Introduction  …

1‐1  Introduction 

With the rapidly evolving knowledge in the biomedical field of today there is increasing  demand for materials that can meet the needs of new applications. One specific application  is  depot  systems  for  sustained  drug  delivery.  Depot  systems  hold  the  benefit  of  providing  sustained  drug  release  over  long  times,  as  well  as  being  able  to  provide  local  therapeutic  effect. There are several challenges in the design of materials to be used in such systems. The  materials  should  allow  for  high  loading  of  hydrophobic  drugs  and  control  of  the  release  process¹. In the case of implantable depot systems the administration should be easy, such as  injectable in vivo gelling formulations. Furthermore, the materials should be biocompatible  in their given application. Obviously, the materials used should be non‐toxic, and non‐irritant  for  transdermal  applications.  For  implantable  devices  the  mechanical  properties  of  the  device are of great importance as well, it has been stated that “the mechanical property of  the interface between an implant and its surrounding tissues is critical for the host response  and the performance of the device².” 

Chitosan  and  alginate  are  two  natural  polymers  that  are  biodegradable,  biocompatible,  non‐toxicity, and mucoadhesive³. Because of those desirable properties they are commonly  used in biomedical applications as drug delivery systems, tissue engineered scaffold, and in  food industry as stabilizers, thickeners and gelling agents^3‐7. Amphiphilic chemically‐modified 

chitosan,  named  carboxymethyl‐hexanoyl  chitosan  (CHC),  has  been  synthesized  in  an  aqueous  system  without  the  aid  of  surfactants,  organic  solvents,  emulsion  phases,  or  template  cores,  to  form  a  hollow  nanocapsule^{6,  7}.  The  CHC  has  excellent  encapsulating  efficient for hydrophobic drugs due to its self‐assembly properties. The hydrophobic regions  interact  in  aqueous  solution  and  should  promote  the  incorporation  of  hydrophobic  drugs. 

Alginate  is  a  linear  block  copolymer  by  linear  and  anionic  polysaccharides  composed  of  homopolymeric  blocks  of  α‐ ‐guluronate  (G)  and  β‐ ‐mannuronate  (M)  residues^{3,  8,  9}.  The  relative number of M‐ or G‐blocks depends on the origin of alginate. Alginate polymers have  not  been  found  to  accumulate  in  any  major  organs  and  show  evidence  of  in  vivo  degradation⁸.  The  most  important  property  of  alginates  is  their  ability  to  form  gels  by  interaction with divalent cations such as Ca²⁺. The gelation and cross‐linking of the polymers  are  mainly  achieved  by  interaction  between  the  carboxyl  groups  and  the  divalent  cations,  and the stacking of these G‐blocks to form the characteristic egg‐box structure^3, 10‐12. Besides,  sodium alginate (SAL) also has the ability to form gels by the exchange of sodium ions from  the G‐blocks with the divalent cations. 

In  recent  therapeutic  applications,  an  important  challenge  is  to  overcome  the  problem  with  achieving  high  loading  of  hydrophobic  drugs  and  to  control  the  release  process¹.  The  advantage of amphiphilic copolymers or modified polymer micelles for drug delivery systems  is based on the characteristic that such polymer materials tend to form micelles, having size 

on  the  nanoscale  and  the  ability  to  encapsulate  and  release  hydrophobic  compounds.  In  addition,  such  drug  carriers  can  commonly  be  designed  to  be  biocompatible  and/or  biodegradable^13‐15.  Amphiphilic  copolymers  or  modified  polymers  have  been  found  to  self‐assemble into nanoscale micelle‐like structures, defined by their core‐shell architecture  in aqueous solution^15‐17. The incorporation of hydrophobic drugs into such polymer micelle  nanoparticles  provides  a  feasible  method  to  overcome  the  poor  solubility  of  such  drugs  in  aqueous  solution  and  is  applicable  to  numerous  applications,  for  example,  hydrogel  based  drug  delivery  systems.  Gou  et  al.  presented  the  idea  to  combine  a  nanoscale  carrier  and  hydrogel  into  a  composite  dual  structure  delivery  system  for  hydrophobic  drug  release¹⁸,  inspired  by  similar  reports  about  micro‐  or  nano‐particles  in  thermo‐sensitive  hydrogel  composite drug delivery systems^19, 20. 

