第五章 討論
第三節 IL-10 調控細胞內訊息傳遞蛋白表現
文獻指出 TNF-α 刺激肺表皮細胞分泌 IL-6、IL-8 和 RANTES，而 IL-10 可抑制 TNF-α 活化 IκB kinase (IKK)以及磷酸化 IκBα 啟動 ubiqutin system 被 proteinase 降解的情形來阻斷 NF-κB pathway 啟動其 下游調控的發炎因子進行轉譯(66, 67)。此外 IL-17 刺激 A549 細胞也 可啟動MAPK pathway 磷酸化下游蛋白 ERK1/2 造成 IL-6、IL-8 和 ICAM-1 的大量表現(62)。
從實驗中發現給予 TNF-α 刺激 15 分鐘後的確可以藉由 IκBα蛋 白的降解活化NF-κB pathway，啟動 IL-6 和 IL-8 的轉錄因子進而增加 蛋白質和RNA 的表現量，而結合 IL-10 和 TNF-α 共同作用則會使 IκBα 蛋白無法降解，同時阻斷NF-κB pathway，並可以抑制 IL-6 和 IL-8 蛋 白質和RNA 的表現量。另外，我們發現給予 IL-17 刺激 5 分鐘後可 造成p-ERKs 蛋白的大量表現，若加入 IL-10 作用後 p-ERKs 蛋白表現 量則有下降的情形，故推測IL-10 可能是藉由抑制 p-ERKs 蛋白表現量 來調降IL-6 和 IL-8 的生成。
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第陸章
結論與未來方向
45
目前在小鼠肺細胞初代培養模式上，我們已經發現給予重組蛋白
IL-10 可分別抑制由 IL-4 和 TNF-α 刺激下，所引起小鼠肺上皮細胞 eotaxin 和 IL-6 的分泌。此外在人的肺上皮細胞 A549 和 BEAS-2B 培 養上，單獨給予TNF-α 或 IL-17 皆會對肺上皮細胞造成發炎的效果刺 激IL-6 和 IL-8 分泌；而在 IL-10 參與其反應時，可有效抑制 IL-6 和 IL-8 的表現。此外，我們更進一步研究 IL-10 是如何分別調控 TNF-α 和IL-17 刺激 A549 細胞內訊號傳遞蛋白的表現及是否藉由影響 IL-6 和IL-8 mRNA 的表現，來達到抗呼吸道發炎的效果。從結果得知 TNF-α 可誘發 NF-κB pathway 中 IκBα蛋白的降解，另一方面 IL-17 則 可誘發MAPK pathway 中 p-ERK1/2 的表現，而 IL-10 主要藉由抑制 IκBα蛋白的降解和 p-ERK 的表現來阻斷下游訊號傳遞，減少 IL-6 和 IL-8 的合成。
綜合以上結論，我們發現 IL-10 的確可減緩由 TNF-α和 IL-17 所誘 發的呼吸道發炎反應，未來將進一步研究IL-10 還可藉由抑制哪些訊 號傳遞路徑達到此效果，以及當結合TNF-α和 IL-17 共同刺激時，IL-10 是否仍具有抗發炎之效果，還有 IL-10、IL-17 和 TNF-α彼此間又是如 何去調控的。
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第柒章
圖表
47
0 3 30 100 200 300
0 1 2 3 4
**
**
**
**
IL-4 (unit/ml)
eotaxin(ng/ml)
Fig. 1 給予不同劑量 IL-4 刺激小鼠肺細胞分泌 eotaxin
加入不同劑量的 IL-4 刺激培養，經 48 小時後收集細胞培養上 清液，以ELISA 測定 eotaxin 的含量。與未加 IL-4 組相比，在* p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常 顯著之差異。
48
Fig. 2 給予 IL-4 刺激小鼠肺細胞在不同時間點下分泌 eotaxin 的
情形
分別給予(A)IL-4 (5 unit/ml)及(B)IL-4 (30 unit/ml)的刺激後，分 別在0、4、24、48 及 72 小時收集上清液分析肺細胞 eotaxin 的分 泌量。與未加IL-4 組相比，* p<0.05,** p<0.001 表示有統計上的 差異。
49
0 0.1 1 10 100
0 1000 2000 3000
* *
IL-10(ng/ml)
eotaxin (pg/ml)
Fig. 3 不同劑量 IL-10 調控 IL-4 刺激小鼠肺細胞分泌 eotaxin
在 IL-10 抑制實驗中，細胞進行 16-18 小時 starvation 後加入不 同劑量的重組蛋白IL-10，而後 2 小時才進行 IL-4 (30 unit/ml)的刺 激，48 小時後收集細胞培養的上清液，與未加 IL-10 組相比，在*
p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間 有非常顯著之差異。
50
0 0.1 1 10 100
0.0 1.5 3.0 4.5
*
**
*
TNF-α (ng/ml)
IL-6 (ng/ml)
Fig. 4 給予不同劑量 TNF-α 刺激小鼠肺細胞分泌 IL-6 的情形
