離子交換層析法 (ion exchange chromatography) 的基本原理以離子 交換樹脂為固定相,利用蛋白質表面所帶的電荷跟樹脂表面相反的官 能基進行靜電作用並且吸附在管柱上,然後在跟樹脂相同電荷的離子 溶液進行交換,所以根據樣本中的離子對樹脂的親和力不同,而且變 性劑不帶電荷故不會吸附在樹脂上,來達到分離效果。然而蛋白質由 於管柱裡的變性劑濃度的逐漸降低,而開始慢慢地重新摺疊出正確的 構形,至於已經吸附在樹脂上的蛋白質可以避免蛋白質之間發生聚集 的現象而影響到復性的效率。 3.1.3. 固定化金屬離子親和性層析法. 固定化金屬離子親和性層析法 (immobilized metal-ion affinity chromatography) 的原理是利用變性後的重組蛋白的N端或是C端含有 一段短鏈的組氨酸標籤 (histidine tag),然後跟管柱裡的金屬離子進行 專一性親和性吸附,如此一來便可以藉此專一性的吸附,之後慢慢來 移除變性劑和雜蛋白,以幫助蛋白質逐漸摺疊出正確結構。 常用在固定化金屬親和性層析裡的過渡金屬離子 (如: Cu2+、CO2+、 Ni2+及Zn2+等) 與組氨酸殘機上的咪唑基 (imidazole group) 的氮原子; 22.

(39) 色氨酸 (tryptophan) 殘基上indoyl基的氮原子;半胱氨酸 (cysteine) 殘 基上thiol 基的硫原子與金屬離子鍵結形成配位鍵而形成錯化合物之 親和作用。 疏水性作用層析法. 3.1.4. 疏水性作用層析法 (hydrophobic interaction chromatography) 的原 理是指蛋白質表面的疏水性區域基團,以在平衡緩衝液 (equilibration buffer) 與蛋白質分子中加入高鹽濃度,使蛋白質分子在疏水性層析 管柱中與疏水性表面產生疏水性交互作用以減少蛋白質沉澱,且在高 濃度下蛋白質吸附性比較好,之後再以低鹽濃度溶液沖洗,完成分離 的效果。 4.. 蛋白質摺疊的動力學 (Refolding kinetics) 根據 (Kiefhaber, et al., 1991) 的文獻內容指出,蛋白質摺疊與糾結. 體 (aggregate) 競爭時的動力學可以用一個很簡單的方程式來表達, 如下:. 中間產物 (I) 的形成是從未摺疊好的蛋白質(U) 跟摺疊好的原生形 蛋白質(N) 之間的產物,(A) 是指可正逆反應的糾結體,其可以當作 動力學的一次反應方程式 (n=1),然而在形成糾結體蛋白質時是屬於 更高次方反應的方程式 (n≧2)。 未摺疊的蛋白質濃度隨著時間而改變,如下圖方程式所表示:. 23.

(40) 而相對於原生形態蛋白質數目的是如下:. K2是蛋白質摺疊的速率常數、K3是形成糾結體的速率常數,且證據 顯示中間產物在毫秒內形成類似融熔狀的球體。當從未摺疊的蛋白質 形成到中間產物的過程 (U→I) 是被認為一瞬間的反應,其在蛋白質 摺疊的動力學中的K1 (蛋白質摺疊的速率常數) 是可以被忽略的。 U是指無因次濃度的未摺疊蛋白質,U/U0中的U0是指變性的蛋白質 一開始的濃度、N是指無因次濃度的重新摺疊的蛋白質,而n是指形 成糾結體的反應次方,這個微分方程式也有2次方的方程式,其如下 表示。 2次方程式:. 至於原生態蛋白質產量的方程式則是如下:. 所以一般的蛋白質摺疊方法的目的是為了抑制負反應,進而增加摺 疊正確地的蛋白質產量,因此決定動力學常數是依據摺疊過程條件和 是使用的摺疊溶液 (Schlegl, et al., 2003)。 24.