Particulate  additives,  which  are  dispersed  in  a  gel  network,  can  have  drastic  impact  on  the rheological properties, depending on additive concentration, modulus and the extent of  addition‐gel matrix interaction^21‐23. Taking the attributes of the fillers and the gel matrix into  consideration, two ultimate cases can be discriminated: (1) No interaction between the gel  matrix  and  the  dispersed  particles;  this  result  causes  a  decrease  in  gel  modulus  with  increasing  polymer  volume  fraction.  (2)  A  strong  interaction  between  the  fillers  and  the  matrix;  this  result  causes  an  increase  in  modulus  of  the  gel  with  the  increasing  polymer  volume fraction if the filler material is stiffer than the gel matrix²⁴. If the fillers have a much 

low particle size comparing with gel matrix and no interaction with the matrix, there will be  no  effect  on  rheological  properties.  This  phenomenon  was  presented  on  an  alginate  gel  matrix with glycerol or low molecular weight dextran as fillers which showed an increasing  viscosity in gel liquid phase but no effect in gel rheological properties^25, 26. In addition, if the  fillers  are  small  but  interact  strongly  with  the  matrix,  they  may  act  crosslinking,  thus  increasing  the  modulus.  As  an  example,  it  has  been  shown  that  the  addition  of  a  small  amount of cellulose nanofibers can cause a significant increase of mechanical properties for  composite gels²⁷ as compared to the reference sample^28, 29. 

The rheological properties of hydrogel systems are of great importance. For applications,  the  rheological  properties  in  many  cases  determine  the  performance  of  a  device,  for  implantable  devices  it  has  actually  been  proposed  that  “the  mechanical  property  of  the  interface between an implant and its surrounding tissues is critical for the host response and  the performance of the device”.² In addition, the rheological properties of hydrogel samples  provide important information on the structure and interactions present in the samples. 

In  this  study,  amphiphilic  chitosan  was  successfully  synthesized  in  this  lab  and  used  as  hydrophobic drug carrier. The composite gels of sodium alginate and micelle‐like amphiphilic  carboxymethyl‐hexanoyl  chitosan  nanoparticles  were  prepared  in  various  compositions,  varying the SAL and CHC content, the amount of glycerol in the gel forming solution and the  amount  of  calcium  chloride  in  the  gelation  media.  The  composite  gels  were  characterized 

with  regard  to  a  number  of  properties  such  as;  gelation  time,  equilibrium  swelling,  rheological properties and self‐healing, protection of drug versus degradation and release of  hydrophobic  drugs.  The  dependences  of  the  gel  properties  on  the  compositions  of  the  hydrogels were then discussed. 

1‐2  Literature review 

1‐2‐1  Introduction of alginate based hydrogels  1‐2‐1‐1  Formation of alginate hydrogels 

Alginate is a linear block copolymer by linear and anionic polysaccharides composed of  homopolymeric blocks of α‐ ‐guluronate (G) and β‐ ‐mannuronate (M) residues as shown in  Fig.  1‐1.  The  gelation  of  alginate  can  be  carried  out  under  an  extremely  mild  environment  and  uses  non‐toxic  reactants.  Alginate  based  hydrogels  can  be  prepared  by  extruding  a  solution  of  sodium  alginate  containing  the  desired  protein,  as  droplets,  in  to  a  divalent  cross‐linking  solution  such  as  Ca²⁺,  Sr²⁺,  or  Ba²⁺.  Monovalent  cations  and  Mg²⁺  ions  do  not  induce  gelation³⁰.  The  gelation  and  cross‐linking  of  the  polymers  are  mainly  achieved  by  interaction between the carboxyl groups and the divalent cations, and the stacking of these  G‐blocks  to  form  the  characteristic  egg‐box  structure.  The  divalent  cations  bind  to  the  α‐ ‐guluronate (G) acid blocks in a highly cooperative manner and the size of the cooperative  unit is more than 20 monomers³¹. Each alginate chain dimerizes to form junctions with many  other chains and as a result gel networks are formed. 