加入不同劑量的TNF-α 刺激培養，經 48 小時後收集細胞培養上 清液分析肺細胞分泌IL-6 的產量。與未加 TNF-α 組相比，在*
p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組 間有非常顯著之差異。
51
TNF- α (1 ng/ml)
0 4 24 48 72
0 1 2 3
*
*
hour
IL -6 ( n g /m l)
Fig. 5 給予 TNF-α 刺激小鼠肺細胞在不同時間點下分泌 IL-6 的情
形
給予TNF-α (1 ng/ml)的刺激後，分別在不同時間點收上清液分 析IL-6 的分泌量。與未加 TNF-α 組相比，在* p<0.05 時表示兩組 間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著之差 異。
52
Fig. 6 在不同時間點給予不同劑量 IL-10 對 TNF-α 刺激小鼠肺細
胞分泌IL-6 的影響
在重組蛋白IL-10 抑制作用實驗中，做以下三組實驗： (1)前給 予(pre-IL-10)：先給予 IL-10 (1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)作用 24 小時後，才給予 TNF-α(1 ng/ml)刺激，48 小時後收上清液。(2) 同時給予(co-IL-10)：給予 IL-10 (1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)刺 激2 小時後才給予 TNF-α(1 ng/ml)刺激，48 小時後收上清液。(3) 之後給予(late-IL-10)：給予 TNF-α(1 ng/ml)刺激，24 小時後再加入 IL-10 (1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)作用，經 24 小時後收上清液。
NC 組為未添加任何刺激物，PC 組為只加 TNF-α(1 ng/ml)刺激。
與PC 組相比，在* p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，在** p<0.001 時代表兩組間有非常顯著之差異。
53 IL-4( 100 ng/ml)
hour
4 TNF-alpha(0 ng/ml)
TNF-alpha( 10ng/ml) TNF-alpha( 100 ng/ml)
*
4 IL-13(0 ng/ml)
IL-13( 10ng/ml) IL-13( 100 ng/ml)
* IL-4( 100 ng/ml)
hour
20 TNF-alpha( 0 ng/ml)
TNF-alpha( 10ng/ml) TNF-alpha( 100 ng/ml)
hour IL-13( 100 ng/ml)
hour
IL-6 (ng/ml)
A549 BEAS-2B
Fig. 7 給予 IL-4、IL-13 及 TNF-α 刺激 A549 與 BEAS-2B 細胞在
不同時間點下分泌IL-6 的情形
細胞starvation 16-18 小時後，分別給予 IL-4、IL-13 和 TNF-α(0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)的刺激後，分別在不同時間點收上清 液觀察IL-6 的分泌量。與不給予刺激組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
54 IL-4( 100 ng/ml)
hour
30 TNF-alpha(0 ng/ml)
TNF-alpha( 10ng/ml) TNF-alpha( 100 ng/ml)
*
30 IL-13(0 ng/ml)
IL-13( 10ng/ml) IL-13( 100 ng/ml)
*
30 IL-4(0 ng/ml)
IL-4(10 ng/ml)
30 TNF-alpha(0 ng/ml)
TNF-alpha(10 ng/ml)
細胞starvation 16-18 小時後，分別給予 IL-4、IL-13 和 TNF-α(0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)的刺激後，分別在不同時間點收上清 液分析IL-8 的分泌量。與不給予刺激組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
55 IL-4( 100 ng/ml)
hour
2.0 TNF-alpha( 0 ng/ml)
TNF-alpha( 10ng/ml) TNF-alpha( 100 ng/ml)
* IL-13( 100 ng/ml)
hour IL-4( 100 ng/ml)
*
2.0 TNF-alpha(0 ng/ml)
TNF-alpha( 10ng/ml) TNF-alpha( 100 ng/ml)
*
2.0 IL-13(0 ng/ml)
IL-13( 10ng/ml) IL-13( 100 ng/ml)