(41) 貳、 研究目的 (Aim) 綜合以上觀點,海藻糖是有很高的應用價值,而且廣泛地運用在 各個領域中,且在一些研究神經性退化性疾病的實驗指出,海藻糖是 能有效地改善其症狀,因為到目前為止人類海藻糖水解酶的三級結構 還未被解出來和定性,因此我的論文是要以人類海藻糖水解酶 (human trehalase, hTreH) 來做為我研究的主題。然後我自己擬定幾個 實驗目標如下: 1. 從大腸桿菌所表達出來的人類海藻糖水解酶基因: 將選殖出來的人類海藻糖水解酶送入 pET23a(+)和 pTriEx 質 體,並在大腸桿菌裡功能性表達。 2. 新型海藻糖水解酶抑制劑的檢測: 用豬腎臟的海藻糖水解酶來篩選海藻糖類似物的檢測,以篩 選出可以用來抑制 SCA17 等神經性退性疾病的候選藥物。. 25.

(42) 參、 研究材料與方法 (Materials and Methods) 一、 使用菌體 本實驗選取 E.coli DH5α 與 BL21(DE3) 分別做為基因選殖宿主與基 因表達寄主細胞,前者常用以大量複製質體 DNA 和高效率的基因選 殖,來做菌種的保存。後者則藉 T7 RNA polymerase 啟動蛋白質表現, 適合用來做蛋白質表達與純化相關實驗。所帶質體則為 pET-23a(+)-hTreH (isoform 1、2) 和 pTriEx-hTreH (isoform 1)。 pET-23a(+) 載體原有 3666 bps,帶有 T7 promoter、T7 terminator、 Ampicillin resistant 等基因與 multiple cloning site,另有可使插入基因 在胺基酸序列 C 端表現六組 histidine-tag 的序列,便於插入的 hTreH 基因表達後純化,而 pTriEx 是一種可以在哺乳類、昆蟲和大腸桿菌 這三種系統中表達的載體,因為載體中含有 mammalian promoter (Chicken β-actin, or CMVie)、insect promoter 和 E. coli promoter (T7lac), 所以可以在大腸桿菌裡來表達 hTreH 基因。 二、 Human trehalase 的基因重組載體之建構 1. 目標蛋白載體之建構 以 pET23a(+) 和 pTriEx 的質體來當作載體,建構含有人類海藻糖水 解酶 (hTreH) 基因片段的重組質體,以及為了增加人類海藻糖水解酶 (hTreH) 可溶性蛋白質的相關重組質體。其全部的重組質體如下: pET23a(+)-hTreH (isoform 1、2) 和 pTriEx-hTreH (isoform 1) 野生型 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175S)、 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175S)、 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C28/34/175/202S) pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175A)、 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175/202A)。 26.

(43) 2. 表達載體的建構 本研究所使用的 pET-23a(+) 質體是由張紘綸學長利用 NdeΙ (Fermentas) 與 EcoRΙ (Fermentas) 限制酶酵素在 37℃反應 16-18 小時, 把 pET-23a(+)-DRTreS 中的耐輻射菌 Deinococcus radiodurance (DRTreS) 的基因片段給切除掉,並以 QIAquick Gel Extraction Kit 來 得到載體 pET-23a(+) vector 片段,其質體大小為 3666 bp,含有 T7 promoter、Multiple cloning sites、Ampicillin resistant 基因,並由 T7 RNA polymerase 來開始大量表達重組基因蛋白。 本研究所使用的 pTriEx-hTreH (isoform 1) 野生型是由李桂楨老師 實驗室的林志信學長所選殖出來並由實驗室的游舒琇學妹所建構起 來,而我負責在大腸桿菌中表達。 3. Human trehalase (isoform 1、2) 的基因製備 3.1 Human trehalase (isoform 1) 本實驗所使用的人類海藻糖水解酶基因是李桂楨老師實驗室的林 志信學長由人類小腸的 cDNA (購買自 Invitrogen),利用 PCR 的方式 將此段基因放大,設計兩條 primer 夾全長 hTreH 基因,PCR 完後使 用 Gel elution kit (Qiagene) 得到 hTreH 基因片段,大小約 1.5 kb。 Primer. hTreH 1:5’ CCACCATGCCAGGGAGGA3’ hTreH 2:5’ AGAGGAGGGCTGTCACCA3’. PCR反應物分別加入100 ng μL Intestine cDNA當作模板,1 μL hTreH 1和hTreH 2 primer (10 mM),5 μL 10X taq reaction buffer,0.2 μL tag DNA polymerase (5 U/μL),2 μL dNTP (2.5 mM),38.8 μL ddH2O, 其PCR反應總體積為50 μL來進行反應。PCR流程為: 94oC 5 min;然後 進行40個循環反應: 94 oC變性30 Sec,58oC黏合30 Sec,72oC延伸2 min;循環結束後72oC再延伸10 min。 27.