Fig. 1‐1  The structure of of α‐ ‐guluronate (G) and β‐ ‐mannuronate (M) residues³⁰.   

Fig. 1‐2  Schematic representation of association of polyguluronate sequences by chelation  of Ca²⁺: “egg‐box model”. Below: Section; oxygen atoms coordinated to calcium are shown as  filled circles³⁰. 

1‐2‐1‐2  Previous investigations of alginate based hydrogels

The  functional  and  physical  properties  of  cation  crosslinked  alginate  hydrogels  are  dependent  on  the  composition,  sequential  structure,  and  molecular  size  of  polymers.  The  flexibility  of  the  alginate  polymers  in  solution  increases  in  the  other  MG MM GG³².  Hydrogels with the lowest shrinkage, highest mechanical strength, highest porosity, and best  stability  towards  monovalent  cations  are  made  from  alginate  with  an  α‐ ‐guluronate  acid  content  greater  than  70  %  and  an  average  length  of  the  α‐ ‐guluronate  acid  blocks  higher  than  15.  The  gel  strength  is  independent  of  the  molecular  weight³³.  However,  for  lower  molecular weight alginates, there is a certain critical molecular weight below which the gel  forming  properties  of  alginates  are  reduced³⁴.  There  are  many  factors  involved  in  determining the successful application of polymers as drug delivery carriers in humans, with  polymer  biocompatibility  or/and  immunogenicity  being  two  of  the  more  important  issues. 

There  are  numerous  reports  addressing  the  fibrotic  reaction  of  implanted  alginates.  Most  authors  agree  that  the  chemical  composition  and  the  mitogenic  contaminants  found  in  alginates  are  the  two  main  contributors  to  alginate  immunogenicity^35‐37.  The  bioadhesive  property which could serve as a potential advantage in mucosal drug delivery is one of the  biological  properties  for  alginate.  The  term  bioadhesion  can  be  generally  defined  as  the  adhesion or contact between two surfaces, with one being a biological substratum³⁸. Peppas  and  colleagues  believed  that  mucoadhesion  is  achieved  by  chain  penetration  across  a 

polymer‐mucosa  interface³⁹.  Mucoadhesive  drug  delivery  systems  work  by  increasing  the  drug  residence  time  at  the  site  of  activity  or  resorption.  This  mucoadhesive  feature  of  alginate may aid in its utility as a potential delivery vehicle for drugs to mucosal tissues. The  adherence  of  these  microbeads  to  the  mucosal  tissues  localizes  the  drug  and  delays  the  protein  transit  time,  therefor  potentially  improving  the  overall  drug  effectiveness  and  bioavailability.  By  selection  of  the  appropriate  alginate  type,  gelation  conditions,  added  excipients,  and  coating  agents,  matrices  of  various  morphologies,  pore  size,  water  content  and dehydration rates can be fabricated. 

1‐2‐2  Introduction of particulate carriers based on modified chitosan

1‐2‐2‐1  Introduction of chitosan properties 

Chitosan  is  a  linear  copolymer  polysaccharide  consisting  of  β(1‐4)‐linked  2‐amino‐2‐deoxy‐ ‐glucose  ( ‐glucosamine)  and  2‐acetamido‐2‐deoxy‐ ‐glucose  (N‐acetyl‐ ‐glucosamine) units as shown in Fig. 1‐3. The term chitosan is used to describe a  series  of  polymers  of  different  degrees  of  deacetylation  (DD),  defined  in  terms  of  the  percentage  of  primary  amino  groups  in  the  polymer  backbone,  from  chitin  by  alkaline  hydrolysis  at  high  temperature  and  average  molecular  weights  (MW).  The  DD  of  typical  commercial chitosan is usually between 70 % and 95 %, and the MW between 10 and 1000  kDa.  The  properties,  biodegradability  and  biological  role  of  chitosan  are  frequently 

dependent  on  the  relative  proportions  of  N‐acetyl‐ ‐glucosamine  and  ‐glucosamine  residues. 