hours
RANTES(ng/ml)
A549 BEAS-2B
Fig. 9 給予 IL-4、IL-13 及 TNF-α 刺激 A549 與 BEAS-2B 細胞在
不同時間點下分泌RANTES 的情形
細胞starvation 16-18 小時後，分別給予 IL-4、IL-13 和 TNF-α(0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)的刺激後，分別在不同時間點收個別 上清液分析RANTES 的分泌量。與不給予刺激組相比，在* p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非 常顯著之差異。
56
Fig. 10 在不同時間點給予不同劑量 IL-10 對 TNF-α 和 IL-13 刺激 A549 細胞分泌 IL-6 的影響
在IL-10 抑制作用的實驗中將 A549 細胞 starvation 16-18 小時後，
分別做前給予(pre-IL-10)、同時給予(co-IL-10)及之後給予
(late-IL-10) IL-10 的實驗。各組加入 IL-10 的作用時間(1)前給予 (pre-IL-10)：先給予 IL-10 作用 24 小時後，才給予 TNF-α或 IL-13 刺激，經48 小時後收細胞上清液。(2)同時給予(co-IL-10)：隔 24 小時後，給予IL-10 並同時加入 TNF-α或 IL-13 刺激，48 小時後 收細胞上清液。(3)之後給予(late-IL-10)：隔 24 小時後給予 TNF-α
或IL-13 刺激，經 24 小時後再加入 IL-10 刺激，再經 24 小時後 收細胞上清液。NC 組為未添加任何刺激物，PC 組為細胞只加 TNF-α或 IL-13 刺激。與 PC 組相比，* p<0.05 時表示兩組間有顯 著差異，** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著的差異。
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Fig. 11 在不同時間點給予不同劑量 IL-10 對 TNF-α 和 IL-13 刺激 A549 細胞分泌 IL-8 的影響
在IL-10 抑制作用實驗中將 A549 細胞 starvation 16-18 小時後，
分別做前給予(pre-IL-10)、同時給予(co-IL-10)及之後給予
(late-IL-10) IL-10 的三組。此三組實驗會各別加入 TNF-α或 IL-13 來刺激細胞，而IL-10 加入的作用時間及條件陳述請參考 Fig.10 的相同說明。NC 組為未添加任何刺激物，PC 組為細胞只加 TNF-α 或IL-13 (10 ng/ml)刺激。與 PC 組相比，在* p<0.05 時表示兩組間 有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著之差 異。
58
Fig. 12 在不同時間點給予不同劑量 IL-10 對 TNF-α 刺激 A549 細胞分泌 RANTES 的影響
在IL-10 抑制作用實驗中將 A549 細胞 starvation 16-18 小時後，
分別做前給予(pre-IL-10)、同時給予(co-IL-10)及之後給予
(late-IL-10) IL-10 的三組。此三組實驗會各別加入 TNF-α或 IL-13 來刺激細胞而IL-10 加入的作用時間及條件陳述請參考 Fig.10 的 相同說明。NC 組為未添加任何刺激物，PC 組為細胞只加 TNF-α
或IL-13 (10 ng/ml)刺激。與 PC 組相比，在* p<0.05 時表示兩組間 有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著之差 異。
59 Fig. 13 在不同劑量IL-10刺激下A549細胞表現IL-10接受器的情形 細胞starvation 16-18小時後，給予不同劑量IL-10(1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml)與IL-17(10 ng/ml)刺 激A549細胞，以未加刺激物作為陰性對照組 (negative control, NC) ，24小時後收集細胞進行螢光抗體染色 分析A549細胞表面接受器IL-10R (CD210) 表現量，其結果以Mean表示。
60
細胞starvation 16-18 小時後，單獨給予 TNF-α (10 ng/ml)或結合 IL-10 (10 ng/ml)刺激後，在 24 小時內分別於不同時間點收上清液 檢測IL-6 和 IL-8 的分泌量。與 TNF-α 組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
61 IL-6 expression (% of control)
Fig. 15 IL-10 在作用的 24 小時內對 TNF-α 刺激 A549 細胞表現