(44) 3.2 Human trehalase (isoform 2) 本實驗所使用的人類海藻糖水解酶基因是由張紘綸學長跟 Thermo scientific 購買帶有人類海藻糖水解酶基因的質體,利用 PCR 的方式 將此段基因放大,設計兩條 primer 夾出不具有 N 端的 Signal peptide 與 C 端的 GPI anchoring domain 的 trehalase 基因,也同時在 5’與 3’ 端分別添加 NdeΙ 與 EcoRΙ 的切位,之後 PCR 完成後使用 Gel elution kit (Qiagene) 得到 hTreH 基因片段,大小約 1.5 kb。 Primer. hTreH 1:5’ CGCCATATGCTACCCCCACCCTGTGAG3’ hTreH 2:5’ CGCAATTCTTTGAGGTCAGCCGGTC3’. PCR反應物分別加入1 μL trehalase plasmid DNA (10 ng) 當作模板,1 μL hTreH 1和hTreH 2 primer (10 mM),5 μL 10X taq reaction buffer, 0.5 μL tag DNA polymerase (5 U/μL),4 μL dNTP (2.5 mM),39.5 μL ddH2O,其PCR反應總體積為50 μL來進行反應。PCR流程為: 95oC 3 min;然後進行30個循環反應: 95 oC變性1 min,50oC黏合1 min,72oC 延伸2 min;循環結束後72oC再延伸7 min,4oC 5 min。 4. Human trehalase 的基因與表達載體之接合反應 首先將 pGEMT-hTreH (isoform 1) 用 SacI (Fermentas) 和 BspHI (Fermentas) 切出 isoform 1 和 2 差異的片段,然後再用 SacI (Fermentas) 和 BspHI (Fermentas) 把 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) 中跟 isoform 1 差異的片段給切掉,留剩下片段,之後以莫耳數比 3:1 進行混合並 且添加 T4 DNA Ligase (Fermentas) (總反應體積的 1/10) 與 10X Ligase buffer (Fermentas),於 16℃反應 16-18 小時,即得 pET23a(+)-hTreH (isoform 1),其整個質體大小為 5225 bps。 而人類海藻糖水解酶基因片段 (isoform 2) 和 pET-23a(+)選殖質體 片段,以莫耳數比 3:1 進行混合並且添加 T4 DNA Ligase (Fermentas) 28.

(45) (總反應體積的 1/10) 與 10X Ligase buffer (Fermentas),放於 16℃反應 16-18 小時,即得 pET23a(+)-hTreH (isoform 2),其整個質體大小為 5132 bps。 5. DNA 質體製備 將上述第 4 點的產物轉型到 E. Coli (DH5α) (GeneMark, Tainan,Taiwan) 中,並養在含有 100 mg/mL Ampcillcin 的 3 mL LB medium (5 g/L yeast extract、10 g/L tryptone、10 g/L NaCl ),於 37℃ 培養箱培養 16 到 18 小時,之後再把菌液以 12,000 rpm 離心 5 分鐘後, 去除掉上清液,留下菌體,並利用 High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid) 來抽質體,其抽質體流程如下: 1. 先加入 200 μL 的 PD1 Buffer 到微量離心管中混和均勻後,在加 入 200 μL 的 PD2 Buffer 到微量離心管中溫和地上下翻轉 10 次, 然後在室溫下靜置 2 分鐘。 2. 接著在加入 300 μL 的 PD3 Buffer 到微量離心管中溫和地上下翻 轉 10 次,並以 13,000 rpm 離心 3 分鐘。 3. 先把 PD Column 組裝在 2 mL 的 Collection Tube 中,然後把第 2 點混和均勻離心後的上清液放入 PD Column 中,接著使用離 心機 (Eppendorf centrifuge, 5804R),以 13,000 rpm 離心 30 秒, 去除廢液。 4. 加入 400 μL W1 Buffer 到 PD Column 中後,以 12,000 rpm 離心 30 秒,去除廢液,然後在加入 600 μL Wash Buffer 到 PD Column 中後,以 12,000 rpm 離心 30 秒,去除廢液。 5.. 再利用真空抽氣來去除殘存的酒精,然後把 PD Column 移到 新的微離心管中,再加入 50 μL 的 Elution Buffer 後靜置 2 分鐘, 最後以 12,000 rpm 離心 2 分鐘,即得到 DNA 質體。 29.