Chitosan has been widely used in food industry and biomedical filed by their excellent  biological  properties  such  as  biocompatibility,  biodegradability,  nontoxicity,  and  mucoadhesiveness. Chitosan is metabolized by certain human enzymes, especially lysozyme,  and  is  considered  biodegradable⁴⁰.  However,  the  poor  soluble  character  in  water  and  common  organic  solvent  of  chitosan  has  been  limited  its  wide‐spread  utilization.  Hence,  many  researchers  utilize  an  important  property  of  chitosan  that  can  undergo  chemical  modification  very  easily.  The  presence  of  free  amino  groups  in  the  backbone  of  chitosan  contributes  to  increase  the  reactivity  of  the  polymer.  Chitosan  can  therefore  be  readily  modified by reactions at the amino groups. This property provides an opportunity to improve  the  chemical  and  mechanical  properties  of  chitosan  for  the  purpose  of  wide  biological  applications.  Consequently,  hydrophilically,  hydrophobically,  and  amphiphilically  modified  chitosan  derivatives  are  investigated  to  improve  the  solubility.  Besides,  several  covalent  modifications are also studied to improve the drug delivery properties of chitosan. By simple  covalent modifications of the polymer such as thiolated chitosan and trimethylated chitosan,  its  physicochemical  properties  can  be  changed  and  can  be  made  suitable  for  further  biomedical applications such as oral drug delivery system. 

Fig. 1‐3  The chemical structure of chitosan³.   

1‐2‐2‐2  Amphiphilic chemically‐modified chitosan as drug carrier 

In our laboratory, a new type of chitosan hollow structure, i.e., carboxymethyl‐hexanoyl  chitosan  (CHC)  as  shown  in  Fig.  1‐4,  which  was  modified  first  by  hydrophilic  carboxymethylation to increase the flexibility of chitosan molecular chains in water followed  by  hydrophobic  modification  with  hexanoyl  groups  to  add  amphiphilic  character,  was  employed  to  study  its  self‐aggregation  behavior  to  form  nanocapsule  in  aqueous  solution  and nanostructural evolution. The stability of nancapsules and formation mechanism of the  CHC  macromolecules  were  explored  through  the  use  of  critical  aggregation  concentration  (CAC),  zeta  potential,  electron  microscopy,  and  dynamic  light  scatter  (DLS).  By  taking  the  advantage  of  self‐aggregation  nature,  the  CHC  was  employed  to  encapsulate  doxorubicin  (DOX),  an  anticancer  agent  of  broad  spectrum  with  reasonable  therapeutic  index  and  intriguing  biological  and  physicochemical  actions⁴¹,  to  further  understand  its  loading  efficiency  and  release  behavior.  Liu  et  al.  found  that  the  amphiphilic  chitosan  (CHC)  was 

employed  to  self‐assemble  into  a  hollow  nanocapsule  in  an  aqueous  environment.  The  self‐assembly behavior of the CHC is fundamentally determined as an interplay between the  hydrophobic interaction and the variation of the zeta potential upon hexanoyl substitution,  which further influenced the nanostructural evolution of the nanocapsules. Higher hexanoyl  substitution  promoted  larger  nanocapsules,  ca.  200  nm  in  diameter,  while  a  reduced  zeta  potential was correspondingly detected, and vice versa, forming smaller nanocapsules, ca. 20  nm  in  diameter.  The  self‐assemble  mechanism,  together  with  the  corresponding  nanostructural  stability,  of  this  unique  CHC  nanocapsule  was  also  proposed  in  terms  of  intermolecular  interaction  and  thermodynamic  reason.  By  taking  the  advantage  of  the  self‐assemble (or self‐aggregation) capability, the CHC was employed for drug encapsulation,  i.e.,  doxorubicin,  an  anticancer  molecule;  we  found  in  this  preliminary  evaluation  that  it  reached an efficiency of 46.8 %, and a corresponding drug release from the nanocapsules for  a time period exceeded 7 days can be achieved in vitro. 

Fig. 1‐4  Molecular structure of carboxymethyl‐hexanoyl chitosan (CHC)⁶.