62 IL-8 expression (% of control)
Fig. 16 IL-10 在作用的 24 小時內對 TNF-α 刺激 A549 細胞表現 IL-8 mRNA 的影響。
細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 TNF-α (10 ng/ml)或結合 IL-10(10 ng/ml)刺激後，在 24 小時內分別於不同時間點收集細胞 觀察IL-8 mRNA 的表現量。與 TNF-α 組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
63
Fig. 17 IL-10 調控 TNF-α 刺激 A549 細胞中 IκBα蛋白的表現量 細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 TNF-α (10 ng/ml)或結合 IL-10(10 ng/ml)刺激後，分別在不同時間點收細胞以西方點墨法偵 測IκBα蛋白的表現量。
64
Fig. 18 給予不同劑量 IL-17 刺激 A549 細胞在不同時間點下分泌 IL-6、IL-8 和 RANTES 的情形
細胞starvation 16-18 小時後，分別給予 IL-17(0 ng/ml、10 ng/ml、
100 ng/ml)的刺激後，分別在不同時間點收集上清液以 ELISA 檢測 IL-6、IL-8 與 RANTES 的分泌量。與不給予刺激組相比，在* p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非 常顯著之差異。
65
Fig. 19 在不同時間點給予不同劑量 IL-10 對 IL-17 刺激 A549 細胞
分泌 IL-6 與 IL-8 的影響
在IL-10 抑制作用實驗中將 A549 細胞 starvation 16-18 小時後，
分別做前給予(pre-IL-10)、同時給予(co-IL-10)及之後給予
(late-IL-10) IL-10 的三組。此三組實驗會各別加入 IL-17 來刺激細 胞而IL-10 加入的作用時間及條件陳述請參考 Fig.10 的相同說明。
NC 組為未添加任何刺激物，PC 組為細胞只加 IL-17 (10 ng/ml)刺 激。與PC 組相比，在* p<0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在**
p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著之差異。
66
細胞starvation 16-18 小時後，單獨給予 IL-17 (10 ng/ml)或結合 IL-10 (10 ng/ml)刺激後，在 24 小時內分別於不同時間點收上清液 檢測IL-6 和 IL-8 的分泌量。與 IL-17 組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
67
0 3 6 18 24
0 100 200
IL-17
IL-17+IL-10
*
*
*
*
*
*
hour IL-6 expression (% of control)
Fig. 21 IL-10 在作用的 24 小時內對 IL-17 刺激 A549 細胞表現 IL-6 mRNA 的影響
細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 IL-17 (10 ng/ml)或結合 IL-10(10 ng/ml)刺激後，在 24 小時內分別於不同時間點收集細胞 觀察IL-6 mRNA 的表現量。與 IL-17 組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
68 IL-8 expression (% of control)
Fig. 22 IL-10 在作用的 24 小時內對 IL-17 刺激 A549 細胞表現 IL-8 mRNA 的影響。
細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 IL-17 (10 ng/ml)或結合 IL-10(10 ng/ml)刺激後，在 24 小時內分別於不同時間點收集細胞 觀察IL-8 mRNA 的表現量。與 IL-17 組相比，在* p<0.05 時表示 兩組間有顯著差異，而在** p<0.001 時則代表兩組間有非常顯著 之差異。
69
Fig. 23 IL-10 調控 IL-17 刺激 A549 細胞中 p-ERKs 蛋白的表現量。
細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 IL-17 (10 ng/ml)或結合 IL-10 (10 ng/ml)刺激後，分別在不同時間點收集細胞以西方點墨法
細胞 starvation 16-18 小時後，單獨給予 IL-17 (10 ng/ml)或結合 IL-10 (10 ng/ml)刺激後，分別在不同時間點收集細胞以西方點墨法