(46) 最後將抽好的重組質體,以 NdeΙ (Fermentas) 與 EcoRΙ (Fermentas) 切割確認接入的質體人類海藻糖水解酶基因片段大小是否正確,將確 認的菌落送定序,確認接上的序列是否有誤,即可得到 pET-23a(+)-hTreH (isoform 1、2) 的重組質體 (圖一、圖二)。 6. 建構定點突變 Human trehalase (isoform 2) 基因的重組質體 6.1 設計定點突變的引子如下: ___________________________________________________________ Oligo sequence (5’ ----> 3’). Mutation site. ___________________________________________________________ 1. C28/34-C/S : ATGCTACCCCCACCCAGCGAGAGTGAGATTTACAGCCATGGGGAGCTCC NcoI. 2. C175-C/S : TTTGTTGAATTCTACTACAGCTATGGGCATGTCC EcoRI. 3. C202-C/S F: TGACATTAATGATGGATAGCTACTTGACTCACACC VspI C202-C/S. R : GGTGTGAGTCAAGTAGCTATCCATCATTAATGTCA VspI. 4. C175-C/A: TTTGTTGAATTCTACTACGCCTATGGGCATGTCC 5. C202-C/A F: TGACCCTCATGATGGATGCATACTTGACTCACACC C202-C/A. R:GGGGTGAGTCAAGTATGCATCCATCATGAGGGTCA. 6.2 定點突變 PCR 反應 6.2.1 Human trehalase (isoform 2) (C175S) 突變株的 PCR 反應 分別加入 1 μL trehalase (isoform 2) plasmid DNA (50 ng/μL) 當作模 板,1 μL C175-C/S primer (0.2 uM),5 μL Pfu DNA polymerase 10X 30.

(47) buffer,0.5 μL Pfu DNA polymerase (1 U/μL),4 μL dNTP (200 uM),38.5 μL ddH2O,其 PCR 反應總體積為 50 μL 來進行反應。PCR 流程為: 95oC 3 min;然後進行 18 個循環反應: 95 oC 變性 15 seconds,50oC 黏合 1 min, 72oC 延伸 12 min;循環結束後 72oC 再延伸 20 min,4oC 5 min。 反應完後的產物加入 DpnI 後作用 overnight,把產物再跟 pET-23a(+) 選殖質體片段進行接合作用 (Ligation),及可以得到 pET23a(+)-hTreH (isoform 2) (C175S) 之重組質體,其定序結果 (圖三 A)。 6.2.2 Human trehalase (isoform 2) (C28/34/175S) 突變株的 PCR 反應 分別加入 1 μL trehalase (C175S) plasmid DNA (50 ng/μL) 當作模板, 1 μL C28/34-C/S primer (0.2 uM),5 μL Pfu DNA polymerase 10X buffer, 0.5 μL Pfu DNA polymerase (1 U/μL),4 μL dNTP (200 uM),38.5 μL ddH2O,其 PCR 反應總體積為 50 μL 來進行反應。PCR 流程為: 95oC 3 min;然後進行 18 個循環反應: 95 oC 變性 15 seconds,66oC 黏合 1 min, 72oC 延伸 12 min;循環結束後 72oC 再延伸 20 min,4oC 5 min。 反應完後的產物加入 DpnI 後作用 overnight ,把產物再跟 pET-23a (+)選殖質體片段進行接合作用 (Ligation),及可以得到 pET23a(+) -hTreH (isoform 2) (C28/34/175S) 之重組質體,其定序結果 (圖三 B)。 6.2.3 Human trehalase (isoform 2) (C28/34/175/202S) 突變株 Overlap PCR 反應 PCR I: 分別加入 1 μL trehalase (C28/34/175S) plasmid DNA (50 ng/μL) 當作模板,1 μL C202-C/S Forward primer (0.2 uM),1 μL hTreH 2 primer (0.2 uM),5 μL Pfu DNA polymerase 10X buffer,0.5 μL Pfu DNA polymerase (1 U/μL),4 μL dNTP (200 uM),37.5 μL ddH2O,其 PCR 31.

參考文獻

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